蛻膜組織中調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的表達(dá)與妊娠期免疫耐受的關(guān)系

張一丹

生殖免疫學(xué)說認(rèn)為妊娠的本質(zhì)可視為成功的半同種移植現(xiàn)象，而孕婦對胚胎半同種抗原的免疫耐受情況與妊娠的成功密切相關(guān)［1］。妊娠期免疫耐受的調(diào)節(jié)涉及復(fù)雜的免疫信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，若某一環(huán)節(jié)發(fā)生障礙均可導(dǎo)致妊娠失敗。大量研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞可通過調(diào)控機(jī)體傳統(tǒng)T 細(xì)胞的活化和T 細(xì)胞的免疫反應(yīng)等反應(yīng)過程進(jìn)而主動獲得和維持自身耐受［2-3］。然而具體分子機(jī)制仍尚未完成闡明。近來研究發(fā)現(xiàn)，Treg 細(xì)胞/輔助性T 細(xì)胞17（Th17）的表達(dá)失衡及巨噬細(xì)胞亞群功能的改變可能與妊娠免疫耐受密切相關(guān)。但現(xiàn)階段，妊娠婦女孕早期Treg 細(xì)胞的功能改變是否與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（URSA）有關(guān)仍需更多證據(jù)予以證明?；诖吮尘?，本課題擬以URSA 患者作為研究對象，通過觀察對比蛻膜組織Treg 細(xì)胞的表達(dá)情況，以深入闡明Treg 細(xì)胞的表達(dá)與妊娠期免疫耐受的關(guān)系，從而為后續(xù)更進(jìn)一步的臨床研究提供新線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 對深圳市人民醫(yī)院2019 年5 月至2020 年10 月收治的URSA 患者80 例作為URSA組，50 例正常早孕人工流產(chǎn)終止妊娠的婦女作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科分會相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［4］；（2）對照組患者均于深圳市人民醫(yī)院行終止妊娠手術(shù)；（3）孕婦無先天性免疫性疾?。唬?）孕婦及其家庭自愿參加本次實驗。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）2組患者均排除有染色體、內(nèi)分泌異常者；（2）因外界因素導(dǎo)致流產(chǎn)者；（3）合并有感染者；（4）患者不同意簽署知情同意書者；本次研究經(jīng)院倫理委員會批準(zhǔn)。2 組患者年齡、體重指數(shù)（body indet，BMI）、孕次等基線資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 URSA 組與對照組妊娠婦女一般資料比較

1.2 方法 所有患者均由同一組醫(yī)師進(jìn)行妊娠終止手術(shù)，并在術(shù)中收集2 組患者蛻膜組織，采用緩沖液（LP7）沖洗，除去血凝塊后進(jìn)行過濾，過濾完畢后溶于IMDM 培養(yǎng)液制作成細(xì)胞懸液。采用免疫磁珠分離法（MACS）分離純化巨噬細(xì)胞，操作按照試劑說明書進(jìn)行，試劑購置于：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；采用流式細(xì)胞術(shù)檢查Th17 和CD4+CD25+T 細(xì)胞水平，儀器購置于廣州朗日生物技術(shù)有限公司；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測白細(xì)胞介素-17（IL-17）、白細(xì)胞介素-23（IL-23）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、γ 干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、凝血酶敏感蛋白1（TSP1）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、巨噬細(xì)胞移動抑制因子（MIF）水平，試劑盒購置于艾維可生物科技有限公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。正態(tài)分布的計量資料以±s表示，采用t檢驗。分類變量采用χ2檢驗或Fisher 檢測。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛻膜組織中Treg 細(xì)胞比例表達(dá) URSA 組Th17 細(xì)胞和CD4+CD25-表達(dá)水平均顯著高于對照組（P＜0.05），而CD4+CD25bringht、CD4+CD25bringht/CD4+表達(dá)水平顯著低于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 URSA 組與對照組妊娠婦女蛻膜組織中Treg 細(xì)胞比例表達(dá)（± s）

表2 URSA 組與對照組妊娠婦女蛻膜組織中Treg 細(xì)胞比例表達(dá)（± s）

注：URSA 為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，Th17 為輔助性T 細(xì)胞17

組別CD4+CD25bringht CD4+CD25-CD4+CD25bringht/CD4+Th17 細(xì)胞（%）URSA 組（n=80）對照組（n=50）t 值P 值0.59±0.13 9.72±1.21 5.26±1.01 7.35±0.27 5.87±0.96 10.64＜0.01 1.24±0.23 18.24＜0.01 7.02±0.81 15.23＜0.01 12.87±2.57 19.99＜0.01

