重組溶瘤腺病毒聯(lián)合納米粒子對HepG2細(xì)胞毒性的作用①

郭楚君，孫玉鴻，李 升

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

癌癥，又稱為惡性腫瘤，是由病人自身產(chǎn)生的、可以進行無限增值的、并由身體一個部位轉(zhuǎn)移到其他部位的一種疾病，是危害人類健康最嚴(yán)重的疾病之一[1,2]，肝癌又是惡性腫瘤中最常見的一種。近年來對納米粒子和溶瘤腺病毒在治療腫瘤方面的研究越來越多[3～7]，它們具有許多的優(yōu)越性，將兩者聯(lián)合起來，則會取得更大的抗腫瘤效果。

100多年前就有人嘗試用野生型病毒來治療癌癥，說明這種野生型病毒對腫瘤細(xì)胞具有一定的抑制作用[8]?，F(xiàn)在人們可以對病毒基因進行定向操作和改造，刪除某些致病基因或利用腫瘤特異性啟動子控制病毒腫瘤特異性復(fù)制，滿足治療的需要[9]。與傳統(tǒng)化學(xué)藥物治療腫瘤相比，溶瘤治療最大的優(yōu)勢在于病毒對正常人體細(xì)胞的影響較小[10]。所以利用溶瘤病毒來治療腫瘤從理論上具有更高的效率和更低的毒副作用。而納米粒子作為運載體，也在多方面發(fā)揮其優(yōu)勢，例如納米材料尺寸小、比表面積大、易修飾、生物相容性好等，大大提高了溶瘤腺病毒在病變組織的靶向富集和可控性釋放的精確度，降低了對正常組織的毒副作用[11]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料：納米粒子來源于國家納米中心，HepG2、HL-7702細(xì)胞來源于佳木斯大學(xué)生命科學(xué)實驗中心，重組溶瘤腺病毒來源于百恩維生物科技有限公司。

1.1.2 儀器：倒置式生物顯微鏡(CKX41 OLYMPUS) ，臺式離心機(TDL-50B)，電熱干燥箱 (DHG-9246A )，冰箱 (Sanyo)，電恒溫水浴鍋(HWS28 )，CO2培養(yǎng)箱(E191IR/W200IR)，酶標(biāo)儀 (BioTek)。

1.1.3 藥品試劑：96孔板 、離心管 、培養(yǎng)瓶(Corning、Costar)公司，MTS試劑(Promega)，DMEM培養(yǎng)基 、胰酶 (Gibco)、無水乙醇購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組溶瘤腺病毒的構(gòu)建

使用hTERT 啟動子替代原始啟動子，然后在啟動子核心序列內(nèi)插入3個 E-box 序列，可以增強啟動子的靶向性。

1.2.2 重組溶瘤腺病毒納米系統(tǒng)的構(gòu)建

重組溶瘤腺病毒納米系統(tǒng)是通過帶負(fù)電的溶瘤腺病毒DNA和帶正電的納米粒子之間相互吸附的自組裝行為而形成不同粒徑聚集體的?；镜姆椒ㄊ菍煞N帶不同電荷的物質(zhì)分別溶于溶質(zhì)中形成兩種溶液，迅速混合兩種溶液，經(jīng)過攪拌之后靜置，形成較為穩(wěn)定的溶液狀態(tài)。

1.2.3體外驗證重組溶瘤腺病毒納米系統(tǒng)對HePG2細(xì)胞的毒性作用

1.2.3.1使用MTS方法檢測重組溶瘤腺病毒納米系統(tǒng)對HePG2的毒性作用

體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞(培養(yǎng)基為DMEM，含10% 胎牛血清，1.2%青霉素和鏈霉素雙抗，培養(yǎng)溫度為37℃，二氧化碳濃度5%)分別用PBS洗2遍，胰酶消化，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，稀釋至5×104個細(xì)胞每毫升，將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種100μL(約1×104個細(xì)胞)；DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。吸去每孔中的培養(yǎng)液，加入100μL含不同濃度(50μg/mL、40μg/mL、30μg/mL、20μg/mL、10μg/mL)重組溶瘤腺病毒納米系統(tǒng)的培養(yǎng)基，每個濃度4個平行樣品，繼續(xù)培養(yǎng)至預(yù)定時間(24h、48h)；同時做只有納米材料的對照組。每孔加入20μL含MTS(CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay)試劑，37℃靜置1h。全自動酶標(biāo)儀(BioTek)于490nm波長檢測溶液吸光值，實驗重復(fù)3次，繪制不同濃度下不同作用時間的細(xì)胞生長曲線。

