河蜆湯中納米顆粒作用于大鼠口腔巨噬細胞的研究

汪惠勤，徐天豪，高觀禎，柯李晶，丁亞男，周靜茹，丁 偉，張溯云，周建武，饒平凡

（中國科學院上海生命科學研究院-浙江工商大學食品營養(yǎng)科學聯(lián)合研究中心 杭州 310012）

食品中含有大量的兩性化合物成分，如多糖、蛋白質(zhì)、油脂等，這些成分在食品加工過程中容易發(fā)生自組裝形成微納米級別的膠體顆粒[1]。這種膠體顆粒廣泛存在于多種食品中，如茶[2]、豬骨湯[3-4]、醋[5]、醬油[6]、河蜆湯[7]等。甚至在中藥湯劑中也多有發(fā)現(xiàn)，如在麻杏石甘湯中發(fā)現(xiàn)了裝載麻黃堿與偽麻黃堿的納米顆粒[8]。眾所周知，物質(zhì)的納米尺寸化會帶來新的物理化學特性和生理效應(yīng)。作為一種大量、長期且反復(fù)被人體攝入的納米物質(zhì)，這類納米顆粒對人體產(chǎn)生的影響必然有別于游離的食品成分，值得引起關(guān)注。這類納米顆粒可以直接與腸道黏膜層相關(guān)細胞發(fā)生作用[9]，如豬骨湯來源的納米顆粒能與巨噬細胞直接作用，調(diào)節(jié)細胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)和免疫功能[3-4]，顯示了與游離的豬骨湯成分完全不同的生理功能。

河蜆（Corbicula fluminea），又稱金蚶，黃金蜆，是一種小型的雙殼類動物，富含多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和氨基酸等物質(zhì)。河蜆烹制的湯不僅味道鮮美，而且有降脂保肝等保健作用[10-13]。有研究表明，河蜆湯可以通過降低絲裂原活化蛋白激酶和核因子NF-kappa B 的活化，抑制脂多糖活化巨噬細胞的炎癥反應(yīng)，顯著增加巨噬細胞的內(nèi)吞活性，具有調(diào)節(jié)機體免疫功能和修復(fù)肝損傷的作用[14]。河蜆湯中存在大量納米顆粒，裝載了湯中大部分活性護肝成分，如植物甾醇、鳥氨酸、牛磺酸等[7，15]。

本研究將河蜆湯納米顆粒作為研究對象，以大鼠口腔巨噬細胞為模型，跟蹤河蜆湯納米顆粒進入巨噬細胞的過程及其在胞內(nèi)的分布，探究納米顆粒對氧化應(yīng)激狀態(tài)下的巨噬細胞的膜電位與線粒體自由基水平與代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

河蜆，由中國臺灣花蓮立川水產(chǎn)場養(yǎng)殖并惠贈。

細胞培養(yǎng)基、0.25% EDTA-胰酶、雙抗（青霉素、鏈霉素）、PBS/HBSS 緩沖液和谷氨酰胺等，GIBCO 公司；胎牛血清，以色列Biological Industries 公司；DCFH-DA、AAPH、蛋白酶、HistopaqueR-1077 密度梯度液、Hoechst 33342 染料、DiBAC4（3）與Nile red 染料，美國Sigma 公司；96/48/12/6孔板（黑色透底和普通透底）與T-75 細胞培養(yǎng)板，美國Corning 公司；24 孔激光共聚焦培養(yǎng)板，美國Cellvis 公司；超濾管（Mw=100 ku），美國Millipore公司；多聚甲醛，德國Merck KgaA 公司；尼龍細胞過濾網(wǎng)（100 μm），美國Falcon 公司；其它試劑購于國藥集團化學試劑有限公司。

SD 大鼠（SPF 級）購于浙江省動物科學研究所，涉及的動物實驗已獲浙江省醫(yī)學科學院動物保護和福利委員會審查批準（編號：2016R10031）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

