基于免疫層析圖像可視化的黃曲霉毒素B1快速定量方法

鄭允允，毛佳琦，呂 俊，王 培，謝會(huì)君，付玉潔

（浙江大學(xué)中原研究院 鄭州 450001）

黃曲霉毒素是由黃曲霉、寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，穩(wěn)定性強(qiáng)，能長(zhǎng)期自然存放，具有較強(qiáng)的致癌性和致畸性，被列為I 型致癌物[1-2]。其中黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）是毒性最大的黃曲霉毒素，其毒性高于氰化鉀及砒霜[3]。AFB1會(huì)通過被污染的谷物、糧食、中藥等進(jìn)入人體，產(chǎn)生致癌、致畸的危害[4]。文獻(xiàn)報(bào)道，我國(guó)花生油存在AFB1的風(fēng)險(xiǎn)最大[5]。有學(xué)者對(duì)AFB1檢出率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)得出AFB1的超標(biāo)率較低而檢出率很高[6]。在2020年全國(guó)各省市場(chǎng)監(jiān)督管理局公示數(shù)據(jù)中，AFB1主要出現(xiàn)在食用油、油脂及其制品、散裝花生油、花生米、豆瓣、花生醬等食品中。這些食品尤其食用油是日常生活的必需品，若長(zhǎng)期食用含有AFB1的食用油，經(jīng)過累積效應(yīng)不斷在體內(nèi)富集，在一定程度上會(huì)損害肝臟健康[7-8]。目前一些學(xué)者嘗試通過生物脫毒法從根源上將AFB1除去，雖然在去除效果上取得一定的進(jìn)展，但是該方法不能被大規(guī)模利用，且脫毒后的食物能否食用還需進(jìn)一步探究[9-10]。

目前檢測(cè)AFB1的方法較多，主要有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、分子印跡法、電化學(xué)法、電子鼻法、拉曼光譜法和金標(biāo)免疫層析法等[11-18]。其中，較為精確的方法為高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）和液相色譜-質(zhì)譜法，這兩種方法對(duì)操作人員要求較高，且檢測(cè)周期長(zhǎng)、程序繁瑣、成本較高[12]。檢測(cè)方便、可定量，適用于市場(chǎng)監(jiān)管部門質(zhì)量監(jiān)督和民用的有電子鼻法[15-16]和膠體金免疫層析法[17-18]。其中，電子鼻法是借用化學(xué)傳感器對(duì)真菌生長(zhǎng)或代謝過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性產(chǎn)物進(jìn)行識(shí)別定量，其設(shè)備成本較高，檢測(cè)限尚未得到充分的研究和確定，且相關(guān)AFB1檢測(cè)的報(bào)道較少。膠體金免疫層析法是利用納米金作為標(biāo)記物的一種快速測(cè)定方法，該技術(shù)比較成熟，具有測(cè)定結(jié)果可直接讀取、檢測(cè)時(shí)間短、特異性強(qiáng)、靈敏度高、普適性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[19]，然而當(dāng)檢測(cè)樣品濃度低于檢測(cè)限時(shí)，測(cè)定結(jié)果則無法反映其實(shí)際含量。此外，當(dāng)需要短時(shí)間進(jìn)行數(shù)萬樣品定量測(cè)定時(shí)，傳統(tǒng)方法較難實(shí)現(xiàn)。鑒于此，建立普適、便攜、價(jià)格低廉、安全的AFB1快速定量方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

