微生物利用無機(jī)氮生產(chǎn)有機(jī)氮

劉立明，許雪晨，郭 亮

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇無錫 214122）

在追求美好生活的新時(shí)代，人們對(duì)于食品的需求已經(jīng)從“保障供給”向“營(yíng)養(yǎng)健康”轉(zhuǎn)變[1]。今年“兩會(huì)”期間，習(xí)總書記指出：“發(fā)展生物科技、生物產(chǎn)業(yè)，向動(dòng)物、植物、微生物要熱量、要蛋白”。蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，是人體健康與生長(zhǎng)發(fā)育最重要的營(yíng)養(yǎng)素[2]。長(zhǎng)期以來，人們主要通過畜牧業(yè)獲取肉、蛋、奶等產(chǎn)品作為蛋白質(zhì)的主要來源[3]。然而，畜牧業(yè)占用了全球約1/3 的土地和約1/4 的淡水，并釋放了約15%的溫室氣體，難以滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的蛋白質(zhì)需求[4]。隨著合成生物學(xué)、代謝工程等新興生物技術(shù)的發(fā)展，對(duì)微生物細(xì)胞進(jìn)行理性設(shè)計(jì)與改造，構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠，利用可再生資源生產(chǎn)氨基酸，實(shí)現(xiàn)了向微生物要氨基酸[5-7]，合成單細(xì)胞蛋白實(shí)現(xiàn)了向微生物要蛋白[8-9]。

氮代謝不僅是微生物細(xì)胞的基本代謝過程，也是氨基酸和蛋白質(zhì)生物合成的關(guān)鍵瓶頸[10-11]。在微生物細(xì)胞中，NH4+在谷氨酸脫氫酶與谷氨酰胺合成酶等相關(guān)酶的作用下合成谷氨酸和谷氨酰胺，經(jīng)轉(zhuǎn)氨作用合成其它氨基酸，摻入蛋白質(zhì)合成[12-13]。本文重點(diǎn)關(guān)注銨的生物合成途徑，即向自然界要銨；介紹利用銨合成蛋白質(zhì)減量替代的氨基酸，即向微生物要氨基酸；利用氨基酸合成蛋白質(zhì)，即向微生物要蛋白，并展望未來利用微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)氨基酸與蛋白質(zhì)的發(fā)展方向。

1 微生物利用氮源生產(chǎn)銨鹽

氮元素是生物合成蛋白質(zhì)、核酸的關(guān)鍵元素[10]。氮在自然界中以氣態(tài)氮（N2、NO、N2O）、硝態(tài)氮（NO3-、NO2-）、聯(lián)氨（N2H4）、羥胺（NH2OH）等形式存在，微生物通過生物固氮、硝酸鹽同化等氮代謝途徑，將自然界中不同形式的氮轉(zhuǎn)變?yōu)镹H4+，從而摻入蛋白質(zhì)、核酸等有機(jī)氮的合成中（圖1）。

圖1 自然界中的氮循環(huán)Fig.1 Schematic diagram of the nitrogen cycle in nature

1.1 微生物利用氮?dú)馍射@鹽

固氮生物將空氣中氮?dú)膺€原為氨的過程，稱為生物固氮，每年固定的氮素量約占全球作物所需氮量的75%[14]。生物固氮依賴于固氮酶，在生物固氮過程中，鐵蛋白將電子傳遞給鉬鐵蛋白，鉬鐵蛋白再將電子傳遞給N2和質(zhì)子，生成NH3和H2[15-16]。提高微生物固氮效率的關(guān)鍵在于：在固氮微生物中提高固氮酶活性[17]，在非固氮微生物中引入固氮酶[18]。

通過對(duì)比分析5 種來源的固氮酶基因，發(fā)現(xiàn)棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii）鉬依賴型固氮酶是由14 個(gè)基因組成，位于基因組上2 個(gè)未連接區(qū) 域：包 含nifHDKTY、nifENX、nifSUVP、nifWZ、nifM 和nifF 的29 kb 的區(qū)域以及包含nifBQ 和nifAL 的6 kb 的區(qū)域[15]，其中nifH 是檢測(cè)環(huán)境中固氮微生物的標(biāo)記基因，nifDK 編碼活性中心含鉬的催化部分[19]，nifH、nifEN、nifQ、nifV 和nifB 負(fù)責(zé)鐵鉬輔因子（FeMoco）的生物合成，nifF 編碼黃素氧還原蛋白，nifUS 參與Fe-S 簇的形成，nifAL 則是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控基因[20]。在解析固氮酶基因功能的基礎(chǔ)上，發(fā)展了一系列提高固氮酶活性的方法，如改造轉(zhuǎn)錄因子nifL 和nifA。棕色固氮菌固氮基因簇在轉(zhuǎn)錄水平上受雙組份調(diào)控因子nifLA 調(diào)控，敲除nifL 或者強(qiáng)化nifA 的表達(dá)，能有效增加胞內(nèi)nifH 的mRNA 水平，增強(qiáng)固氮酶活性，使培養(yǎng)液中銨濃度增加到35 mmol/L[20]。另一個(gè)例子是在褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）中，利用組成型啟動(dòng)子控制正調(diào)控因子NifA表達(dá)，并通過部分敲除失活負(fù)調(diào)控因子NifL，提高固氮酶活性，將工程菌株應(yīng)用于小麥的生產(chǎn)，使小麥產(chǎn)量增加60%[17]。

