基于Illumina MiSeq高通量測序技術解析四川麩醋發(fā)酵過程中微生物菌群結構

張雅琳，劉廷銳，朱文優(yōu)，陳 靜，劉 燕，許 慧

（宜賓學院農(nóng)林與食品工程學部 固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室 四川宜賓 644000）

食醋是我國傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，在西南地區(qū)主要以四川麩醋最為聞名。麩醋的生產(chǎn)主要以生麥麩為原料，以中草藥醋曲為發(fā)酵劑，經(jīng)“糖化、酒化和醋化”同池發(fā)酵而成，具有降血壓、降膽固醇、抗氧化、護肝和防嘔吐等功效。

四川麩醋采用傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵方式，發(fā)酵菌群主要來源于藥曲。四川麩醋獨特風味和食用安全性與糖化劑藥曲有必然聯(lián)系。藥曲為食醋發(fā)酵進程提供獨特酶系和發(fā)酵菌群，藥曲還能抑制發(fā)酵環(huán)境中部分腐敗菌。發(fā)酵菌群是食醋品質(zhì)的保障。在以往研究中，研究人員較多致力于食醋發(fā)酵過程中功能菌群的研究，發(fā)現(xiàn)主要有乳酸菌、酵母、霉菌和醋酸菌等賦予食醋營養(yǎng)成分、功能成分以及獨特的風味物質(zhì)。劉陽等[1]從保寧醋中分離出發(fā)酵乳酸桿菌（Lactobacillus femertum），通過產(chǎn)酸率、耐酸以及胞外多糖測定等試驗驗證發(fā)酵乳酸桿菌能提高食醋酸度；焦玉雙[2]從山西老陳醋大曲中分離出有較強產(chǎn)酸能力的食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria） 和戊糖片球菌（Pediococcus pentosus）。乳酸菌在食醋發(fā)酵過程中主要產(chǎn)有機酸（乳酸），乳酸能減輕醋酸刺激氣味，改善醋的口感，能和醇類物質(zhì)合成酯類香氣物質(zhì)，并且通過降低發(fā)酵環(huán)境pH 值來抑制雜菌的生長；乳酸菌還能產(chǎn)生蛋白酶，分解蛋白質(zhì)生成多肽和氨基酸[3]。鐘正丹等[4]發(fā)現(xiàn)異常威克漢姆酵母（Wickerhamyces anomalus）和口津假絲酵母（Candida melibiosica）是保寧醋中產(chǎn)香較強的酵母。酵母主要來源于藥曲中，在發(fā)酵過程中，酵母主要發(fā)酵糖類產(chǎn)生乙醇，還產(chǎn)生食醋的部分風味物質(zhì)[5]。此外，Nie 等[6]還在山西老醋中檢測出葡萄球菌屬（Staphylococcus spp.）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora spp.）、芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus spp.）、魏斯氏菌屬（Weissella spp.）等。王宗敏[7]在鎮(zhèn)江香醋中檢測出乳球菌屬（Lactococcus spp.）、葡糖醋桿菌屬（Gluconacetobacter spp.）、曲酶屬（Aspergillus spp.）和隱球酵母屬（Cryptococcus spp.）?？梢?，食醋傳統(tǒng)發(fā)酵工藝造就復雜的微生物群落結構，而微生物群落的多樣性和演替是食醋獨特風味形成的關鍵點。四川麩醋的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝采用開放式多菌種混合發(fā)酵模式，發(fā)酵環(huán)境中微生物結構復雜，代謝過程此消彼長。此外，因微生物檢測技術的局限性，研究者對麩醋發(fā)酵過程中微生物菌群結構的研究有一定難度。

本文采用高通量測序技術監(jiān)控四川麩醋生產(chǎn)過程中微生物菌群結構變化及其演替規(guī)律，分析細菌和真菌對麩醋風味和食用安全性的貢獻，并從不同水平下錨定麩醋發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌群，以期對后期提高四川麩醋質(zhì)量，完善傳統(tǒng)工藝和調(diào)控發(fā)酵環(huán)境中微生態(tài)結構提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 原材料

