腎小球系膜細胞中TGF-β受體1的反式激活調(diào)控了CTGF的增量表達①

王耀坤, 劉雙春

(1.佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)部，黑龍江 佳木斯 154007；2. 臺州市立醫(yī)院輸血科，浙江 臺州 318000)

腎小球毛細血管壓力升高 (glomerular capillary pressure, Pgc) 是不同病因誘導(dǎo)的慢性腎臟疾病進展中主要致病決定因素。利用機械應(yīng)激的實驗方法，可以體外模擬腎小球系膜細胞(glomerular mesangial cell, GMC)高Pgc的傳遞，在結(jié)構(gòu)方面恰好為腎小球毛細血管簇提供了必要的支持[1]。在體外，循環(huán)應(yīng)用真空與可變形孔板模型拉伸效應(yīng)。在基質(zhì)上生長的MC經(jīng)循環(huán)拉伸/松弛后增加了基質(zhì)蛋白的合成[2]，此方法恰恰為MC中機械應(yīng)激誘導(dǎo)信號的研究提供了一個模型系統(tǒng)。另外，基質(zhì)蛋白合成和腎小球纖維化的兩個關(guān)鍵介質(zhì)是促纖維化細胞因子轉(zhuǎn)化生長因子β1 (Transforming factor β1, TGF-β1)和結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)。CTGF至少介導(dǎo)了TGF-β1的部分促纖維化作用，但它也對基質(zhì)上調(diào)有獨立和疊加的作用[3]。CTGF的上調(diào)與腎纖維化的嚴重程度密切相關(guān)，抑制其表達對MC具有明顯對的保護作用[4]。機械拉伸是否能夠上調(diào)CTGF的表達，其分子機制如何目前還不清楚。本研究利用原代培養(yǎng)的GMC作為研究對象，利用機械拉伸的實驗方法分析 CTGF的表達變化及TβR1在此過程中的作用。研究結(jié)果可以為臨床慢性腎病的有效治療提供必要的理論和實驗支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SD大鼠腎小球系膜細胞(GMC)，由加拿大 Joan Krepinsky教授(McMaster University)惠贈。DMEM 培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Sigma公司)；Trizol(美國ThermoFisher公司)； 抗CTGF抗體(mouse，美國Santa Cruz公司)；抗Tubulin抗體(rabbit, 美國Cell Signaling公司)；抗P-Smad3 S423/S425 抗體((rabbit，美國Cell Signaling公司)；TβR1阻斷劑SB431542 (5 mM, 30 minutes)(美國Cell Signaling公司)，細胞培養(yǎng)中需要的其他耗材均購自Corning 公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

SD大鼠，雌性，乙醚麻醉后用事先冷藏的生理鹽水反復(fù)灌洗腎臟，觀察腎臟顏色變白后按照常規(guī)細胞原代培養(yǎng)方法進行[5,6]。6～15代的GMC饑餓24h后進行機械拉伸處理。

1.3 機械應(yīng)激(Stretch)實驗操作方法

6～15代GMC細胞，制備單細胞懸液后鋪在一種特殊的6孔板上，底部有彈性，涂有牛I型膠原蛋白(購置于Flexcell International公司，美國)。當細胞融合度達到90%～95%時饑餓24h。機械應(yīng)激實驗前先加入TβR1阻斷劑SB431542 (5 mM, 30 minutes)，然后將鋪滿細胞的6孔板置于一種機器控制的真空中(Flexercell 4000, Flexcell International Corp.)，連續(xù)循環(huán)拉伸/放松，每循環(huán)0.5秒的拉伸和0.5秒的放松，總共60個循環(huán)/min。

1.4 Wester Blot方法檢測細胞中CTGF和P-Smad3蛋白表達

取對數(shù)生長期的GMC，調(diào)整其濃度為2.5×105/mL，每孔1mL，接種于直徑6cm 細胞培養(yǎng)皿中，置入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞融合度達到80%～85%時饑餓24h，分為正常對照組、Stretch 1h組、Stretch 3h組、Stretch 6h組，固定時間點加入細胞裂解液，冰上裂解30min，14000r /min，4℃離心10min收集上清。采用SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達，各泳道蛋白上樣量為50μg。再將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到0.45μm硝酸纖維素膜( NC膜) 上，NC 膜用脫脂奶粉進行封閉，然后與一抗孵育4℃過夜，TBST 洗滌后再與過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2h，TBST再次洗滌，電化學(xué)發(fā)光( electrochemiluminescence，ECL) 檢測免疫印跡信號，發(fā)光成像儀拍照記錄，Image J圖像分析軟件進行條帶分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 實驗結(jié)果