如何借助合成生物學(xué)的方法，將固氮途徑引入非固氮微生物，提高非固氮微生物的固氮能力成為研究熱點(diǎn)。1972年，科研人員首次將肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）的固氮基因組簇nif 克隆到大腸桿菌（Escherichia coli），獲得具有生物固氮能力的大腸桿菌[21]。由于存在固氮酶活性低、能量供應(yīng)不足等問題，因此MIT 的Christopher A Voigt 團(tuán)隊(duì)將產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌（Klebsiella oxytoca）固氮酶系統(tǒng)的16 個(gè)基因分為103 個(gè)部分，通過改變啟動(dòng)子占有率、基因順序和基因方向等方法，在大腸桿菌中從頭設(shè)計(jì)了122個(gè)突變體，并根據(jù)設(shè)計(jì)-構(gòu)建-檢測(cè)-學(xué)習(xí)循環(huán)優(yōu)化了固氮酶系統(tǒng)，最終使其固氮效率達(dá)到對(duì)照產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌的57%[7]。微生物固氮酶系統(tǒng)每固定一個(gè)氮?dú)夥肿有枰?6 個(gè)ATP 和8 個(gè)高能電子[22]，造成微生物細(xì)胞內(nèi)能量供應(yīng)嚴(yán)重不足。為此，將來源于類芽孢桿菌WLY78（Paenibacillus sp.WLY78）的固氮酶導(dǎo)入大腸桿菌，其固氮酶活性僅為原菌株的10%。在大腸桿菌中將來源于類芽孢桿菌WLY78 的電子傳遞鏈蛋白（pfoABfldA）和產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌來源的鐵-硫原子簇蛋白（nifSU）進(jìn)行重組，使固氮酶的活性提高了5 倍[23]。為了進(jìn)一步強(qiáng)化固氮酶系統(tǒng)的能量供給，將固氮酶系統(tǒng)分為電子傳遞鏈模塊、金屬原子簇模塊及固氮酶核心模塊3 個(gè)模塊。針對(duì)電子傳遞鏈模塊，將固氮酶系統(tǒng)中負(fù)責(zé)電子傳遞的模塊替換植物葉綠體的電子傳遞鏈模塊，同時(shí)將固氮酶系統(tǒng)電子傳遞鏈與線粒體來源的電子傳遞鏈組成功能性雜合的電子傳遞鏈模塊，均有效提高了能量供應(yīng)[18]。

1.2 微生物利用硝態(tài)氮生成銨鹽

微生物利用硝酸鹽的途徑主要包括硝酸鹽同化途徑和硝酸鹽異化還原途徑，將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。硝酸鹽同化途徑主要存在于藻類、藍(lán)細(xì)菌和植物中，其過程是硝酸鹽在ATP 依賴的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用下轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，再由細(xì)胞質(zhì)中的硝酸鹽還原酶（NAS）還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽通過電子傳遞鏈進(jìn)一步被還原為銨[24-25]。然而，在富銨環(huán)境下，NAS 的表達(dá)會(huì)受到顯著抑制。若NAS 在其它細(xì)胞器中，則不存在NAS 表達(dá)受到抑制這個(gè)問題，如：在結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）中發(fā)現(xiàn)了膜錨定硝酸鹽還原酶系統(tǒng)（NAR），可以在周質(zhì)空間中進(jìn)行硝酸鹽的高效同化[26]。硝酸鹽異化還原途徑主要存在兼性厭氧菌中，硝酸鹽作為呼吸鏈的最終氫受體，被還原為亞硝酸鹽，從而用于呼吸作用。膜錨定硝酸鹽還原酶系統(tǒng)（NAR） 和周質(zhì)空間硝酸鹽還原酶系統(tǒng)（NAP）都可以催化硝酸鹽異化還原反應(yīng)[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，脫氮副球菌（Paracoccus denitrifican）同時(shí)具有NAR 和NAP 兩種酶系統(tǒng)[24]。NAR 系統(tǒng)在細(xì)胞質(zhì)中還原硝酸鹽，并將質(zhì)子釋放進(jìn)細(xì)胞周質(zhì)中，產(chǎn)生的質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力直接促進(jìn)能量的生成；NAP 系統(tǒng)還原硝酸鹽為亞硝酸鹽的過程發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)周質(zhì)中，不會(huì)發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移。硝酸鹽異化還原途徑可與甲烷、硫化物和氫氣等電子供體的氧化耦合生成亞硝酸鹽。