1.2.3.2流式細(xì)胞儀測定重組溶瘤腺病毒納米系統(tǒng)對HePG2細(xì)胞的毒性

體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞用PBS洗兩次，胰酶消化；細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)后，接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種1.5mL培養(yǎng)基(約1×105個細(xì)胞)，培養(yǎng)24h。吸去每孔中的培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，每孔加入含不同濃度(26.6μg/mL、21.3μg/mL、16μg/mL、10.6μg/mL、5.3μg/mL)重組溶瘤腺病毒納米系統(tǒng)的DMEM培養(yǎng)基1.5mL，同時做只有納米材料的對照組。每個濃度設(shè)置3個平行樣品。在培養(yǎng)24h和48h后，胰酶消化，培養(yǎng)液1000rpm離心5min收集細(xì)胞；將每孔收集到的細(xì)胞用PBS重懸；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，繪制曲線。

2 實驗結(jié)果

2.1 MTS方法檢測重組溶瘤腺病毒納米系統(tǒng)對HePG2細(xì)胞的毒性作用(重組溶瘤腺病毒質(zhì)粒聯(lián)合納米粒子：NPs-質(zhì)粒；空載納米粒子：NPs)重組溶瘤腺病毒納米粒子對于細(xì)胞生長的抑制

實驗結(jié)果表明:(1)重組溶瘤腺病毒納米粒子對于肝癌細(xì)胞HepG2生長有明顯的抑制作用，并且隨著濃度的增加，肝癌細(xì)胞的生存率逐漸降低。當(dāng)最大濃度50μg/mL時，作用48h后，肝癌細(xì)胞的生存率僅為22%。(2)重組溶瘤腺病毒納米粒子作用48h后，對肝癌細(xì)胞HepG2的生長抑制作用要明顯要強于24h。(3)納米粒子NPs對肝癌細(xì)胞HepG2沒有明顯的毒性作用，當(dāng)NPs為最大濃度50μg/mL時，肝癌細(xì)胞的生存率可以達到84%。見圖1。

圖1 HepG(A:24h，B：48h)被不同濃度的重組溶瘤腺病毒質(zhì)粒和NPs作用后的細(xì)胞存活率-藥物濃度曲線(P<0.01)

2.2 流式細(xì)胞儀檢測HePG2細(xì)胞的凋亡

流式細(xì)胞儀檢測肝癌細(xì)胞凋亡，實驗結(jié)果表明含納米粒子可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡，且存在時間和濃度依賴性，濃度越高，細(xì)胞的凋亡率越高，細(xì)胞的生存率越低。并且培養(yǎng)48h后對肝癌細(xì)胞的生長抑制作用明顯高于24h。當(dāng)重組溶瘤腺病毒納米粒子的濃度為26.6μg/mL，培養(yǎng)48h后，肝癌細(xì)胞的生存僅為26.7%。見表1～2。

表1 納米粒子作用24h后的細(xì)胞凋亡結(jié)果

表2 納米粒子作用48h后的細(xì)胞凋亡結(jié)果

3 討論

傳統(tǒng)的化學(xué)藥物治療腫瘤對正常組織或器官會產(chǎn)生毒副作用，給患者帶來極大的痛苦，很大程度上降低了患者的生活質(zhì)量。溶瘤腺病毒對腫瘤細(xì)胞具有復(fù)制選擇性、hTERT啟動子在腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞中的活性有差別、納米粒子具有靶向性，均具可以增強腫瘤的特異性，將三者聯(lián)合建立多重腫瘤特異性，可以減少對正常細(xì)胞的感染率，實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的特異性識別和殺滅。所以本文的實驗方法為腫瘤細(xì)胞的治療提供新的研究思路和理論依據(jù)。