基于肽組學(xué)的瑞士乳桿菌酪蛋白水解差異分析

張心怡，姜 楊，劉小鳴，趙建新，陳 衛(wèi)

（江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無錫 214122）

瑞士乳桿菌是奶酪的傳統(tǒng)發(fā)酵劑之一，與其它商業(yè)上重要的乳酸菌相比，瑞士乳桿菌具有較強(qiáng)的蛋白水解能力[1]。以酪蛋白水解為例，通常乳酸菌的胞壁蛋白酶（CEP）先將其降解為寡肽（2～20 個(gè)氨基酸），然后通過肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將其運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)各種肽酶的協(xié)同作用下進(jìn)一步降解為氨基酸。已知在乳酸菌中，瑞士乳桿菌的蛋白質(zhì)水解基因最為多樣化。首先，瑞士乳桿菌的胞壁蛋白酶基因的數(shù)量從1 個(gè)到4 個(gè)不等[2]，酪蛋白的水解能力也存在差異[3-4]。另外，瑞士乳桿菌中肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的類型也存在差異，如瑞士乳桿菌DPC4571 具有3 種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，而瑞士乳桿菌H10只有寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Opp 和二、三肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)DtpT[5-6]。

另外，研究也表明不同瑞士乳桿菌菌株的蛋白水解活性和酪水解模式存在差異。Mekmene 等[3]發(fā)現(xiàn)瑞士乳桿菌水解酪蛋白時(shí)，對(duì)于β-酪蛋白的水解速度快于αs1-酪蛋白，而菌株間對(duì)于αs1-酪蛋白的水解速度則具菌株特異性。Jensen 等[7]的研究結(jié)果表明：瑞士乳桿菌對(duì)牛奶中各酪蛋白組分的水解偏好因菌株而異，且在水解度上有較大差異。同時(shí)，研究表明乳酸菌水解乳蛋白后可產(chǎn)生多種生物活性肽，目前已在發(fā)酵乳[8]和奶酪[9]中鑒定出多種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制肽，其中三肽VPP 和IPP 經(jīng)臨床證明具有抗高血壓特性[10-11]。研究還表明不同的市售發(fā)酵乳的ACE 抑制活性有差異[12]，這可能與發(fā)酵菌株對(duì)底物水解的差異有關(guān)。

雖然目前對(duì)部分瑞士乳桿菌菌株的水解特性有所了解，但是多數(shù)研究對(duì)于瑞士乳桿菌蛋白水解能力的評(píng)價(jià)局限于切割位點(diǎn)的差異性，少有研究通過肽組學(xué)來表征菌株切割區(qū)域的偏好差異。本研究選取兩株蛋白水解能力較強(qiáng)的瑞士乳桿菌，研究其在牛脫脂乳中發(fā)酵對(duì)酪蛋白的水解差異，并通過肽組學(xué)來評(píng)估酶裂解模式差異及產(chǎn)物特異性，評(píng)價(jià)其ACE 肽的生成情況，解析其蛋白水解基因的差異性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)試劑 脫脂乳粉，上海光明乳業(yè)有限公司；熒光標(biāo)記酪蛋白，美國Thermo Fisher Scientific 公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒P0010，上海碧云天有限公司；Pierce 肽定量試劑盒，美國Thermo Fisher Scientific 公司；Bis-Tris-Propane，BBI 生命科學(xué)有限公司；二硫蘇糖醇，阿拉丁試劑有限公司；胰蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乙酸鈉、酵母浸粉、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、檸檬酸氫二銨、K2HPO4·3H2O、吐溫-80、瓊脂粉、氯化鈉、尿素、檸檬酸鈉二水合物、三氯乙酸、鹽酸，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、三氟乙酸，色譜純。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 本文所使用的兩株瑞士乳桿菌保藏于江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心CCFM 菌庫，其基因組信息已經(jīng)上傳至NCBI，樣品編號(hào)為PRJNA555465。菌株具體信息如表1所示。