隨著現(xiàn)代信息技術(shù)的快速發(fā)展，圖像信息識(shí)別技術(shù)得到較為廣闊的發(fā)展空間，而掃描儀是高效獲取圖像信息的一種方法。掃描儀的核心部件感光器件為電荷耦合器件（charge coupled device，CCD），通常以百萬像素為單位，獲取信息量大，能處理相對(duì)復(fù)雜的圖像，數(shù)據(jù)在傳輸過程中不存在失真[20]。而圖像顏色信息可以用多種色彩模型的空間坐標(biāo)來表示，這種坐標(biāo)系統(tǒng)所能定義的色彩范圍即顏色空間，它是采用數(shù)學(xué)方法形象表示顏色，使顏色更加直觀，同時(shí)，用人們理解的方式對(duì)顏色進(jìn)行說明且具有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[21-24]。通過CCD 采集圖像信息，結(jié)合顏色空間建模，使得圖像信息的數(shù)字化成為可能。近些年，研究人員利用CCD 和顏色空間進(jìn)行圖像信息采集與處理，在檢測(cè)技術(shù)、遙感圖像等方面均有進(jìn)展。例如Zheng 等[25]運(yùn)用該方法對(duì)復(fù)雜化學(xué)體系進(jìn)行數(shù)字編碼，從而為復(fù)雜化學(xué)體系的檢測(cè)提供了新的解決途徑。本研究利用膠體金免疫層析技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，將AFB1測(cè)定結(jié)果以膠體金檢測(cè)卡形式進(jìn)行可視化呈現(xiàn)，通過CCD 技術(shù)進(jìn)行圖像信息采集，建立基于CCD的AFB1測(cè)定模型——AFB1快速定量模型（Rapid quantitative method for the determination of AFB1，RqM-AFB1），為AFB1的快速定量提供一種新的解決方案，同時(shí)在流程規(guī)范化方面具有一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

診斷試劑用膜（YNHS-120B）、金標(biāo)墊（RB45）、PVC 板（SM31-25），上海金標(biāo)生物；CLOVER 免疫親和柱。

氯金酸（HAuCL4·3H2O），Sigma-Aldrich 公司；黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：1162-65-8；2.0 μg/mL），北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；AFB1抗體、AFB1偶聯(lián)抗原（AFB1-BSA），北京輝奧生物技術(shù)有限公司；三羥甲基氨基甲烷（≥99.5%），Sigma-Aldrich公司；海藻糖（生物試劑），西亞試劑；碳酸鈉（分析純），瀘試；牛血清白蛋白（BSA），Sigma-Aldrich 公司；S17（化學(xué)純），瀘試；Tween-20（化學(xué)純），瀘試；曲拉通X-100（化學(xué)純），瀘試；十水合四硼酸鈉（分析純），瀘試；三水合檸檬酸三鈉（分析純），瀘試；鹽酸（優(yōu)級(jí)純），科密歐；甲醇（色譜純），Merck；聚乙烯吡咯烷酮K-30（優(yōu)級(jí)純），沃凱；蔗糖（分析純），瀘試；無水磷酸二氫鈉（分析純），瀘試；氯化鈉（分析純），瀘試；無水磷酸氫二鈉（分析純），瀘試。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)（TUV759），上海佑科；高速冷凍離心機(jī)（TGL-16M），上海盧湘儀；真空干燥箱（DZF-6050），上海一恒；感應(yīng)噴金儀（HM3260），上海金標(biāo)生物；數(shù)控感應(yīng)斬切機(jī)（ZQ4200），上海金標(biāo)生物；壓殼機(jī)（YK725），上海金標(biāo)生物；掃描儀（V370），精工愛普生株式會(huì)社印度尼西亞分公司；高效液相色譜儀（2695 具熒光檢測(cè)器，柱后光化學(xué)衍生裝置），美國(guó)Waters 公司。

1.3 方法

1.3.1 膠體金制備 采用檸檬酸三鈉還原氯金酸（HAuCL4）法來制備直徑40 nm 的膠體金粒子。取99 mL 超純水及1 mL 1%氯金酸（0.22 μm 濾膜過濾），加熱沸騰后一次性快速加入3 mL 1%檸檬酸鈉（0.22 μm 濾膜過濾），開始計(jì)時(shí)。由于膠體金溶液繼續(xù)保持沸騰時(shí)間較長(zhǎng)，體系易在沸騰狀態(tài)下不穩(wěn)定，易發(fā)生聚沉現(xiàn)象，因此，3 min 后將磁力攪拌器溫度調(diào)至95 ℃。在均勻攪拌（200 r/min）過程中使整個(gè)反應(yīng)時(shí)間控制在15 min，溶液顏色為淺黃色-紫灰色-酒紅色。靜置冷卻至室溫后用超純水補(bǔ)充至原體積。最后，將制備成酒紅色的膠體金溶液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后用棕色玻璃試劑瓶4 ℃保存。