微生物細(xì)胞能將亞硝酸鹽還原為銨和一氧化氮。由于還原為銨對(duì)微生物生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，因此它是微生物利用亞硝酸鹽的主要途徑。亞硝酸鹽異化還原為銨是硝酸鹽異化還原為銨（DNRA）途徑（NO3-→NO2-→NH4+）的關(guān)鍵反應(yīng)，當(dāng)環(huán)境中的鐵、氫氣、硫化物等和硝酸鹽相關(guān)的電子供體大量存在時(shí)，微生物可以利用DNRA 作用耦合電子供體的氧化來生長(zhǎng)[27-28]。這一過程由位于周質(zhì)空間中細(xì)胞色素c 亞硝酸鹽還原酶（ccNIR）、八面體血紅素亞硝酸鹽還原酶（ONR）[29]和八面體血紅素連四硫酸鹽還原酶（OTR）[30]3 個(gè)酶所催化。此外，在胎兒彎曲菌（Campylobacter fetus）中，發(fā)現(xiàn)只含羥胺氧化酶（HAO）而不含亞硝酸鹽還原酶，也可以將亞硝酸鹽還原為銨，推測(cè)這一反應(yīng)是由HAO 催化[31]。

1.3 微生物利用其它形式氮生產(chǎn)銨鹽

一氧化氮、一氧化二氮、羥胺和聯(lián)氨等形式的氮是氮循環(huán)的重要組成部分，微生物可以通過多種氮代謝途徑將這些形式的氮轉(zhuǎn)變?yōu)榈獨(dú)?，再利用生物固氮過程將這些形式的氮轉(zhuǎn)變銨：1） 一氧化氮被一氧化氮還原酶還原為一氧化二氮和氮?dú)?，一氧化氮還原酶以多種形式存在于多種微生物中，如在脫硫弧菌（Desulfovibrio gigas）中是黃銅二鐵-一氧化氮還原酶[32]，在大腸桿菌中是雜合蛋白HCP[33]，在尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）中是NADH 依賴型黃素蛋白P450[34]。2）羥胺氧化還原酶（HAO）將羥胺轉(zhuǎn)化為一氧化氮，再借助一氧化氮轉(zhuǎn)化途徑和固氮途徑生成銨鹽。在消化螺菌（Nitrospira spp）及其它氨氧化細(xì)菌中，發(fā)現(xiàn)10余種羥胺還原酶類似蛋白[35]，其中一種羥胺氧化酶[36]（HOX）可催化羥胺氧化為一氧化氮。然而，最近研究表明，HAO 并非將羥胺直接催化為一氧化氮，而是將其催化為亞硝酸鹽，而后在未知酶的作用下生成一氧化氮[37]。3）聯(lián)氨脫氫酶（HDH）將聯(lián)氨氧化成氮?dú)鈁38-39]，氮?dú)庠谖⑸锕痰緩降淖饔孟律射@鹽。進(jìn)一步分析HDH 的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，其與羥胺氧化還原酶（HAO） 和羥胺氧化酶（HOX）具有相似的序列[39]。

2 微生物生產(chǎn)飼用氨基酸

隨著人民生活水平不斷提高，動(dòng)物產(chǎn)品的人均消費(fèi)量逐年增加，2021年我國(guó)人均肉類、禽蛋、奶類消費(fèi)量分別為70，24，42 kg，導(dǎo)致2021年我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)消耗4.5 億t 飼料，其中豆粕（蛋白）消耗量為6 800 萬t，占比15.3%；導(dǎo)致2021年我國(guó)大豆進(jìn)口量為9 652 萬t，對(duì)外依存度為85.66%，嚴(yán)重威脅養(yǎng)殖行業(yè)的健康發(fā)展。在中美貿(mào)易摩擦的背景下，如何減少豆粕使用，對(duì)保障養(yǎng)殖行業(yè)健康發(fā)展和人民生活水平提高具有重要意義。2021年3月，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦減少豆粕用量的重要舉措之一是：在飼糧中補(bǔ)充必需氨基酸，降低動(dòng)物日料中蛋白質(zhì)水平。小品種氨基酸的添加能有效提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能，改善腸道微生物，提高免疫力、減緩應(yīng)激，在降本增效中發(fā)揮著重要作用。