四川麩醋醋醅取自四川省宜賓市思坡醋業(yè)有限責任公司。

1.2 設備與儀器

5810R 臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；MLS-3780 高壓蒸汽滅菌鍋，杭州亞旭生物科技有限公司；QT-2A 旋渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司；ND-2000C 微量紫外分光光度計，美國Nano Drop 公司；瓊脂糖凝膠電泳儀，美國Bio-Rad；DYCZ-21 型電泳槽，北京市六一儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的采集 樣品的采集：發(fā)酵第1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25 和27 天采樣。在四川麩醋發(fā)酵過程中每個時間點分別對醋醅的上層、中層和下層的中間以及4 周進行取樣，進行混和均勻作為1 個醋醅樣品，隨后使用無菌密封袋包裝，后置于-80 ℃冰箱中保藏待測。

1.3.2 DNA 的提取 取1.3.1 節(jié)中待測樣品，參照E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 提取試劑盒中的方法提取四川麩醋醋醅樣品中宏基因組DNA，將提取的DNA 用乙醇進行沉淀，在260 nm和280 nm 的波長下使用微量紫外分光光度計測定DNA 的吸光度。

1.3.3 PCR 擴增和測序 分別使用V43NDF 和Euk_V4_R 作為真菌18S rRNA 的引物，和515F、805R 作為細菌16S rRNA 的引物。分別對細菌和真菌引物進行PCR 擴增，16S rRNA 基因擴增條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性3 min，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸3 min（25 個循環(huán)）。18S rRNA 基因擴增條件：95 ℃預變性7 min，95 ℃變性1 min，45℃退火30 s，72 ℃延伸90 s（33 個循環(huán)）。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 對樣品所測高通量數(shù)據(jù)通過FASTX-Toolkits 的收集命令行工具（http：//hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/）修剪引物，條形碼和適配器[8-10]，接著過濾序列數(shù)據(jù)。采用Mothur v1.30.0[11]將有效序列聚集到截止水平為3%的OTU中。單個樣品中的微生物多樣性用QIIME 評估。計算Shannon 和Simpson 多樣性指數(shù)，Chao 1 和ACE 豐富度指數(shù)和Good's 覆蓋度以評估α 多樣性[12]。

2 結果與分析

2.1 四川麩醋發(fā)酵過程中微生物群落α-多樣性分析

四川麩醋發(fā)酵過程中微生物群落多樣性和豐度變化如表1所示。對醋醅中細菌群落多樣性和豐度進行評價，結果表明，在發(fā)酵第1 天時，醋醅中細菌群落多樣性和豐度最高，而在第23 天時，細菌菌群多樣性最低；在第11 天時，細菌菌群豐度最低。對醋醅中的真菌群落多樣性和豐度進行評價，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵第1 天時，真菌菌群豐度最高，而在第23 天時，真菌菌群多樣性最高。表1結果所示，發(fā)酵環(huán)境中的細菌群落的多樣性和豐度是隨著發(fā)酵時間在降低，主要原因可能是發(fā)酵環(huán)境中酒精含量上升和酸度下降，抑制了大量細菌的生長。而真菌群落多樣性在發(fā)酵第23 天時最高，主要原因可能是真菌和細菌細胞壁結構之間的差異性，真菌細胞壁對外界環(huán)境的變化具有一定的抵抗作用；其次可能是發(fā)酵環(huán)境中的大分子物質(zhì)被分解成小分子物質(zhì)后激活了部分真菌的生長代謝活動。真菌群落豐度隨著時間在降低，在第27天時，真菌群落豐度達到最低值，可能原因是在接近發(fā)酵結束時，發(fā)酵環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)含量在下降，導致大部分的真菌的自身增長代謝降低；其次可能是因為發(fā)酵環(huán)境中的部分真菌群落處于消亡期。

表1 四川麩醋發(fā)酵過程中微生物群落豐度和多樣性Table 1 Microbial community abundance and diversity during fermentation of Sichuan bran vinegar

值得注意的是，四川麩醋發(fā)酵過程中，主要依賴于來自于藥曲中的微生物菌群，通過“糖化、酒化和醋化”3 個過程，而微生物群落的動態(tài)變化說明微生物一直處于和環(huán)境的平衡和適應中，可見麩醋發(fā)酵過程中，微生態(tài)結構動態(tài)變化和復雜的代謝過程是形成麩醋特定滋味的原因。