1.3.2 膠體金紫外掃描 將制備好的膠體金用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.3 AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 用甲醇將AFB1溶解配制成1.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，臨用前用甲醇稀釋液逐級(jí)稀釋至所需濃度，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 K2CO3加入量篩選 pH 值是膠體金標(biāo)記物制備的關(guān)鍵，通過分別加入不同量的（0，1，2，3，4，8，16 μL/mL）0.2 mol/L K2CO3，以不變色的最低K2CO3加入量確定為最適加入量。其中，抗體固定加入量為2 μL/mL。

1.3.5 金標(biāo)記量的篩選 取制備的膠體金溶液并加入3 μL/mL 0.2 mol/L K2CO3，攪拌5 min 后加入2 μL/mL 標(biāo)記的抗體，攪拌15 min，按1/10 體積逐滴加入10% BSA，攪拌封閉30 min，用冷凍離心機(jī)13 000 r/min，4 ℃離心20 min，棄去上清液后加入原體積1/10 復(fù)溶液（0.01 mol/L Tris8.0+1% BSA+3% 海藻糖）重懸金標(biāo)抗體。采用感應(yīng)噴金儀，將不同量（1，2，3 μL/cm）的金標(biāo)抗體噴在金標(biāo)墊上（37 ℃，1.5 h 烘干），此外，NC 膜上T 線和C 線濃度均為確定值（T 線質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL；C 線質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL）[17]。

1.3.6 試紙條的組裝 檢測(cè)卡主要組成部分，包括樣品墊，噴金墊，NC 膜，吸收墊、PVC 板等。通過使用競(jìng)爭(zhēng)免疫試驗(yàn)對(duì)AFB1進(jìn)行檢測(cè)。用切割機(jī)將貼好的板切割成3.5 mm 寬的條，放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲(chǔ)存。

1.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將制備好的裝有干燥劑的試紙條放在37 ℃、相對(duì)濕度23%的條件下分別保存7 d 和14 d。取空白花生油樣品2 份，分別加入AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中AFB1的含量為0 μg/kg和20 μg/kg，隨機(jī)取不同環(huán)境下保存的試紙條，進(jìn)行樣本檢測(cè)。

1.3.8 回收率試驗(yàn) 取30 份花生油空白樣品加入AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，使花生油中AFB1的含量分別為2.5，5，10，20，30 μg/kg，其中每個(gè)濃度進(jìn)行6 組平行試驗(yàn)。

1.3.9 AFB1信息識(shí)別與定量表達(dá)方法的構(gòu)建 本研究以AFB1膠體金檢測(cè)卡為載體，將AFB1檢測(cè)信息通過膠體金檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行可視化呈現(xiàn)；采用CCD 記錄檢測(cè)信息，利用顏色空間進(jìn)行數(shù)學(xué)建模并將可視化信息進(jìn)行數(shù)字化提取。通過建立基于CCD 的AFB1智能測(cè)定模型（RqM-AFB1）將獲取的AFB1的含量信息進(jìn)行識(shí)別與表達(dá)。如圖1所示，當(dāng)測(cè)定樣品C 線不顯示信息時(shí)，系統(tǒng)自動(dòng)識(shí)別并退出；若CT 線顯示正常，系統(tǒng)對(duì)CT 線顯色信息進(jìn)行智能提取與標(biāo)準(zhǔn)化處理，將處理后的信息以數(shù)字化形式再一次傳送到RqM-AFB1系統(tǒng)，通過該模型的建立可以對(duì)AFB1含量信息進(jìn)行識(shí)別分析，這一模型是AFB1定量信息最為直接的表達(dá)。

圖1 AFB1 定量檢測(cè)方法構(gòu)建Fig.1 A quantitative recognition strategy of AFB1

1.3.10 方法驗(yàn)證試驗(yàn) 為驗(yàn)證構(gòu)建方法的可行性，本研究設(shè)計(jì)了驗(yàn)證試驗(yàn)。驗(yàn)證試驗(yàn)分兩部分構(gòu)成：1 RqM-AFB1智能讀取結(jié)果與人工計(jì)算（30 組平行）得出的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比；2 RqM-AFB1智能讀取結(jié)果與HPLC 試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比。其中HPLC 試驗(yàn)如下：稱取混勻樣品5 g，分4 個(gè)梯度加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入1 g 氯化鈉和25 mL 甲醇水溶液，混勻后振蕩30 min，經(jīng)離心機(jī)7 500 r/min 離心5 min，取5 mL 上清液，加10 mL 水混勻，過柱，待液體過完，用20 mL 水清洗，最后用1 mL 甲醇洗脫，洗脫液待測(cè)。試驗(yàn)測(cè)定花生油樣品AFB1的含量為2.5，5，10，20 μg/kg。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金質(zhì)量分析