2.1 飼用氨基酸高產(chǎn)菌株構(gòu)建技術(shù)

基于基因-蛋白-生化反應(yīng)以及組學(xué)數(shù)據(jù)，將細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)字化、模型化，搭建了基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型（GSMM）[40]，可在計(jì)算機(jī)中模擬細(xì)胞代謝，預(yù)測(cè)氨基酸的最佳合成途徑，設(shè)計(jì)菌種改造策略，指導(dǎo)氨基酸高產(chǎn)菌株構(gòu)建[41]。如在大腸桿菌代謝模型iML1515[42]的基礎(chǔ)上，利用GECKO 方法[43]整合酶學(xué)動(dòng)力參數(shù)kcat值，構(gòu)建大腸桿菌酶約束模型（ec_iML1515）。利用酶約束模型ec_iML1515，預(yù)測(cè)賴氨酸合成過程中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)前體積累、產(chǎn)物合成路徑和能量供給是制約賴氨酸合成的關(guān)鍵靶點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上。利用模塊化工程策略對(duì)預(yù)測(cè)的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控，使賴氨酸產(chǎn)量增加到193.6 g/L[41]（圖2a）。

為了平衡氨基酸高產(chǎn)菌株中代謝流分配，研究人員建立了一系列代謝流靜態(tài)調(diào)控方法，實(shí)現(xiàn)氨基酸生產(chǎn)菌株的代謝流精細(xì)調(diào)控。例如，采用啟動(dòng)子工程平衡L-色氨酸前體磷酸烯醇式丙酮酸、赤蘚糖-4-磷酸和絲氨酸的供給，將L-色氨酸產(chǎn)量提高到52.1 g/L[5]。為了同時(shí)調(diào)控多個(gè)基因表達(dá)，研究人員開發(fā)了具有切割DNA 和RNA 的雙重功能的CRISPR/Cpf1，Cpf1 可以切割gRNA 陣列使其成為單個(gè)成熟的gRNA，同時(shí)靶向多個(gè)靶基因[44]。利用DNA 切割功能失活的dCpf1 和gRNA陣列，將賴氨酸合成途徑中的檸檬酸合酶（gltA）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（pck）、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（pgi）和高絲氨酸脫氫酶（hom）同時(shí)弱化不低于90%，將賴氨酸產(chǎn)量提高了4 倍[44]。然而，靜態(tài)調(diào)控策略會(huì)造成細(xì)胞代謝負(fù)擔(dān)，引起微生物細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢與代謝失衡等[45-46]。為此，開發(fā)了一系列基于生物傳感器的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略：物理信號(hào)（光、溫度）、化學(xué)信號(hào)（pH 值、溶氧）和生物信號(hào)（細(xì)胞生長(zhǎng)濃度）[45-46]。例如，在大腸桿菌中利用溫度敏感型元件（cIts-pR-pL）和調(diào)節(jié)蛋白（tetRPLtetO-1），開發(fā)了基于溫度敏感型的動(dòng)態(tài)調(diào)控技術(shù)，動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)丙酮酸羧化酶（PYC），平衡代謝流在細(xì)胞生長(zhǎng)和蘇氨酸合成之間的平布。在發(fā)酵起始階段，通過溫度控制關(guān)閉PYC 表達(dá)，使代謝流進(jìn)入TCA 循環(huán)用于生長(zhǎng)；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到一定階段，通過升高溫度開啟PYC 表達(dá)，使代謝流經(jīng)丙酮酸羧化為草酰乙酸用于蘇氨酸合成，最終使L-蘇氨酸產(chǎn)率提高到124.03%[47]（圖2a）。此外，由于氨基酸高產(chǎn)菌株復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，僅依靠已知靶點(diǎn)的疊加調(diào)控，無法實(shí)現(xiàn)目標(biāo)氨基酸代謝流的最大化。為此，在蛋氨酸合成菌株中，建立了包含中心代謝路徑和氨基酸合成路徑中80 個(gè)候選靶點(diǎn)的基因庫(kù)，并利用CRISPRi 技術(shù)對(duì)候選靶點(diǎn)基因進(jìn)行調(diào)控，獲得影響蛋氨酸合成的關(guān)鍵靶點(diǎn)。根據(jù)模塊化工程策略，將蛋氨酸生物合成途徑分為：碳模塊、硫模塊和一碳模塊，并利用CRISPRi 技術(shù)對(duì)蛋氨酸合成模塊進(jìn)行多層次調(diào)控，最終使蛋氨酸的產(chǎn)量提升到16.86 g/L[48]。