表1 試驗(yàn)菌株信息Table 1 Information of strains used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 2695 高效液相色譜儀，美國Waters公司；多功能酶標(biāo)儀Varioskan LUX，美國Thermo Fisher Scientific 公司；ST3100 型pH 計(jì)，常州奧豪斯儀器有限公司；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（液相型號(hào)為 nLC 1200，質(zhì)譜型號(hào)為 Q Exactive），美國Thermo Fisher Scientific 公司；HWS-150 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SWCJ-1FD 型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；AW500SG 型厭氧工作站，英國依萊泰科公司；5424 R 型冷凍離心機(jī)，Eppendorf 儀器有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)TGL-16M、臺(tái)式高速離心機(jī)TG16A，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)條件 菌株在MRS 培養(yǎng)基37 ℃連續(xù)活化3 代后，接種于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11%的脫脂乳中再進(jìn)行2 輪活化，培養(yǎng)條件為37 ℃。隨后用50 mmol/L Tris-HCl（pH 6.5）洗滌細(xì)胞2 次，并調(diào)整活菌數(shù)至1×108～5×108CFU/mL，以2%的接種量接種于11%的脫脂乳粉，37 ℃培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行試驗(yàn)培養(yǎng)。MRS 培養(yǎng)基需要115 ℃高壓滅菌20 min，脫脂乳配制完畢后在4 ℃放置12 h 進(jìn)行水合，隨后進(jìn)行105 ℃滅菌10 min 待用。

1.3.2 酪蛋白利用情況測(cè)定 參考Xu 等[13]的方法并進(jìn)行修改。用反向高效液相色譜（RP-HPLC）對(duì)瑞士乳桿菌發(fā)酵過程中酪蛋白主要成分的利用情況進(jìn)行測(cè)定。取發(fā)酵至0，12 和24 h 的樣品，參照以上方法進(jìn)行預(yù)處理后過0.45 μm 的尼龍膜。色譜條件：色譜柱為Xbridge Peptide BEH C18為（300 A，3.5 μm），流動(dòng)相A 中乙腈∶水∶三氟乙酸的比例為100∶900∶1（V/V/V），流動(dòng)相B 中乙腈∶水∶三氟乙酸的比例為900∶100∶0.7（V/V/V），采用梯度洗脫方式。洗脫梯度為30%～40%B，0～35 min；40%～30%B；35～40 min；30%B，保持5 min。檢測(cè)器為紫外（UV）檢測(cè)器，檢測(cè)波長為220 nm，上樣量為20 μL，流速為0.8 mL/min，柱溫30 ℃，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。

1.3.3 多肽分子質(zhì)量的測(cè)定 參照陳嘉琪[14]的方法并進(jìn)行修改。采用尺寸排阻（SEC）色譜的方法測(cè)定肽分子質(zhì)量分布情況。樣品預(yù)處理：取不同發(fā)酵時(shí)間的脫脂乳，用10%的TCA 將其pH 值調(diào)至4.6，12 000×g，4 ℃離心10 min，取上清液，用0.45 μm 的尼龍膜過濾。色譜條件參照以上方法。用肽定量試劑盒測(cè)定總肽含量，根據(jù)前處理濃度變化計(jì)算不同樣品的肽濃度。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。

1.3.4 肽譜的測(cè)定 將1.3.3 節(jié)收集的肽用截留分子質(zhì)量為10 ku 的超濾膜以4 000×g，4 ℃離心15 min，收集濾過液。測(cè)定肽濃度后根據(jù)Raveschot等[15]的方法，用Hypersep C18 微柱對(duì)樣品進(jìn)行脫鹽處理，純化后的肽通過蒸發(fā)離心在40 ℃下干燥2 h，然后在流動(dòng)相A（0.1%甲酸和2%乙腈）中重新溶解。色譜條件：流動(dòng)相B 為0.1%甲酸和90%乙腈；色譜柱為Acclaim PepMapTM RSLC（50 μm×15 cm，C18，2 μm，100 ?），洗脫梯度為6%～20%B，0～40 min；20%～32%B，40～52 min；32%～80%B，52～56 min，流速為0.2 μL/min。洗脫后的多肽直接電離進(jìn)行全連續(xù)MS 掃描，然后進(jìn)行3 次MS/MS 掃描。MS 分析采用正離子和數(shù)據(jù)依賴分析（DDA） 模式，MS 光譜采集范圍為m/z 150～2 000，MS/MS 數(shù)據(jù)采集范圍為m/z 180～2 000，掃描時(shí)間為0.1 s。通過Maxquant 1.5.2.8 進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，使用Uniprot 中來源于Bos taurus 的數(shù)據(jù)庫。使用非特定的酶裂解模式，設(shè)置了以下參數(shù)：質(zhì)量容許度，0.02 u；從頭合成容許度為0.01‰；MS/MS 的脫同位素容許度為0.007‰。蛋白質(zhì)、肽譜匹配的假發(fā)現(xiàn)率（FDR）閾值設(shè)置為1%。根據(jù)Solieri 等[16]的方法來量化P1 和P1' 位點(diǎn)上某個(gè)氨基酸的裂解概率以及對(duì)裂解的正負(fù)效應(yīng)。