2.2 四川麩醋發(fā)酵過程中細菌群落在門水平的結構分布以及動態(tài)變化

在門的水平對四川麩醋醋醅中細菌群落結構進行分析，結果如圖1所示。結果表明，在麩醋發(fā)酵過程中，厚壁菌門（Firmicutes）是優(yōu)勢菌門，在第1 天時，厚壁菌門在細菌中占比是23.73%，在第23 天時，厚壁菌門在細菌中占比達到最大值98.88%。此外，在第1 天時，醋醅中還檢測出變形菌門（Proteobacteria）和藍藻門（Cyanobacteria），在細菌中占比分別為32.25%和42.26%。隨后，隨著優(yōu)勢菌門厚壁菌門的增加，變形菌門和藍藻門在細菌中占比下降，在第23 天時，變形菌門和藍藻門的占比達到最低值，分別為0.92%和0.01%。另外在醋醅中還有少量的放線菌門（Actinobacteria）被檢測出。

圖1 四川麩醋發(fā)酵過程中細菌群落在門水平的分布Fig.1 Relative abundance of bacteria community proportions at phylum in Sichuan bran vinegar

2.3 四川麩醋發(fā)酵過程中細菌群落在種水平的結構分布以及動態(tài)變化

在種的水平對四川麩醋醋醅中細菌結構進行分析，結果如圖2所示。結果表明，在麩醋發(fā)酵過程中，優(yōu)勢菌種是耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans） 和巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）。在第1 天時，耐酸乳桿菌在細菌中占比為0.62%，耐酸乳桿菌占比隨著時間增加，在第7 天時，耐酸乳桿菌占比達到最大值54.47%。耐酸乳桿菌有較強的產(chǎn)乳酸和乙酸能力，但不能代謝氨基酸，對乙醇有一定的耐受性，能利用葡萄糖、蘋果酸和丙酮酸等作為生長的營養(yǎng)物質(zhì)[13]。在四川麩醋醋醅中檢測出食淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylovorus），食淀粉乳桿菌在細菌中占比隨著發(fā)酵時間先升高后降低，在發(fā)酵第3 天時，其在細菌中占比達最大值38.03%，在發(fā)酵第27 天時，食淀粉乳桿菌在細菌中占比僅為0.01%。食淀粉乳桿菌屬于嗜酸乳桿菌屬（Lactobacillus acidophilus spp.），是人腸道中常見的重要的有益菌群，能產(chǎn)生過氧化氫、有機酸、細菌素和多肽等物質(zhì)來抑制病原微生物的生長，有研究學者發(fā)現(xiàn)，食淀粉乳桿菌的抗菌能力與其細胞表面的存在的一種S-層蛋白相關[14]。巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）和歐洲科馬加泰桿菌（Komagataeibacter europaeus）是生產(chǎn)食醋過程中常見的菌種。在醋酸發(fā)酵階段，巴氏醋桿菌主要產(chǎn)以乙酸為主體的有機酸，將酒精發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成乙酸和乳酸等酸味物質(zhì)[15]；而歐洲科馬加泰桿菌也具有強大的氧化乙醇的功能[16]。巴氏醋桿菌是食醋發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌群，在發(fā)酵環(huán)境中巴氏醋桿菌占比隨著時間增加，但是在發(fā)酵第23 天時占比下降，在發(fā)酵第25天時，巴氏醋桿菌在細菌中占比達到最大值84.54%，此時發(fā)酵環(huán)境中的巴氏醋桿菌是優(yōu)勢菌群；在發(fā)酵結束時，巴氏醋桿菌在細菌中占比為84.04%，巴氏醋桿菌主要是將有機酸轉(zhuǎn)化為乙酸，是食醋發(fā)酵過程中乙酸的主要來源。而在第23 天時，醋醅中歐洲科馬加泰桿菌在細菌中占比為0.00%。此前研究學者從水中分離出布氏假單胞菌（Pseudomonas brenneri），發(fā)現(xiàn)其沒有發(fā)酵能力[17]，布氏假單胞菌在發(fā)酵環(huán)境中整體呈現(xiàn)上升趨勢，在發(fā)酵第27 天時，在細菌中達到最大占比1.87%。氧化葡糖桿菌（Gluconobacter oxydans）在細菌中的占比隨著時間先升高后降低，在發(fā)酵第3 天時，在細菌中占比達到最大值1.95%，在第15天后，氧化葡糖桿菌在發(fā)酵環(huán)境中占比降至0%。氧化葡糖桿菌有較好的產(chǎn)酸和耐酸能力，但是研究發(fā)現(xiàn)其并沒有轉(zhuǎn)化乙酸的能力，甚至代謝能力會受環(huán)境中乙醇含量的影響[18]，這也可能是后期在醋醅中沒有檢測到氧化葡糖桿菌的原因。在醋醅中，還發(fā)現(xiàn)了對麩醋風味有貢獻的干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），常被制成益生菌制劑，并且在食醋制作過程中有顯著產(chǎn)酸和產(chǎn)香的能力[19]。