為確保制備的膠體金具有較好的穩(wěn)定性，本研究做了3 組平行，并用紫外可見光分光光度計(jì)對(duì)膠體金在可見光范圍（490～600 nm）進(jìn)行測(cè)定。如圖2顯示：整體波峰比較突出且峰寬比較窄，說明制備的膠體金顆粒具有較好的均一性和分散性。3 組試驗(yàn)?zāi)z體金的波峰寬度整體趨勢(shì)基本一致，最大吸光度值在1.117～1.118 之間，最大吸收波長(zhǎng)均在520～521 nm 之間。得出制備的膠體金符合在40 nm 的范圍內(nèi)，且具有較好的穩(wěn)定性。

圖2 膠體金紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果圖Fig.2 Determination of colloidal gold by spectrophotometry

2.2 K2CO3 加入量篩選結(jié)果與分析

如圖3所示為不同K2CO3加入量對(duì)金標(biāo)記物的活性影響，隨著K2CO3加入量的增多，顏色由酒紅色逐漸變?yōu)樽匣疑?，最后變?yōu)榛疑?；金?biāo)記物隨著活性減弱顏色逐漸加深。由顏色可看出，當(dāng)K2CO3加入量為3 μL/mL，其顏色為酒紅色，通過測(cè)定pH 值為8.2，該pH 值與結(jié)合墊的酸堿度一致，因此本試驗(yàn)所選取的K2CO3加入量為3 μL/mL。

圖3 K2CO3 最適加入量篩選Fig.3 The screening of K2CO3 optimal addition quantity

2.3 最適噴金量篩選結(jié)果

將制備好的試紙條加入空白樣本，觀察T、C線顯色情況，可以看出噴金量為3 μL/cm，（T，C）=（0.05，0.8 mg/mL）時(shí)，檢測(cè)卡顯色最好（圖4），其C線和T 線均顯色均勻，同時(shí)做陽性樣本檢測(cè)，20 μg/kg 時(shí)，陽性明顯。

圖4 膠體金檢測(cè)卡制備條件篩選Fig.4 Optimum conditions for the preparation about test card

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

將制備的試紙條置于37 ℃的條件下分別保存7 d（圖5a）和14 d（圖5b），并進(jìn)行陽性和陰性樣品檢測(cè)，結(jié)果顯示試紙條均有效，但保存14 d后的試紙條陰性樣本顯色亮度變?nèi)酢?/p>

圖5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比圖Fig.5 Comparison diagram of stability test results

2.5 AFB1 回收率與精密度試驗(yàn)

AFB1的回收率，如表1所示。AFB1的濃度越小，回收率越低，當(dāng)質(zhì)量濃度為2.5 μg/kg 時(shí)，其平均回收率為90.26%；當(dāng)質(zhì)量濃度為30 μg/kg 時(shí)，其平均回收率可達(dá)到94.89%。經(jīng)計(jì)算得出：AFB1的整體平均回收率為92.33%左右，最大標(biāo)準(zhǔn)差為1.12%。因此，本試驗(yàn)所采用的提取方法對(duì)AFB1檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度影響較小。

表1 膠體金檢測(cè)卡測(cè)定花生油中AFB1 的加標(biāo)回收率Table 1 Recovery analysis of AFB1 from peanut oil by colloidal gold detection card