1.3.5 菌株蛋白水解基因的確定 使用Illumina HiSeq×10 平臺(tái)對(duì)瑞士乳桿菌的基因組進(jìn)行草圖測(cè)序，并使用SOAPdenovo 軟件進(jìn)行基因組組裝。之后，利用Glimmer 和GeneMarkS 軟件對(duì)序列進(jìn)行編碼，利用tRNAscan-SE v2.0 和Barrnap 軟件進(jìn)行tRNA 和核糖體RNA 序列預(yù)測(cè)。利用blastn工具對(duì)瑞士乳桿菌菌株的氨基酸序列與全基因組菌株CNRZ32 的胞壁蛋白酶基因、轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因和肽酶基因進(jìn)行BLAST 同一性百分比分析，同一性截點(diǎn)為98%。

1.3.6 發(fā)酵過程中菌株生長及產(chǎn)酸的測(cè)定 在0，3，9，12，15，24 h 取樣測(cè)定pH 值，并對(duì)樣品10倍梯度稀釋至合適數(shù)量級(jí)，采用平板點(diǎn)樣計(jì)數(shù)法測(cè)定菌株的活菌數(shù)。每個(gè)菌株相同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定3次。

1.3.7 發(fā)酵過程中蛋白酶酶活測(cè)定 細(xì)胞懸浮液的制備：參考Miyamoto 等[17]的方法并進(jìn)行修改。取0，6，12，24 h 的發(fā)酵脫脂乳30 mL，按1∶10 的比例加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的檸檬酸鈉溶液洗滌，10 000×g，4 ℃離心15 min，用10 倍體積含有5 mmol/L CaCl2的NaCl 溶液洗滌3 次，完成后，用100 mmol/L 磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）重懸至OD560=10 備用。胞壁蛋白酶酶活的測(cè)定：參照Stefanovic等[18]的方法并進(jìn)行修改。用熒光酪蛋白進(jìn)行胞壁蛋白酶活力的測(cè)定。在熒光專用96 孔板中加入100 μL 樣品以及100 μL 工作液，37 ℃放置1 h，測(cè)定激發(fā)/吸收波長為485/538 nm 處的熒光強(qiáng)度。同時(shí)用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白含量。菌株的胞壁蛋白酶酶活用每毫克蛋白增加的熒光強(qiáng)度表示，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析及數(shù)據(jù)處理 本文中所有圖形均采用Origin Pro 8.5 軟件繪制；采用 SPSS 22.0通過單因素方差分析（ANOVA）和95%置信區(qū)間的Duncan 檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，顯著性水平為P＜0.05。Upset 圖采用TBtools 繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過程中瑞士乳桿菌菌株對(duì)αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的利用情況

兩株瑞士乳桿菌菌株發(fā)酵脫脂乳12，24 h 樣品中αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的利用情況如圖1所示。隨著發(fā)酵時(shí)間從12 h 延長到24 h，αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的利用量逐漸增加。兩株菌株對(duì)αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的利用上并未出現(xiàn)顯著的偏好性差異。唯一的顯著性差別在于M108 對(duì)β-酪蛋白的利用度略高于7M3，在24 h 內(nèi)利用了6.33 mg/mL 的β-酪蛋白（約為7M3 利用量的3 倍）；在發(fā)酵過程中，這兩株菌株對(duì)αs1-酪蛋白的水解情況無明顯差異。