2.2 蛻膜組織中巨噬細(xì)胞表面分子表達(dá) URSA組CD36 表達(dá)水平均顯著高于對照組（P＜0.05），而CD47、TSP1 表達(dá)水平顯著低于對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 URSA 組與對照組妊娠婦女蛻膜組織中巨噬細(xì)胞表面分子表達(dá)（± s）

表3 URSA 組與對照組妊娠婦女蛻膜組織中巨噬細(xì)胞表面分子表達(dá)（± s）

注：URSA 為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，TSP1 為凝血酶敏感1

組別URSA 組（n=80）對照組（n=50）t 值P 值TSP1 73.54±3.54 88.51±6.55 14.86＜0.01 CD36 21.85±6.57 10.57±2.54 13.79＜0.01 CD47 96.57±10.24 99.63±5.63 2.19 0.03

2.3 Treg 細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)性分析 Treg 細(xì)胞的表達(dá)與IL-17（r=0.54，P＜0.05）、IL-23（r=0.42，P＜0.05）、IL-10（r=-0.47，P＜0.05）、IFN-γ（r=0.51，P＜0.05）、IL-6（r=0.49，P＜0.05）均呈現(xiàn)相關(guān)性。見表4。

表4 Treg 細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)性分析

2.4 蛻膜組織中相關(guān)因子表達(dá)比較 URSA 組IL-17、IL-23、IFN-γ、IL-6 表達(dá)水平均顯著高于對照組（P＜0.05），IL-10 顯 著 低 于 對 照 組（P＜0.05），見表5。

表5 URSA 組與對照組妊娠婦女蛻膜組織中相關(guān)因子表達(dá)比較（± s）

表5 URSA 組與對照組妊娠婦女蛻膜組織中相關(guān)因子表達(dá)比較（± s）

注：URSA 為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，IL-17 為白細(xì)胞介素-17，IL-23 為白細(xì)胞介素-23，IL-10 為白細(xì)胞介素-10，IFN-γ 為γ 干擾素，IL-6 為白細(xì)胞介素-6

組別URSA 組（n=80）對照組（n=50）t 值P 值IL-17 47.63±4.32 19.35±2.72 45.80＜0.01 IL-23 27.01±2.61 24.32±2.15 6.38＜0.01 IL-6 37.85±5.42 19.45±3.57 23.33＜0.01 IL-10 22.02±4.03 27.67±3.97 7.85＜0.01 IFN-γ 58.24±12.21 52.18±11.67 2.83＜0.01

3 討論

URSA 病因復(fù)雜，臨床發(fā)生率約1%～5%。URSA的發(fā)生與免疫排斥密切相關(guān)。既往研究證實，T細(xì)胞在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中扮演尤為重要的角色，其參與調(diào)控免疫防御、監(jiān)視和介導(dǎo)異體移植物免疫排斥反應(yīng)等多個細(xì)胞功能［6］。研究證實，母胎免疫是唯一與經(jīng)典免疫學(xué)相悖的現(xiàn)象，即妊娠的成功與母親對胎兒維持持續(xù)的免疫耐受有關(guān)［7］。有證據(jù)表明，母親與胎兒并無直接接觸，而妊娠過程中母親接收來自于胎盤的豐富的胎盤抗原和胚胎，使母親天然的耐受型T 細(xì)胞免疫反應(yīng)被激活［8］。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）被發(fā)現(xiàn)在URSA 患者脫模組織中表達(dá)降低，故有觀點認(rèn)為其表達(dá)比例失衡與URSA 發(fā)生密切相關(guān)［9］。然而母親Treg 的表達(dá)失衡及其對妊娠期免疫耐受的調(diào)控機(jī)制仍未完全闡明，故進(jìn)一步開展實驗以明確其在妊娠期免疫耐受中的作用意義重大。

傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，Th1/Th2 的動態(tài)平衡所維持的免疫穩(wěn)態(tài)是調(diào)控妊娠免疫功能的關(guān)鍵因素［10］，而隨著Th17 細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)逐漸有觀點認(rèn)為，Treg/Th17 共同介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Th1/Th2。重要的是研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育的極早期便能檢測到巨噬細(xì)胞系的表達(dá)［11-12］。巨噬細(xì)胞可分為M1 和M2 亞型，其中M1 型可由IFN-γ 或脂多糖（LPS）誘導(dǎo)產(chǎn)生并介導(dǎo)下游炎癥因子的激活，而M2 型由IL-10和IL-4 等抗炎因子介導(dǎo)產(chǎn)生，可激發(fā)吞噬、清除凋亡細(xì)胞，低抗原提呈能力及下調(diào)協(xié)同刺激分子進(jìn)而利于妊娠維持［13］。本實驗結(jié)果顯示，URSA 組婦女CD4+CD25bringht、CD4+CD25-、CD4+CD25bringht/CD4+、Th17 細(xì)胞及CD36、CD47、TSP1 水平顯著低于對照組，表明URSA 患者存在Treg 細(xì)胞、Th17 和巨噬細(xì)胞的表達(dá)紊亂?？紤]母-胎免疫耐受與T 細(xì)胞功能情況密切相關(guān)，Th17/Treg 是除Th1/Th2 外相對獨立的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，母-胎界面蛻膜組織中Treg 細(xì)胞表達(dá)的改變被證實是引發(fā)生殖障礙的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［14］。動物實驗發(fā)現(xiàn)，小鼠Treg 細(xì)胞缺失后可顯著影響胚胎植入成功率［15］。研究發(fā)現(xiàn)，正常機(jī)體中Treg 細(xì)胞數(shù)量表達(dá)處于相對優(yōu)勢地位，Th17 的表達(dá)被抑制，而當(dāng)免疫平衡被打破后Th17 的分泌增加并繼發(fā)表達(dá)下游炎癥因子，使母-胎界面炎癥反應(yīng)水平持續(xù)升高最終導(dǎo)致流產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局發(fā)生。而巨噬細(xì)胞在免疫炎癥激活過程中亦扮演重要角色，其主要分為M1 和M2 亞型，正常機(jī)體中M1/M2 處于動態(tài)平衡狀態(tài)以維持免疫穩(wěn)態(tài)正常，而免疫微環(huán)境改變后巨噬細(xì)胞更多向M1 分化，并促進(jìn)下游促炎因子表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而使局部炎癥水平持續(xù)升高。研究發(fā)現(xiàn)，母-胎界面Treg 細(xì)胞的表達(dá)可調(diào)控巨噬細(xì)胞的活性促進(jìn)其更多向M1 型細(xì)胞轉(zhuǎn)化［16］。故合理推測Treg 細(xì)胞通過調(diào)控母-胎界面Th17 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活性進(jìn)而參與到妊娠免疫耐受中。為進(jìn)一步驗證這一猜想，本研究檢驗了各細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)情況。IL-17 是Th17 的主要效應(yīng)因子，可促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶、趨化因子和炎性細(xì)胞因子表達(dá)并繼發(fā)引起組織破壞和細(xì)胞浸潤等病理改變［17］；IL-23主要由P40 和P19 亞單位組合產(chǎn)生，其能參與調(diào)控CD4+T 細(xì)胞增殖并繼發(fā)引起IL-17 過表達(dá)；IL-10 是機(jī)體重要的抗炎因子，與巨噬細(xì)胞的表達(dá)類型及水平密切相關(guān)；IFN-γ 是具有廣泛免疫調(diào)節(jié)作用的淋巴因子在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中扮演重要角色。IL-6 是機(jī)體經(jīng)典的促炎因子，可激活下游炎性因子的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體炎癥水平持續(xù)上升，研究發(fā)現(xiàn)，IL-6可通過調(diào)控CD4+T 細(xì)胞向Th17 分化進(jìn)而參與免疫炎癥反應(yīng)的激活，同時IL-6 可誘導(dǎo)CD4+T 細(xì)胞向Treg 分化并發(fā)揮免疫逃逸和免疫抑制作用［18］。結(jié)果顯示，URSA 組IL-17、IL-23、IFN-γ、IL-6 表達(dá)顯著低于對照組，且Pearson 檢驗結(jié)果顯示Treg 細(xì)胞的表達(dá)與Th17 細(xì)胞及巨噬細(xì)胞存在顯著相關(guān)性，證實妊娠期婦女蛻膜組織中Treg 細(xì)胞的表達(dá)改變可通過調(diào)節(jié)Th17 細(xì)胞及巨噬細(xì)胞活性，進(jìn)而激活下游炎癥信號并影響妊娠結(jié)局。

綜上所述，妊娠期婦女脫模組織中調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的表達(dá)可參與Th17 細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的分化增值，并激活下游炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而在妊娠期免疫耐受中發(fā)揮重要作用。然而本試驗仍存不足，如樣本量過少，且僅以同期人工終止妊娠婦女作為對照，而未納入健康群體進(jìn)行對比，故今后仍需進(jìn)一步設(shè)置長周期大樣本試驗予以論證。