2.2 飼用氨基酸高產(chǎn)菌株高通量篩選技術(shù)

為了快速獲得生產(chǎn)性能顯著提升的氨基酸高產(chǎn)菌株，研究人員開發(fā)了與目標(biāo)氨基酸智能適配的生物傳感器，將胞內(nèi)或胞外的氨基酸濃度信號(hào)轉(zhuǎn)化為易于檢測(cè)的熒光信號(hào)[49]或細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)[50]，從而提高高產(chǎn)菌種篩選效率。如在L-賴氨酸高產(chǎn)菌株篩選中，構(gòu)建了由響應(yīng)賴氨酸的啟動(dòng)子元件pA 和綠色熒光蛋白（GFP）組成的表達(dá)元件pAG，將胞內(nèi)賴氨酸濃度轉(zhuǎn)化為易于檢測(cè)的綠色熒光蛋白信號(hào)。利用pAG 元件和綠色熒光蛋白強(qiáng)度的變化，從1 000 萬個(gè)突變庫(kù)中篩選到186 株有益突變體，進(jìn)一步通過96 孔板篩選到大腸桿菌MU-1和大腸桿菌MU-2 菌株，L-賴氨酸產(chǎn)量達(dá)到136.51 g/L 和133.29 g/L[49]。由于基于RNA 適配器具有折疊復(fù)雜結(jié)構(gòu)的靈活性，開發(fā)了響應(yīng)L-色氨酸的RNA 適配器，并利用黃色熒光蛋白建立了高產(chǎn)L-色氨酸菌株的高通量篩選平臺(tái)，成功獲得1 株L-色氨酸產(chǎn)量提高165.9%的高產(chǎn)菌株大腸桿菌K3mu1[51]。此外，研究人員根據(jù)培養(yǎng)環(huán)境氨基酸匱乏時(shí)，稀有密碼子tRNAs 無法完全翻譯的“密碼子偏好性”規(guī)律，建立了基于富含稀有密碼子的氨基酸高產(chǎn)菌株篩選系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過將報(bào)告蛋白或耐藥標(biāo)記中的密碼子替換為稀有密碼子，提高蛋白翻譯過程中對(duì)胞內(nèi)氨基酸的“門檻值”，實(shí)現(xiàn)了亮氨酸、精氨酸和絲氨酸等氨基酸高產(chǎn)菌株的高通量篩選[50]（圖2b）。

2.3 飼用氨基酸高產(chǎn)菌株環(huán)境適應(yīng)性提升技術(shù)

提升高產(chǎn)菌種對(duì)工業(yè)環(huán)境的環(huán)境適應(yīng)性，能顯著提高菌種生產(chǎn)性能[52]。利用誘變育種與適應(yīng)性進(jìn)化策略，獲得具有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的氨基酸高產(chǎn)菌株，再通過反向代謝工程策略解析耐受機(jī)制，指導(dǎo)高產(chǎn)菌株的選育與構(gòu)建[52]。例如，通過常壓室溫等離子體（ARTP）誘變L-蘇氨酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌TRFC，獲得了抗噬菌體的L-蘇氨酸高產(chǎn)菌株大腸桿菌TRFC-AP，使L-蘇氨酸產(chǎn)量增加到159.3 g/L（提高了10.9%）。對(duì)高產(chǎn)菌株大腸桿菌TRFC-AP 的基因分析，發(fā)現(xiàn)噬菌體侵染基因（fhuA）的缺失是高產(chǎn)菌株產(chǎn)生噬菌體抗性的根本原因[53]。為了進(jìn)一步提高氨基酸生產(chǎn)菌種工業(yè)環(huán)境耐受性，開發(fā)了由脅迫誘導(dǎo)突變模塊組成的基因組復(fù)制工程輔助連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng)（GREACE），在脅迫環(huán)境下實(shí)現(xiàn)了“邊突變邊篩選”[54]。在GREACE 的基礎(chǔ)上，引入突變的DNA 聚合酶校對(duì)元件（DnaQ），使突變率增加了317 倍，并利用GREACE 技術(shù)篩選到突變菌株大腸桿菌RS3，將L-賴氨酸產(chǎn)量提高到155 g/L。研究人員進(jìn)一步利用基因組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)，解析突變菌株大腸桿菌RS3 耐受機(jī)制，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌RS3 通過前蛋白轉(zhuǎn)位酶（SecYM145V）、ATP 合酶亞基（AtpBS165N）和瓜丁胺酶（SpeBA302V）的突變，提高了大腸桿菌細(xì)胞在脅迫條件的完整性并強(qiáng)化了合成目標(biāo)化學(xué)品賴氨酸代謝流[52]（圖2c）。