圖2 四川麩醋發(fā)酵過程中細菌群落在種水平的分布Fig.2 Relative abundance of bacteria community proportions at species in Sichuan bran vinegar

在種的水平對醋醅中細菌結構進行分析發(fā)現(xiàn)，在食醋制作過程中，醋醅中主要是以乳酸桿菌和巴士醋桿菌為主的微生態(tài)結構。在糖化階段和酒精發(fā)酵階段，乳酸桿菌主要是將大分子物質(zhì)分解后產(chǎn)生乳酸和風味物質(zhì)。在醋酸發(fā)酵階段，主要是醋酸菌將酒精發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成乙酸、乳酸以及其它有機酸等酸味物質(zhì)。可見，麩醋的品質(zhì)來源不僅僅依賴于單一的菌群，而是微生態(tài)的動態(tài)演替。

2.4 四川麩醋發(fā)酵過程中真菌群落在門水平的結構分布以及動態(tài)變化

在門的水平對四川麩醋醋醅中真菌菌群結構進行分析，結果如圖3所示。結果表明，在麩醋發(fā)酵過程中，主要是子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota），兩個門在真菌菌群中總占比始終在98%以上。其中子囊菌門是優(yōu)勢菌門，在第3天時，子囊菌門在真菌中占比達到最大值99.86%，在發(fā)酵第27 天時，子囊菌門在真菌中占比降低至64.23%。此外，擔子菌門在發(fā)酵第1 天時，在真菌菌群中占比6.29%，在發(fā)酵前17 天，擔子菌門的占比有上下的波動，在第17 天后，擔子菌門在真菌菌群中占比逐漸增加，在發(fā)酵第27 天時，擔子菌門占比達到最大值35.55%。在四川麩醋醋醅中還檢測出壺菌門（Chytridiomycota）、毛霉門（Mucoromycota）和被孢霉門（Mortierellomycota）。

圖3 四川麩醋發(fā)酵過程中真菌群落在門水平的分布Fig.3 Relative abundance of fungal community proportions at phylum in Sichuan bran vinegar