2.6 AFB1 膠體金檢測(cè)卡檢測(cè)結(jié)果與CT 線顏色的線性關(guān)系表達(dá)

AFB1檢測(cè)卡和陽性樣本之間的顯色反應(yīng)與樣本濃度大小呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（T 線顏色越淺，陽性樣本濃度越大），當(dāng)加入少量的陽性樣本時(shí)，細(xì)微的顏色變化肉眼很難直接辨別。因此，本研究中將圖像信息進(jìn)行了數(shù)字化處理，以便將反應(yīng)結(jié)果的差異性放大后再進(jìn)行分析研究。所有反應(yīng)結(jié)果的圖像通過軟件標(biāo)準(zhǔn)化處理后，提取出反應(yīng)區(qū)域圖像的RGB 值，通過顏色空間的計(jì)算公式[26]，對(duì)顯色圖像進(jìn)行數(shù)字化處理并將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算分析（表2）。從圖表中得出，濃度與顏色距離具有線性相關(guān)性，濃度越大，距離越遠(yuǎn)?；谠摲椒?，本研究進(jìn)行了30 組重復(fù)試驗(yàn)，并對(duì)其取平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 AFB1 膠體金檢測(cè)卡TC 線上的RGB 值與濃度之間的關(guān)系Table 2 Relationship between RGB and concentration on AFB1

式中：D——距離；C——質(zhì)控線；T——檢測(cè)線。

2.7 圖像信息讀取精確度分析

為驗(yàn)證結(jié)果的精確性，確保構(gòu)建方法的可重復(fù)性。研究選取不同濃度平行試驗(yàn)，通過進(jìn)行誤差分析，繼而判斷結(jié)果的精確程度。隨機(jī)選取3 組不同含量（高20 μg/kg）、中10 μg/kg、低5 μg/kg）AFB1樣品的檢測(cè)卡進(jìn)行兩平行試驗(yàn)，計(jì)算平行樣反應(yīng)區(qū)圖片上每個(gè)對(duì)應(yīng)點(diǎn)之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，并對(duì)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，繪制圖片上不同相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值下的像素?cái)?shù)累積趨勢(shì)線。如圖6所示，質(zhì)量濃度為20 μg/kg 的平行樣之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.7%的點(diǎn)占97%；質(zhì)量濃度為10 μg/kg 的平行樣之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.6%的點(diǎn)為90%；質(zhì)量濃度為5 μg/kg 的平行樣之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4%的點(diǎn)達(dá)到96%以上，說明圖像信息讀取結(jié)果具有較高的精確度。

圖6 重復(fù)樣相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差累計(jì)百分?jǐn)?shù)Fig.6 Error analyze of three different parallel samples

2.8 RqM-AFB1 可行性分析

本研究利用CCD 采集AFB1檢測(cè)結(jié)果的顯色信息，將AFB1定量檢測(cè)信息進(jìn)行輸出與呈現(xiàn)，并與人工試驗(yàn)（30 組平行）進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖7a 所示。其中，RqM-AFB1得出的線性公式為：y=3.130x+31.746，R2=0.985；人工試驗(yàn)得出的線性公式為：y=2.822x+35.025，R2=0.986。通過對(duì)比分析，兩條線性公式的擬合度較高，在X=2.5μg/kg 時(shí)誤差最大，經(jīng)計(jì)算得出其最大誤差為5.93%，說明該方法在一定范圍內(nèi)可行性較強(qiáng)。此外，本研究將RqM-AFB1的測(cè)定結(jié)果與HPLC 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，如圖7b 所示：RqM-AFB1測(cè)定的結(jié)果與HPLC 試驗(yàn)無顯著性差異（P＞0.05），且它們之間的相對(duì)誤差在10%以內(nèi)。因此，通過RqM-AFB1與HPLC 試驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比，驗(yàn)證了的RqM-AFB1可行性與有效性。

圖7 AFB1 快速定量方法可行性分析Fig.7 The feasibility analysis of RqM-AFB1

3 結(jié)論與展望

本研究通過CCD 技術(shù)和顏色空間模型建立了一種AFB1快速定量的新策略，實(shí)現(xiàn)了多個(gè)樣本檢測(cè)結(jié)果的同時(shí)記錄和一次性輸出，與傳統(tǒng)方法相比，檢測(cè)效率明顯提高。研究結(jié)果表明，該方法可快速準(zhǔn)確地進(jìn)行定量檢測(cè)，且整個(gè)檢測(cè)過程中人工參與度較低，誤差率在可控范圍內(nèi)，滿足基本的市場(chǎng)需求。本文所提出的RqM-AFB1在AFB1定量識(shí)別的準(zhǔn)確度方面有較好表現(xiàn)，但測(cè)量精度方面仍有局限性，如何改進(jìn)模型并融入機(jī)器學(xué)習(xí)來提升測(cè)量精度可以考慮為未來研究的一個(gè)方向。