圖2 代謝工程改造微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)飼用氨基酸Fig.2 Enhancing feed amino acid production by metabolic engineering in microbial cell factories

3 微生物生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，在人體健康與生長(zhǎng)發(fā)育過程中具有不可替代的作用。長(zhǎng)期以來，人們主要通過畜牧業(yè)獲取肉、蛋、奶等產(chǎn)品作為蛋白質(zhì)的主要來源。基于傳統(tǒng)畜牧業(yè)的蛋白生產(chǎn)能力，難以滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的蛋白質(zhì)需求。隨著合成生物學(xué)、系統(tǒng)代謝工程等新興生物技術(shù)的發(fā)展，人們開發(fā)了利用非致病和非產(chǎn)毒的酵母菌、真菌、藻類和細(xì)菌，生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，原料來源廣，培養(yǎng)周期短的單細(xì)胞蛋白（SCP），實(shí)現(xiàn)了向微生物要蛋白[9，55-56]（圖3）。

圖3 微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白Fig.3 Production of single cell protein by microbial cell factories

3.1 生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的微生物細(xì)胞

能生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的微生物有細(xì)菌、藻類、真菌和酵母。其中，細(xì)菌具有倍增時(shí)間短、生長(zhǎng)迅速，營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單、底物譜廣等優(yōu)點(diǎn)[55-56]。細(xì)菌單細(xì)胞蛋白含量約占細(xì)胞干重的40%～80%，且在氨基酸組成上優(yōu)于酵母或真菌單細(xì)胞蛋白。例如嗜甲基菌屬（Methylophilus spp）倍增時(shí)間僅為2 h，用其生產(chǎn)的單細(xì)胞蛋白能替代動(dòng)物飼料蛋白。此外，細(xì)菌在利用廢水中的碳、氮、硫、磷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白方面展現(xiàn)巨大的應(yīng)用潛力，如紫色光合細(xì)菌（Purple photosynthetic bacteria）可用于回收環(huán)境廢棄物中的有機(jī)物、氮和磷，用于生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白。然而，細(xì)菌通常體積小，分離困難，所獲得的蛋白質(zhì)不易消化。

藻類單細(xì)胞蛋白具有蛋白含量高（占細(xì)胞干重的50%～70%），富含脂肪酸、維生素、色素、多肽，核酸含量低（占細(xì)胞干重的3%～8%）等優(yōu)點(diǎn)[57]。藻類能利用太陽(yáng)光和CO2進(jìn)行生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化為碳水化合物，加上具有蛋白含量高、生長(zhǎng)速度快、栽培簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于飼料生產(chǎn)，如小球藻（Chlorella）和柵藻（Senedessmus）被用作魚類飼料[58]。藻類單細(xì)胞蛋白的缺點(diǎn)在于藻類細(xì)胞具有纖維質(zhì)的細(xì)胞壁，不易被人體消化；同時(shí)藻類培養(yǎng)過程中能富集一定量的重金屬，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。

真菌單細(xì)胞蛋白含量在30%～50%之間，含有豐富的蘇氨酸和賴氨酸，甲硫氨酸含量較低[57]。真菌單細(xì)胞蛋白還可以提供核黃素、煙酸、硫胺素、生物素、泛酸等多種維生素。如1985年Marlow Foods（GB）公司推出的威尼斯鐮刀菌（Fusarium venenatum）單細(xì)胞蛋白，可以替代動(dòng)物肉類，形成肉類替代品QuornTM，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，攝食威尼斯鐮刀菌單細(xì)胞蛋白后，人體的胰島素和血糖水平顯著降低[59]。此外，芬蘭科學(xué)家以糖、木材水解物或亞硫酸鹽廢料上生長(zhǎng)的絲狀真菌宛氏擬青霉（Paecilomyces varioti） 作為單細(xì)胞蛋白用于動(dòng)物飼料[60]。真菌單細(xì)胞蛋白存在的問題是真菌生產(chǎn)速度較慢、核酸含量高，從而引起痛風(fēng)或風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