細胞培養(yǎng)箱NU-8500，美國NUAIRE 公司；FlexStation 3 多功能鈣流工作站，美國Molecular Devides 公司；生物安全柜1300Series II，美國Thermo Forma 公司；手持式細胞計數(shù)器ScepterTM2.0，美國Molecular Devices 公司；激光共聚焦顯微鏡Zeiss LSM780，德國Carl Zeiss SAS 公司；熒光倒置顯微鏡DMI3000 B，美國Leica 公司；高速離心機T15A36 型，日本Hitachi Koki 公司；-80 ℃超低溫冰箱，美國Thermo Forma公司；電子分析天平（微量）XS105DU，Mettler Toledo 儀器有限公司；分析天平ME，METTLER TOLEDO。

1.3 試驗分析方法

1.3.1 河蜆湯及其納米顆粒制備及性質(zhì)表征 參照前期研究進行制備[15]，將河蜆浸泡除沙2～3 h，洗凈后按1 000 g/L 比例與水混合，沸水煮60 min，收集湯液，冷卻到室溫，于5 000 g 離心15 min，除沉淀，所得上清液即為河蜆湯（Freshwater clam soup，F(xiàn)CS）。用Uno-Q 陰離子交換色譜連接多角度激光光散射（multiangle laser light scattering，MALLS） 對河蜆湯中納米顆粒進行分離純化，純化得到兩個納米顆粒組分，收集并分別標記為IEC-P1 和IEC-P2。將FCS、IEC-P1 和IEC-P2進行凍干保藏，供后續(xù)試驗用。

FCS、IEC-P1 和IEC-P2 的平均水合粒徑（Dh）和zeta 電位采用動態(tài)光散射儀進行測定，每組數(shù)值進行3 次重復(fù)，湯的黏度、折射率和吸收值采用Malvern 軟件提供的水的黏度μ=0.8872 cP，折射率RI=0.135 進行換算。

1.3.2 SD 大鼠口腔巨噬細胞的制備 SD 大鼠經(jīng)脫頸處死，于75%的乙醇溶液中浸泡5 min 進行滅菌處理。取出置于無菌操作臺中，用無菌剪刀和鑷子將大鼠的面頰皮層剪開，小心剖出其面頰肌肉和上軟腭，放入PBS（預(yù)先經(jīng)4 ℃冷卻且已加入體積分數(shù)1%的雙抗）溶液中，洗掉當中的少許血塊，并除去面頰肌肉上的筋條，此過程重復(fù)4 次。啟用另外一套無菌剪刀和鑷子，將肌肉和軟腭切成1 mm3左右的小塊，放入經(jīng)37 ℃預(yù)熱的消化液（不含F(xiàn)BS 的DMEM 培養(yǎng)液，0.075% I 型 膠原酶，0.075% II 型膠原酶）中，置于37 ℃環(huán)境下消化2 h，期間每5 min 搖勻一次。用100 μm 的尼龍過濾網(wǎng)過濾消化液并收集濾過液，將其于25 ℃下進行400 g，5 min 的離心，留沉淀，用DMEM 維持液重懸，再離心，而后制成重懸液，按體積比1 ∶1比例，小心地將細胞懸液加在HistopaqueR-1077巨噬細胞密度梯度液上，于20 ℃下400 g 離心20 min。離心后，離心管的溶液分為3 層，中間薄薄的一層即為目標細胞群，小心取出該層細胞，用DMEM 維持液重懸，于400 g 離心5 min 除去殘余的密度梯度液。最后用含有15% FBS、1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基制備細胞懸液，調(diào)節(jié)細胞濃度為1×106cells/mL，并培養(yǎng)于T-75 細胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中2 h，取出，小心移除未貼壁的細胞，即為消化純化后的口腔巨噬細胞，在其中加入新的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜，待用。