2.5 四川麩醋發(fā)酵過程中真菌群落在種水平的結構分布以及動態(tài)變化

在種水平對四川麩醋醋醅中真菌菌群結構進行分析，結果如圖4所示。在發(fā)酵過程中，主要有酵母屬（Saccharomyces spp.）、皮狀絲孢酵母屬（Cutaneotrichosporon spp.）、畢赤酵母屬（Pichia spp.）、鏈格孢屬（Alternaria spp.）、雙足囊菌屬（Dipodascus spp.）、曲酶屬（Aspergillus spp.）、節(jié)擔菌屬（Wallemia spp.）等。從圖4中可知，四川麩醋發(fā)酵過程中，優(yōu)勢菌種是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），釀酒酵母在發(fā)酵第1 天時，在真菌菌群中占比1.64%，釀酒酵母在發(fā)酵前5 天，在真菌菌群中占比快速增長，在發(fā)酵第5 天時，在真菌菌群中達到最大占比97.94%，隨后占比開始下降，在發(fā)酵第23 天時，釀酒酵母在真菌菌群中占比下降至0.10%。研究學者發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母能快速發(fā)酵糖類物質(zhì)產(chǎn)生乙醇，還能產(chǎn)生多肽物質(zhì)來抑制非釀酒酵母的生長[20]，這可能是釀酒酵母在前5 天時，能成為優(yōu)勢菌種的原因。曲霉屬（Aspergillus spp.）中主要有未分類的曲霉屬（Unclassified Aspergillus，0.02%～2.39%）、黑曲霉（Aspergillus subversicolor，0.00%～3.14%）、帚狀曲霉（Aspergillus penicillioides，0.01%～2.47%） 和多育曲霉（Aspergillus proliferans，0.00%～1.58%）。曲霉屬在食醋發(fā)酵過程中主要是在糖化階段分泌淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，將蛋白質(zhì)、淀粉等大分子物質(zhì)水解成多肽、氨基酸等小分子物質(zhì)，為發(fā)酵環(huán)境中其它微生物菌群的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)[21]。多育曲霉能產(chǎn)生纖維素降解酶，此外常被用于對工業(yè)廢水中染料進行微生物脫色[22]。帚狀曲霉在發(fā)酵第1 天時，在真菌菌群中占比最大（2.47%），隨后開始快速降低，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)帚狀曲霉喜生長在水分活度低的環(huán)境中[23]。皮狀絲孢酵母屬中主要是未分類皮狀絲孢酵母（unclassified Cutaneotrichosporon）和彎曲隱球菌（Cutaneotrichosporon curvatus）。彎曲隱球菌是一種產(chǎn)油酵母，能利用發(fā)酵環(huán)境中的不同可再生碳源，比如葡萄糖、蔗糖和乳糖等；此外，還可以利用半纖維素和脂質(zhì)等[24]。畢赤酵母屬中主要有未分類的畢赤酵母（unclassified Pichia，0.50%～54.17%） 和曼陀羅畢赤酵母（Pichia mandshurica，0.08%～10.68%）。其中曼陀羅畢赤酵母在發(fā)酵前5 天在真菌菌群中占比下降，隨后占比增大，在發(fā)酵第17 天時曼陀羅畢赤酵母占比達到最大值。在麩醋發(fā)酵過程中，釀酒酵母、未分類的畢赤酵母和曼陀羅畢赤酵母相互競爭，所以在發(fā)酵初期時，3 種酵母之間占比出現(xiàn)此起彼消相互競爭的趨勢。此外，在醋醅中還檢測出鏈格孢屬，鏈格孢屬中主要有未分類的鏈格孢屬（unclassified Alternaria，0.12%～61.31%），在發(fā)酵的第1 天時，未分類的鏈格孢屬是發(fā)酵環(huán)境中的優(yōu)勢菌種，隨后開始降低，在發(fā)酵第27 天時，未分類的鏈格孢屬在真菌菌群中占比最低。鏈格孢屬是植物性病原菌[25]，可見發(fā)酵環(huán)境中的未分類的鏈格孢屬主要來源于醋醅中，在發(fā)酵結束時，發(fā)酵環(huán)境中的未分類的鏈格孢屬減少至最低，可能和發(fā)酵環(huán)境中的pH 值下降有關。

圖4 四川麩醋發(fā)酵過程中真菌群落在種水平的分布Fig.4 Relative abundance of fungal community proportions at species in Sichuan bran vinegar

麩醋發(fā)酵過程中，真菌菌群中的酵母主要發(fā)酵糖類物質(zhì)，產(chǎn)生乙醇，從結果中發(fā)現(xiàn)，在四川麩醋發(fā)酵過程中，酵母在真菌菌群中占有絕對優(yōu)勢地位。而曲霉屬在糖化階段有著重要地位，曲霉屬為麩醋風味物質(zhì)的生成、酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵過程進行鋪墊。在醋醅中檢測出鏈格孢屬的存在，說明麩醋醋醅的微生物安全性值得注意。

3 結論

對四川麩醋發(fā)酵過程中微生物群落結構變化和演替規(guī)律進行分析，發(fā)現(xiàn)細菌群落多樣性和豐度指數(shù)在發(fā)酵第1 天時最高，真菌菌群豐度指數(shù)在發(fā)酵第1 天時最高，而真菌菌群多樣性指數(shù)在發(fā)酵第23 天時最高，造成細菌和真菌之間有差別原因可能是細胞壁結構的差異性。在門的水平分別對醋醅中細菌菌群結構和真菌菌群結構進行分析，結果表明：細菌菌群中的優(yōu)勢菌門是厚壁菌門，而真菌菌群中的優(yōu)勢菌門是子囊菌門。在種的水平分別對醋醅中細菌菌群結構和真菌菌群結構進行分析，結果表明：細菌菌群中的優(yōu)勢菌種是耐酸乳酸桿菌和巴氏醋桿菌，真菌菌群中的優(yōu)勢菌種是釀酒酵母。此外，還在醋醅中檢測出對麩醋風味有貢獻的曲霉屬，意外的檢測出植物性病原菌鏈格孢屬。

結果表明，通過高通量測序技術監(jiān)控四川麩醋發(fā)酵過程中微生物群落結構變化，不僅可以錨定優(yōu)勢菌種，也可以對后期調(diào)控發(fā)酵環(huán)境中微生態(tài)結構，完善傳統(tǒng)工藝，提高四川麩醋的食用安全性奠定理論基礎。