圖1 7M3 和M108 發(fā)酵過程中對(duì)αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的利用率Fig.1 The αs1-CN and β-CN utilization of Lactobacillus helveticus 7M3 and M108 during fermentation

2.2 發(fā)酵過程中肽分子質(zhì)量分布情況

試驗(yàn)菌株發(fā)酵12 h 和24 h 后的肽分子質(zhì)量分布及其含量如圖2所示，兩株瑞士乳桿菌無論是在肽含量還是不同分子質(zhì)量肽的分布上都有明顯差異。脫脂乳中的肽質(zhì)量濃度為（4.75±0.10）mg/mL，發(fā)酵過程中兩株瑞士乳桿菌的總肽濃度都呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，M108 在12 h 的總肽含量為（5.99±0.60）mg/mL，隨后在24 h 內(nèi)下降到（5.04±0.40）mg/mL，而在24 h 時(shí)7M3 的樣品中肽含量低于脫脂乳。

圖2 菌株7M3 和M108 發(fā)酵過程中不同分子質(zhì)量肽的分布和濃度Fig.2 Distribution and concentration of varying molecular weight peptides with strains 7M3 and M108

除了含量變化外，發(fā)酵還導(dǎo)致了樣品中不同分子質(zhì)量肽的比例發(fā)生了動(dòng)態(tài)變化。脫脂乳中的肽分子質(zhì)量在2 000 u 以上和2 000 u 以下的多肽含量大致相等，主要以180～500 u 和2 000～10 000 u 的肽片段為主。但在發(fā)酵過程中，不同發(fā)酵時(shí)間下7M3 和M108 樣品中多肽分布存在差異性。發(fā)酵12 h 的樣品中以2 000～10 000 u 的肽片段為主，而發(fā)酵24 h 后，樣品中180～500 u 的多肽含量逐漸增大。

2.3 發(fā)酵樣品的肽異質(zhì)性

選取發(fā)酵24 h 后的樣品進(jìn)行肽組分析，肽種類及特異性肽在相應(yīng)蛋白序列上的分布情況如圖3、圖4所示。在7M3 和M108 發(fā)酵24 h 的樣品中，分別共鑒定出432 個(gè)和353 個(gè)多肽，大部分肽來源于酪蛋白中最豐富的組分：αs1-酪蛋白（34%）和β-酪蛋白（45%），其中7M3 積累的多肽組成更多樣化。在鑒定到的多肽中，33%的多肽為特異性肽，包括45 種來自7M3、16 種來自M108的源于β-酪蛋白的特異性肽；21 種來自7M3、25種來自M108 的源于αs1-酪蛋白的特異性肽；而來源于κ-酪蛋白和αs2-酪蛋白的肽較少（圖3）。

圖3 24 h 菌株7M3 和M108 發(fā)酵乳中鑒定到的肽段數(shù)量Fig.3 Number of peptides identified from strains 7M3 and M108 in 24 h fermented milk

兩株瑞士乳桿菌的源于αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的多肽異質(zhì)性解析如圖4所示，其偏好水解區(qū)域（熱圖上的深灰色區(qū)域）呈現(xiàn)顯著性差異。兩株瑞士乳桿菌對(duì)αs1-酪蛋白的裂解產(chǎn)物具有一定的重疊度，但7M3 主要水解αs1-酪蛋白C 端的f176～193 區(qū)域（呈現(xiàn)無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)），而M108 的水解區(qū)域集中于f2-22 和f85-106 等疏水性區(qū)域。7M3 和M108 對(duì)于β-酪蛋白的水解位點(diǎn)偏好差異更大，7M3 的樣品中含有豐富的來自f40-55、f78-99、f131-142 和f144-163 區(qū)域的多肽，與以往研究中產(chǎn)ACE 抑制活性肽的區(qū)域重合（f58-90、130-140）[19]。

圖4 24 h 發(fā)酵乳中來源于αs1-酪蛋白（上）和β-酪蛋白（下）的特異性肽及其在蛋白序列上的分布Fig.4 Distribution of specific peptides derived from alphas1-CN and beta-CN in the 24 h fermentation milk of two strains