1.3.3 河蜆納米顆粒進入口腔巨噬細胞的觀察河蜆納米顆粒采用尼羅紅標記染色。用DMSO 配制1%的尼羅紅母液，向FCS、IEC-P1 和IEC-P2納米顆粒懸液中加入尼羅紅溶液（終質(zhì)量濃度為1 μg/mL），常溫下避光染色1 h，染色結(jié)束后，利用超濾離心管（100 ku）于5 000 g 離心力下離心10 min，截留組分利用HBSS 重懸，超濾，多次進行直至濾液中未觀察到尼羅紅染液熒光，最后用DMEM 等體積重懸截留組分，待用。

將1 000 μg/mL 的標記后的納米顆粒懸液與口腔巨噬細胞（2×104cells/mL）在37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育2 h，取出并去除板內(nèi)培養(yǎng)基，加入0.6 mL 的含1 μmol/L Hoechst 33342 的HBSS染液，孵育5 min，利用HBSS 清洗細胞兩次。于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察口腔巨噬細胞與納米顆粒的作用情況。激光共聚焦選用雙通道設(shè)置。1）尼羅紅：激發(fā)/發(fā)射波長=（549/628）nm；2）Hoechst 33342：激發(fā)/發(fā)射波長=（346/460）nm。

1.3.4 河蜆湯及其納米顆粒對大鼠口腔巨噬細胞細胞膜電位和線粒體自由基含量的影響 檢測FCS、IEC-P1 和IEC-P2 分別在1 000，250 和62.5 μg/mL 3 個質(zhì)量濃度下對口腔巨噬細胞膜電位及線粒體自由基含量的影響。于96 孔培養(yǎng)板中接2×104cells/孔的口腔巨噬細胞懸液200 μL，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱里過夜培養(yǎng)。取出并去除殘余的培養(yǎng)基，用HBSS 清洗細胞2 遍，加入3 μmol/L 的線粒體超氧化物紅色熒光探針（MitoSOX Red 溶液）200 μL/孔，于培養(yǎng)箱孵育10 min，小心吸取上清液，用HBSS 清洗2 遍，加入100 μL 2.5 μmol/L 的DiBAC4（3）溶液，于培養(yǎng)箱孵育15 min 后，往孔內(nèi)加入50 μL AAPH（終質(zhì)量濃度6.4 μmol/L）或50 μL HBSS，同時繼續(xù)加入50 μL 樣品（終質(zhì)量濃度為1 000，250 和62.5 μg/mL），試驗同時設(shè)立空白組、陽性對照組（AAPH）。完成加樣后，選用雙通道測定。（a）MitoSOX Red染料：激發(fā)/發(fā)射波長=（510/580）nm；（b）DiBAC4（3）染料：激發(fā)/發(fā)射波長=（493/516）nm。檢測時長為120 min，每10 min 測定一次熒光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 河蜆湯中納米顆粒的理化性質(zhì)表征

河蜆湯中納米顆粒的平均水合粒徑和zeta電位分別為（76±0.5）nm 和-11.2 mV。按照前期研究中建立的方法分離制備河蜆湯中納米顆粒[15]，得到IEC-P1 和IEC-P2 兩種納米顆粒組分，其平均水合粒徑和zeta 電位分別為（50±0.2）nm 和-28 mV、（67±0.4）nm 和-10.0 mV。FCS、IEC-P1 和IEC-P2 各組分中都含有為多糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和植物甾醇。

尼羅紅作為脂質(zhì)染料，可呈現(xiàn)紅色熒光，常用來示蹤脂質(zhì)成分在細胞內(nèi)或者體內(nèi)的代謝狀況[16]。如圖1所示，激光共聚焦顯微鏡下，經(jīng)尼羅紅標記后的河蜆納米顆粒呈紅色小點。比較染色前后納米顆粒的粒徑大小和zeta 電位的變化，發(fā)現(xiàn)它們未發(fā)生明顯的變化（數(shù)據(jù)未顯示），說明河蜆湯納米顆粒具有很好的穩(wěn)定性。

圖1 河蜆湯及其兩顆粒組分Nile red 染色后熒光顯微圖Fig.1 Fluorescence micrograph of freshwater clam soup and the two isolated nanoparticle fractions with Nile red staining