酵母細(xì)胞生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1）含有45%左右的優(yōu)質(zhì)全價(jià)蛋白質(zhì)，包括兒童所必需的組氨酸在內(nèi)的人體必需的9 種氨基酸，滿足人類營(yíng)養(yǎng)需求；2）酵母單細(xì)胞蛋白易消化，無致敏成分，無豆腥味，適用人群廣泛；3）酵母發(fā)酵工藝成熟，適合于規(guī)?；圃?；4） 酵母細(xì)胞體積大，易于分離回收。例如：釀酒酵母作為釀酒工業(yè)的副產(chǎn)品，可用于生產(chǎn)酵母提取物以及馬麥醬、維吉麥醬等酵母咸味醬。2019年，歐洲食品安全局（EFSA） 接受經(jīng)干燥和滅活處理的解脂耶氏酵母為新型食品[61]。

3.2 用于生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的微生物工程改造

對(duì)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的微生物菌株進(jìn)行改造，主要涉及提高底物利用效率，提高細(xì)胞環(huán)境耐受性，提高細(xì)胞生長(zhǎng)速度和蛋白質(zhì)的含量。在利用復(fù)雜原料生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白過程中，原料中有毒組分會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，從而降低細(xì)胞濃度，降低單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)效率[62]。通過表達(dá)外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和工程改造轉(zhuǎn)錄因子，可以減少微生物細(xì)胞對(duì)這些有毒組分的攝取，從而提高細(xì)胞的耐受性和生長(zhǎng)速度[63]。而過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以提高其吸收底物的速度，提高底物利用率，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[64-65]。在以多種糖作為原料時(shí)，表達(dá)多種糖攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能顯著改善細(xì)胞的生長(zhǎng)性能，如在藍(lán)藻PCC 7002（Synechococcus sp PCC 7002）中過表達(dá)天然Na+依賴性碳轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SbtA 和BicA），顯著提高了細(xì)胞生長(zhǎng)速率和干細(xì)胞質(zhì)量[65]。在以甘油（工業(yè)過程中的關(guān)鍵副產(chǎn)品）為原料生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白時(shí)，在產(chǎn)甘油假絲酵母（Candida glycerinogenes）中過量表達(dá)甘油轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（STL1 和STL2），顯著增加了產(chǎn)SCP 的微生物細(xì)胞濃度[66]。

適應(yīng)性進(jìn)化（ALE）、化學(xué)誘變和基因組工程也被廣泛用于改善微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)性能和生物量積累。如：借助適應(yīng)性進(jìn)化技術(shù)，篩選獲得能在一種或多種抑制劑存在的情況下生長(zhǎng)速率提高3.3 倍，而延滯期縮短56%的菌株馬克斯克魯維酵母（Kluveronymces maxianus）。將化學(xué)誘變與適應(yīng)性進(jìn)化相結(jié)合，則能顯著提高大腸桿菌甲基營(yíng)養(yǎng)菌株的甲醇耐受性[67]。

生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的微生物細(xì)胞濃度也可以通過協(xié)同生長(zhǎng)的方式得到提高[68-69]。工程化改造的方法包括：調(diào)節(jié)細(xì)胞表觀遺傳因素，微生物群落的結(jié)構(gòu)，共存菌株的營(yíng)養(yǎng)需求，可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，副產(chǎn)品的途徑。相關(guān)策略包括快速基因組測(cè)序/重新設(shè)計(jì)，多組學(xué)數(shù)據(jù)生成和分析，計(jì)算機(jī)建模，提高生產(chǎn)量和生物制造自動(dòng)化等技術(shù)的發(fā)展。

提高蛋白質(zhì)含量的方法策略包括：減少mRNA 和蛋白質(zhì)降解，增強(qiáng)蛋白質(zhì)折疊和重折疊，減少蛋白質(zhì)的降解。mRNA 降解與核糖核酸酶（RNase）在mRNA 上的結(jié)合概率有關(guān)，為了減少總mRNA 降解維持胞內(nèi)總mRNA 水平，一種直接的方法是開發(fā)和使用核糖核酸酶（RNase）缺陷菌株[70]。分子伴侶（如大腸桿菌GroEL/ES 和DnaK/J/GrpE）可以指導(dǎo)翻譯蛋白質(zhì)的正確折疊，對(duì)錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)進(jìn)行重新折疊。單個(gè)或多個(gè)伴侶的共表達(dá)是增強(qiáng)微生物細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量的有效方法[71]。提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量的另一方法是開發(fā)和使用缺乏蛋白酶的微生物細(xì)胞，減少蛋白質(zhì)降解。如敲除枯草芽孢桿菌中8 個(gè)細(xì)胞外蛋白酶基因，可以獲得具有更高穩(wěn)定性的異源蛋白，然而，很少有文獻(xiàn)報(bào)道蛋白酶基因的缺失會(huì)提高SCP 中的總蛋白質(zhì)產(chǎn)量[72]。