與已有報(bào)道比對(duì)發(fā)現(xiàn)，7M3 和M108 樣品中分別含有13 和11 種ACE 抑制肽，其中有9 種二者共有（表2）。7M3 的特異性ACE 抑制肽中TPVVVPPFLQP 和VPP 來源于7M3 偏好切割的區(qū)域f78-99，其中VPP 已被證實(shí)具有體內(nèi)降血壓功能。于洋等[12]對(duì)4 種市售發(fā)酵乳中的ACE 抑制肽進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)ACE 抑制活性最高的發(fā)酵乳含有4 種ACE 抑制肽，其中TPVVVPPFLQP 在我們的發(fā)酵物中也被鑒定到。

表2 24 h 發(fā)酵乳中的ACE 抑制肽Table 2 ACE-inhibitory peptides generated from bovine casein in the 24 h fermentation milk of two strains

2.4 酪蛋白裂解位點(diǎn)特異性分析

P1 和P1'位點(diǎn)氨基酸殘基對(duì)試驗(yàn)菌株裂解概率的影響如圖5所示。7M3 和M108 對(duì)兩種酪蛋白組分表現(xiàn)出不同的切割偏好性。在αs1-酪蛋白中，當(dāng)P1 位點(diǎn)為D、R、F、P、I、Q、L 等氨基酸時(shí)，菌株對(duì)裂解概率的影響為正，其中M108 主要對(duì)帶負(fù)電荷的D、R、F 和疏水性的P 表現(xiàn)出更多的裂解偏好（圖5a）。C 端含有疏水氨基酸F、P、L 被認(rèn)為是有效的ACE 抑制肽的特征[20]，同時(shí)帶正電氨基酸R 的存在可以增加ACE 抑制活性[20]。P1' 位點(diǎn)的氨基酸R 對(duì)裂解具有最強(qiáng)的正向作用，氨基酸G、D、K、H 和F 也表現(xiàn)出正向作用，但作用裂解影響較低（圖5b）。

β-酪蛋白的裂解模式與αs1-酪蛋白有顯著差異。多肽在P1 位點(diǎn)含有氨基酸W 時(shí)被裂解的概率最高，而對(duì)αs1-酪蛋白裂解有負(fù)效應(yīng)的氨基酸M、N、T 對(duì)β-酪蛋白有輕微的正效應(yīng)（圖5c）。在P1' 位點(diǎn)，氨基酸T、D、H 和W 均對(duì)裂解有積極作用，不同的是D 對(duì)M108 的裂解表現(xiàn)出更積極的作用，而7M3 更傾向于裂解P1'位點(diǎn)含T 的肽（圖5d）。

圖5 瑞士乳桿菌7M3 和M108 對(duì)P1 和P1' 位點(diǎn)氨基酸的裂解偏好Fig.5 Cleavage preferences of two strains for amino acids at the P1 and P1' subsites

綜合上述分析得知，7M3 和M108 對(duì)αs1-酪蛋白和β-酪蛋白表現(xiàn)出不同的偏好切割模式，這可能與由其蛋白酶、肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、肽酶等特性有關(guān)。

2.5 菌株的蛋白水解相關(guān)基因鑒定

兩株瑞士乳桿菌的蛋白水解相關(guān)基因如表3所示。結(jié)果顯示瑞士乳桿菌7M3 和M108 在蛋白酶、肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、肽酶等相關(guān)基因分布上存在差異性。7M3 和M108 都擁有單一的胞壁蛋白酶基因，但其分別為prtH2 和prtH3。另外，在兩株瑞士乳桿菌中都鑒定到了寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Opp；但是轉(zhuǎn)運(yùn)長度為2～9 個(gè)氨基酸殘基的肽的Dpp 僅存在于M108 中，而二、三肽離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)DtpT 只存在于7M3 中。對(duì)于肽酶而言，除了pepL 外，其余14 種肽酶都存在于這兩株瑞士乳桿菌中，這證實(shí)了肽酶相對(duì)保守的說法[2]。

表3 試驗(yàn)菌株中蛋白酶、肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和肽酶的分布情況Table 3 Distribution of proteinase，peptide transporters and peptidases of the proteolytic system in experimental strains