2.2 河蜆湯納米顆粒和大鼠口腔巨噬細胞的直接作用

2.2.1 河蜆湯納米顆粒進入口腔巨噬細胞的觀察 經(jīng)尼羅紅染色的河蜆湯（FCS） 及納米顆粒（IEC-P1 和IEC-P2） 作用于大鼠口腔巨噬細胞，結(jié)果如圖2所示。巨噬細胞分別和FCS、IEC-P1與IEC-P2 作用2 h 后，在胞漿和細胞核中均可以觀察到紅色熒光顆粒（如圖片箭頭所示）。二者相互作用后在巨噬細胞胞內(nèi)觀察到的紅色熒光顆粒與河蜆湯納米顆粒在形態(tài)和大小上并無明顯不同，表明河蜆湯納米顆粒能以顆粒的完整形態(tài)進入胞內(nèi)與巨噬細胞發(fā)生作用，部分顆粒還能進入細胞核內(nèi)。河蜆湯納米顆粒進入細胞胞內(nèi)的行為可能同時與納米顆粒理化性質(zhì)和巨噬細胞的吞噬行為有關(guān)，即主動跨越生物膜和被動為巨噬細胞吞噬，其機制尚不完全明確。另一方面，巨噬細胞吞噬河蜆湯納米顆粒后，激光共聚焦顯微鏡下并未觀察細胞形態(tài)發(fā)生改變，表明河蜆湯納米顆粒對巨噬細胞沒有明顯或急性的毒性作用。

圖2 大鼠口腔巨噬細胞對河蜆湯納米顆粒的吞噬作用Fig.2 Uptake of nanoparticles derived from freshwater clam soup（Nile red staining） by rat oral mucosal macrophages

2.2.2 河蜆湯納米顆粒對口腔巨噬細胞膜電位的影響 FCS、IEC-P1 與IEC-P2 分別在1 000，250和62.5 μg/mL 3 個濃度下與巨噬細胞作用后，細胞膜電位發(fā)生變化的結(jié)果如圖3所示。在與FCS、IEC-P1 和IEC-P2 前后，巨噬細胞膜電位探針DiBAC4（3）綠色熒光強度前后基本不變，顯示這3種樣品對正常狀態(tài)下的口腔巨噬細胞膜電位（Vmem）沒有明顯影響。

水溶性偶氮化合物AAPH 可誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化作用，被廣泛應(yīng)用于觸發(fā)細胞中的氧化應(yīng)激[17]。AAPH 可誘導(dǎo)巨噬細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，不同濃度下的FCS、IEC-P1 與IEC-P2 均能明顯改變氧化應(yīng)激狀態(tài)下的巨噬細胞膜電位，表現(xiàn)為DiBAC4（3）發(fā)出的綠色熒光強度有明顯變化。在AAPH 與巨噬細胞作用后的120 min 內(nèi)（見圖3），DiBAC4（3）的綠色熒光強度呈現(xiàn)了一個持續(xù)減弱的過程，說明在120 min 內(nèi)AAPH 誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生大量的過氧自由基，使得細胞Vmem下降，細胞膜電位發(fā)生超極化現(xiàn)象。

圖3 河蜆湯納米顆粒對大鼠口腔巨噬細胞膜電位（綠色熒光）和線粒體超氧自由基（紅色熒光）的作用熒光顯微圖片F(xiàn)ig.3 Fluorescence micrographs of the effects of nanoparticles derived from freshwater clam soup on cell membrane potential（green fluorescence） and mitochondrial superoxide radicals（red fluorescence） in rat oral mucosal macrophages

在AAPH 作用的同時加入不同濃度的FCS、IEC-P1 與IEC-P2，DiBAC4（3）的綠色熒光強度均比AAPH 組高，說明3 種河蜆湯納米顆粒樣品均可以減弱口腔巨噬細胞Vmem下降的現(xiàn)象。