2.1 機械應(yīng)激增量調(diào)節(jié)了CTGF的表達

GMC細胞通過Stretch處理1h、3h和6h后CTGF的表達明顯增加，并與作用時間呈正相關(guān)(P<0.05)，說明外源性機械應(yīng)激可以明顯激活GMC細胞CTGF的表達。見圖1。

圖1 機械應(yīng)激上調(diào)了GMC細胞CTGF的表達與對照組相比，*P<0.05。

2.2 機械應(yīng)激增量調(diào)節(jié)了P-Smad3的表達

GMC細胞通過Stretch處理30S、1h和3h后P-Smad3的表達明顯增加，并與作用時間呈正相關(guān)(P<0.05)，說明外源性機械應(yīng)激可以明顯激活GMC細胞P-Smad3的表達。見圖2。

圖2 機械應(yīng)激實驗上調(diào)了GMC細胞P-Smad3的表達與對照組相比，*P<0.05。

2.3 TβR1阻斷劑低調(diào)節(jié)了機械應(yīng)激誘導(dǎo)的CTGF增量表達

GMC細胞通過Stretch處理1h后CTGF的表達明顯增加，TβR1阻斷劑則明顯降低了CTGF的表達(P<0.001)，說明外源性機械應(yīng)激激活GMC細胞CTGF的表達依賴TβR1。見圖3。

圖3 TβR1阻斷劑降低了機械應(yīng)激誘導(dǎo)的GMC細胞CTGF增量表達與對照組相比，P<0.001。

2.4 TβR1阻斷劑低調(diào)節(jié)了機械應(yīng)激誘導(dǎo)的P-Smad3增量表達

GMC細胞通過Stretch處理1h后P-Smad3的表達明顯增加，TβR1阻斷劑則明顯降低了P-Smad3的表達(P<0.01)，說明外源性機械應(yīng)激激活GMC細胞P-Smad3的表達依賴TβR1。見圖4。

圖4 TβR1阻斷劑降低了機械應(yīng)激誘導(dǎo)的GMC細胞P-Smad3增量表達與對照組相比， P<0.01。

3 討論

更深入地了解調(diào)節(jié)基質(zhì)生成的分子機制，對于發(fā)掘治療慢性腎臟疾病的新的潛在治療靶點至關(guān)重要。我們目前的研究提出了幾個新發(fā)現(xiàn)。首先我們確定了機械性拉伸實驗以一種配體獨立反式激活方式激活TβR1發(fā)揮促纖維化作用。也就是說在沒有TGF-β1存在的情況下，GMC處于一種機械應(yīng)激狀態(tài)下TβR1可以被激活，發(fā)揮誘導(dǎo)基質(zhì)生成促纖維化的作用。事實上，大量文獻已經(jīng)證實，雖然Stretch可以誘導(dǎo)TGF-β1分泌水平增加，但均發(fā)生與Stretch后48～72h[7]。而本實驗中發(fā)現(xiàn)Stretch 1h后 TβR1已經(jīng)活化。GMC中TGF-β1的分泌比信號通路的激活和CTGF的上調(diào)晚得多。

體外研究證實，CTGF誘導(dǎo)的GMC改變，主要涉及到了腎臟病變程度的進展[8]。CTGF的作用機制主要涉及到增量調(diào)節(jié)了纖維連接蛋白和纖溶酶原激活物抑制因子的合成，結(jié)果引起了GMC外基質(zhì)產(chǎn)生的增加和積聚。TGF-β1與CTGF有著及其相似的功能。但是CTGF的siRNA或者RNAi均能抑制TGF-β1的這種作用。慢性腎臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中，無論是基質(zhì)擴張，還是GMC肥大，病理改變均發(fā)生于系膜區(qū)，由此說明TGF-β1是腎臟疾病病理損傷中的決定性因子。在此過程中CTGF則是促進TGF-β1作用發(fā)揮并增強其效應(yīng)的重要調(diào)節(jié)子[9]。相關(guān)文獻證明盡管機械應(yīng)激導(dǎo)致GMC中CTGF上調(diào)，但其上調(diào)的機制尚不清楚[10]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TβR1在機械應(yīng)激誘導(dǎo)的Smad3的磷酸化和CTGF表達上調(diào)中是絕對需要的。有趣的是，Smad3的激活是由配體獨立的TβR1激活介導(dǎo)的。相關(guān)文獻證明，Smad3也參與了內(nèi)半月板細胞機械應(yīng)激誘導(dǎo)的CTGF表達[11]。綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1是GMC機械應(yīng)激誘導(dǎo)CTGF上調(diào)的重要誘導(dǎo)子，Smad3作為TGF-β1下游蛋白也是誘導(dǎo)CTGF增量表達所必須的。我們的研究為評估TGF-β1抑制劑作為一種慢性腎臟疾病的新型抗纖維化策略提供了強有力的基礎(chǔ)。