有研究提出CEP 差異會(huì)帶來菌株蛋白質(zhì)水解能力的不同，當(dāng)菌株含有prtH 和prtH2 兩個(gè)胞壁蛋白酶時(shí)，其蛋白水解活性顯著高于僅含有prtH 的菌株[3]。CEP 差異帶來的分解模式的多樣性也已被證實(shí)，含有prtH2 和prtH3 基因的菌株與含有prtH1 菌株發(fā)酵后的產(chǎn)物有明顯差異[15]。轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的差異也代表著菌株的吸收多樣性，二、三肽和寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的特異性在乳酸乳球菌中已被證實(shí)[21]，而目前對(duì)于瑞士乳桿菌中轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的特異性還少有研究。因此推測(cè)上述肽的異質(zhì)性是由于7M3 和M108 胞壁蛋白酶及轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)差異。而特定胞壁蛋白酶對(duì)酪蛋白的切割效率和位點(diǎn)及不同轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運(yùn)特異性還需要更多的試驗(yàn)去驗(yàn)證，這可能幫助我們篩選出高蛋白水解效率的基因組合，并從產(chǎn)物角度評(píng)估其對(duì)產(chǎn)品的潛在價(jià)值。

2.6 發(fā)酵過程中瑞士乳桿菌菌株的蛋白酶活性和生長特性

在發(fā)酵過程中兩株瑞士乳桿菌菌株的生長特性和胞壁蛋白酶酶活如圖6所示。發(fā)酵過程中兩株瑞士乳桿菌胞壁蛋白酶酶活特性顯著不同，而生長呈現(xiàn)相似趨勢(shì)。在12 h 內(nèi)，7M3 和M08 呈現(xiàn)相似的生長速率，但是在12～24 h 內(nèi)M108 的生長速率大于7M3。M108 在對(duì)數(shù)前期（6 h）達(dá)到酶活最高點(diǎn)（2 120 熒光/mg 蛋白），隨后酶活顯著下降。相反，7M3 在整個(gè)發(fā)酵過程中保持相對(duì)較低但穩(wěn)定的酶活。胞壁蛋白酶作為蛋白水解的第一步，M108 的高酶活可能促進(jìn)了菌株對(duì)β-酪蛋白的水解。但是胞壁蛋白酶的切割特異性是否會(huì)對(duì)菌株生長代謝產(chǎn)生影響并表現(xiàn)出酶活差異還需要進(jìn)一步去驗(yàn)證。

圖6 發(fā)酵過程中菌株生長和胞壁蛋白酶活性的變化Fig.6 Growth and cell-envelope protease activity during fermentation of the strains 7M3 and M108

3 結(jié)論

研究表明瑞士乳桿菌對(duì)αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的水解無顯著偏好，但M108 對(duì)β-酪蛋白具有更強(qiáng)的蛋白水解和產(chǎn)肽能力。不同肽分子質(zhì)量的肽濃度在發(fā)酵過程中呈動(dòng)態(tài)變化，分子質(zhì)量在180～500 u 的小肽先消耗后積累，而分子質(zhì)量為2 000～10 000 u 的肽段變化趨勢(shì)則完全相反。對(duì)24 h 的發(fā)酵乳的肽譜表明7M3 和M108 表現(xiàn)出肽的異質(zhì)性，前者產(chǎn)生更多特異性肽，其中大部分來自β-酪蛋白的f78-99 區(qū)域，如ACE 抑制肽VPP。二者來源于αs1-酪蛋白的特異性肽也分布于序列的不同區(qū)域，7M3 偏好切割C 端，而M108 產(chǎn)生的肽主要來源于N 端和中間區(qū)域。對(duì)鑒定到的肽進(jìn)行P1 和P1' 位點(diǎn)的氨基酸切割偏好分析，7M3 和M108 對(duì)不同酪蛋白表現(xiàn)出差異切割模式，其中M108 對(duì)αs1-酪蛋白的切割特點(diǎn)暗示其可能產(chǎn)生一些潛在ACE 抑制肽。兩株菌株的蛋白水解相關(guān)基因分布也存在差異，兩者含有不同的胞壁蛋白酶及差異轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，但其肽酶基因相對(duì)保守。發(fā)酵前期M108 呈現(xiàn)了較高胞壁蛋白酶酶活。