3 種河蜆納米顆粒樣品對氧化應(yīng)激下的巨噬細胞膜電位的調(diào)節(jié)作用均具有濃度依賴性，以最高質(zhì)量濃度1 000 μg/mL 下對膜電位的調(diào)節(jié)效果最為明顯，隨濃度降低其調(diào)節(jié)效果也隨之減弱。3種河蜆納米顆粒樣品對巨噬細胞膜電位調(diào)節(jié)能力具有差異：在測試的3 個濃度范圍內(nèi)，和FCS 作用的巨噬細胞胞內(nèi)綠色熒光強度均高于AAPH 組，即使FCS 最低質(zhì)量濃度為62.5 μg/mL 時，胞內(nèi)熒光強度還比AAPH 組的高約40%，而IEC-P1 和IEC-P2 納米顆粒只在1 000 μg/mL 和250 μg/mL質(zhì)量濃度時，作用的巨噬細胞胞內(nèi)熒光強度明顯強于AAPH 組，但質(zhì)量濃度為62.5 μg/mL 時與AAPH 組差異不明顯。在1 000 μg/mL 質(zhì)量濃度下，F(xiàn)CS 樣品表現(xiàn)出對膜電位的調(diào)節(jié)作用最為明顯，IEC-P2 其次，IEC-P1 的調(diào)節(jié)作用為最弱。

圖4 河蜆湯納米顆粒對大鼠口腔巨噬細胞膜電位的影響Fig.4 Effect of nanoparticles derived from freshwater clam soup on cell membrane potential of rat oral mucosal macrophage

2.2.3 河蜆湯納米顆粒對口腔巨噬細胞線粒體超氧自由基的影響 試驗同時檢測了FCS、IEC-P1和IEC-P2 納米顆粒分別在1 000，250 和62.5 μg/mL 3 個質(zhì)量濃度下對巨噬細胞線粒體超氧自由基的影響，結(jié)果見圖5。從胞內(nèi)MitoSOX Red 熒光探針（也稱Mito-HE）所發(fā)的紅色熒光強度上看，3種河蜆納米顆粒樣品對正常狀態(tài)下的巨噬細胞線粒體超氧自由基均沒有明顯影響。相反，不同濃度的3 種河蜆納米顆粒樣品均對AAPH 造成的氧化應(yīng)激狀態(tài)下的巨噬細胞線粒體超氧自由基有明顯影響作用。

AAPH 造成巨噬細胞氧化應(yīng)激后，激活了巨噬細胞線粒體的解偶聯(lián)蛋白[18]，導(dǎo)致線粒體呼吸代謝速率下降[19]，反而會導(dǎo)致線粒體內(nèi)超氧自由基水平降低[20]。如圖5所示，巨噬細胞經(jīng)AAPH 作用后，其線粒體自由基水平降低，表現(xiàn)為Mito-HE探針發(fā)出的紅色熒光強度顯著性減弱（P＜0.01）。

圖5 河蜆湯納米顆粒對大鼠口腔巨噬細胞線粒體超氧自由基的作用Fig.5 Effects of nanoparticles derived from freshwater clam soup on mitochondrial superoxide radicals in rat oral mucosal macrophages

在AAPH 作用的同時，加入不同濃度的FCS、IEC-P1 和IEC-P2 納米顆粒，巨噬細胞胞內(nèi)線粒體氧呼吸代謝下降的現(xiàn)象得到不同程度的改善。3種河蜆湯納米顆粒樣品間也表現(xiàn)出對線粒體超氧自由基調(diào)節(jié)能力的不同：在1 000 μg/mL 質(zhì)量濃度下，F(xiàn)CS 能使線粒體內(nèi)Mito-SOX 熒光強度基本恢復(fù)到正常水平，改善幅度極為顯著（P＜0.01）；IECP1 和IEC-P2 納米顆粒雖不及河蜆湯顆粒，但也能使Mito-SOX 熒光強度恢復(fù)至正常水平的80%左右。同時，3 種河蜆湯納米顆粒樣品對細胞線粒體超氧自由基的調(diào)節(jié)作用均存在濃度依賴性，都以最高質(zhì)量濃度1 000 μg/mL 下對線粒體超氧自由基的調(diào)節(jié)效果最為明顯，隨濃度降低其調(diào)節(jié)效果也隨之減弱。