3.3 用于生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的原料

單細(xì)胞蛋白生產(chǎn)所需的原料包括碳源、氮源、無機(jī)鹽、磷鹽等。常用碳源包括氣態(tài)碳?xì)浠衔铩⒄N、乙醇、甲醇、碳氧化物、多糖、糖蜜、各種啤酒廠的流出物和其它固體化合物[57]。原料占單細(xì)胞蛋白生產(chǎn)總成本的45%～75%，碳源占據(jù)大部分原料成本，而氮源僅占原料成本的7%～15%[73]。

以碳為主要成分的碳水化合物在自然界中分布廣泛，易于獲取，且易被微生物所利用，如糖蜜、乳清、淀粉和烷烴等碳水化合物。生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的其它碳源包括二氧化碳、正烯烴、乙醇、甲醇、碳氧化物等[57]，而在藻類的培養(yǎng)過程中需要高耗能的攪拌促進(jìn)二氧化碳的溶解。利用來源豐富且價(jià)格低廉的農(nóng)業(yè)和工業(yè)廢棄物生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白，不僅可以減少近80%的生物需氧量，而且還可最大限度地減少處置它們所需的處理成本[74]。然而，使用前需要對(duì)其特殊處理，增加了生產(chǎn)成本，而工業(yè)廢棄物在使用過程具有高水平的生物需氧量，如果不進(jìn)行處理就會(huì)造成環(huán)境污染。碳?xì)浠衔锛捌溲苌镆部捎米魃a(chǎn)單細(xì)胞蛋白的底物，約占總生產(chǎn)成本的30%～70%[61]。碳?xì)浠衔锿ǔ奶烊粴饣蚴椭蝎@得，在本質(zhì)上屬于不可再生資源。

微生物在生長(zhǎng)和生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的過程中，需要氨、銨鹽或硝酸鹽等提供的氮源，而且在生長(zhǎng)過程中培養(yǎng)基需要保持合適的碳氮比[60]。研究表明，微生物中存在相似的碳氮比，培養(yǎng)基中碳氮比維持在10∶1 最優(yōu)。也有研究表明，不同微生物之間，培養(yǎng)基碳氮比不同。當(dāng)碳氮比較高時(shí)，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的氨先被消耗完，影響后期單細(xì)胞蛋白的合成。當(dāng)碳氮比在1∶1 時(shí)，氨大部分被浪費(fèi)掉，不能進(jìn)入細(xì)胞[56]。除碳水化合物和氮源外，生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的培養(yǎng)基中還需補(bǔ)充一定量的微生物生長(zhǎng)所需的維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以最大限度地獲得最大蛋白產(chǎn)量。

4 展望

利用合成生物學(xué)、系統(tǒng)代謝工程等新興生物技術(shù)構(gòu)建的微生物細(xì)胞工廠，實(shí)現(xiàn)了向自然界要銨，向微生物要氨基酸和向微生物要蛋白，在滿足人體營(yíng)養(yǎng)需求的前提下，有效減少土地資源、淡水資源的利用和溫室氣體的排放。氮素不僅是氨基酸與蛋白質(zhì)的重要組成部分，也是動(dòng)植物生長(zhǎng)的必需元素之一。圍繞生物固氮等氮代謝途徑，開發(fā)新型生物固氮技術(shù)，克服天然固氮體系缺陷，創(chuàng)制新一代人工高效固氮技術(shù)是未來的研究方向。目前，微生物細(xì)胞主要以“糧食生物質(zhì)”淀粉作為原料的第1 代生物煉制技術(shù)進(jìn)行微生物氨基酸和微生物蛋白質(zhì)合成，存在“與人爭(zhēng)糧，與糧爭(zhēng)地”等問題。為了解決這個(gè)問題，可以開發(fā)以木質(zhì)纖維素等非糧生物質(zhì)作為原料的第2 代生物煉制技術(shù)。CO2作為自然界含量豐富的碳源，預(yù)計(jì)到2050年CO2排放量將增加到500 億t/年。利用CO2作為微生物細(xì)胞工廠的原料，不僅可以實(shí)現(xiàn)“不與人爭(zhēng)糧，不與糧爭(zhēng)地”的目標(biāo)，而且可以減少CO2排放，為實(shí)現(xiàn)碳達(dá)峰與碳中和提供一條有前景的發(fā)展路線。雖然通過科研人員的不斷努力，賦予或者強(qiáng)化了微生物細(xì)胞工廠的固定CO2的能力，但是微生物細(xì)胞工廠大規(guī)模利用CO2生產(chǎn)目標(biāo)化學(xué)品還缺乏市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，迫切需要捕碳元件與能量供給方面的突破。