3 討論

巨噬細胞是消化道黏膜免疫系統(tǒng)中的重要部分，具有識別食物中異物、吞噬顆粒的作用，在維持消化道黏膜免疫穩(wěn)態(tài)、病原體先天防御、組織修復(fù)和代謝等方面發(fā)揮重要作用[21]。

從攝入口腔開始，食物中的納米顆粒就不可避免地與黏膜巨噬細胞發(fā)生作用，調(diào)查二者之間的相互作用非常有必要。已有報道顯示不同類型的無機納米顆粒，如Ag 納米顆粒[22]、ZnO 納米顆粒[23-24]、SiO2納米顆粒[25]、TiO2納米顆粒[26]等，均能對巨噬細胞產(chǎn)生影響，造成細胞的氧化應(yīng)激并帶來毒性。本研究結(jié)果顯示河蜆湯納米顆粒可以直接對大鼠口腔黏膜來源的原代培養(yǎng)巨噬細胞產(chǎn)生影響，表明河蜆湯納米顆粒從攝入口腔開始就具有影響消化道黏膜免疫的能力。與合成的無機納米顆粒不同，河蜆湯納米顆粒并不會造成正常巨噬細胞氧化應(yīng)激，也未表現(xiàn)出細胞毒性。

消化道黏膜是食物攝入后消化和轉(zhuǎn)運的主要交換界面，它的氧化還原平衡狀態(tài)與黏膜免疫穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。本研究中使用了偶氮化合物AAPH來誘導(dǎo)產(chǎn)生過氧自由基，以模擬食物在攝入過程中巨噬細胞在消化道微環(huán)境中可能遇到的ROS應(yīng)激。AAPH 誘導(dǎo)會致使巨噬細胞胞內(nèi)自由基上升，同時通過鈣離子依賴的鉀離子通道來增加胞內(nèi)鈣離子濃度，造成細胞膜電位超極化[27]，并降低線粒體的呼吸代謝速率[19]，從而減弱線粒體自由基的產(chǎn)生[20]。河蜆湯納米顆粒表現(xiàn)出對氧化應(yīng)激對巨噬細胞造成損害的修復(fù)能力，對細胞膜電位及細胞線粒體呼吸代謝速率損傷具有保護作用。其保護機制可能與巨噬細胞細胞膜上的Na+/K+通道作用有關(guān)。有研究表明，納米顆粒可以與細胞膜的Na+/K+通道結(jié)合，從而造成膜電位發(fā)生改變[28]；此外，納米顆粒zeta 電位對細胞膜的膜電位具有影響，不同表面zeta 電位的納米顆粒對細胞的膜電位改變具有不同的作用[29]。河蜆湯納米顆粒對氧化應(yīng)激狀態(tài)下巨噬細胞具有保護作用，表明了食品中微納米顆粒與消化道黏膜直接作用的可能，提示了一種食品與人體相互作用的新模式。

4 結(jié)論

本試驗采用大鼠口腔黏膜來源的巨噬細胞為模型，對3 種不同河蜆湯納米顆粒的活性進行調(diào)查，試驗結(jié)果顯示：FCS、IEC-P1 和IEC-P2 納米顆?？梢约{米顆粒的完全形態(tài)進入巨噬細胞胞內(nèi)和線粒體中發(fā)生作用。3 種河蜆湯納米顆粒均未表現(xiàn)出對巨噬細胞的細胞毒性，也未造成正常巨噬細胞的氧化應(yīng)激。河蜆湯納米顆粒對處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下巨噬細胞具有修復(fù)保護作用，可恢復(fù)巨噬細胞的細胞膜電位并維持其線粒體呼吸代謝速率。本研究的結(jié)果提供了食品納米顆粒與免疫細胞之間直接相互作用的證據(jù)，這提示了一種食品與人體相互作用的新模式。