PD-1和PD-L1在卵巢上皮性癌組織中的表達及其與免疫抑制相關(guān)因子的關(guān)聯(lián)

王絲雨 王 娜 張 蘭 劉月華

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是卵巢癌中最常見的類型，在婦科腫瘤中惡性程度和病死率最高，由于早期癥狀輕微且無特異性癥狀，缺乏有效的篩查手段，大多數(shù)患者確診時已為晚期[1-2]。近年來，程序性死亡受體1(PD-1)以及配體程序性死亡配體1(PD-L1)的相關(guān)抑制藥物在治療惡性腫瘤中獲得顯著關(guān)注[3]。CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg cell)指具有免疫調(diào)節(jié)功能的抑制性細胞亞群，可介導腫瘤發(fā)生免疫逃避，在抗腫瘤應答中發(fā)揮抑制效應[4]。有研究證實Treg細胞水平在多種腫瘤患者的外周血中有所增加[5]。有研究報道PD-1和PD-L1可能與CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細胞存在關(guān)聯(lián)性[6]，但是相關(guān)研究報道較少，具體關(guān)聯(lián)機制尚不明確。因此本研究探討PD-1和PD-L1在卵巢上皮性癌組織中的表達及其與免疫抑制相關(guān)因子的關(guān)聯(lián)，旨在尋找合適的生物標志物用于EOC的臨床應用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2021年1月本院收治卵巢上皮性癌患者60例，年齡28～74歲，平均(55.65±8.68)歲。納入標準：①符合《卵巢惡性腫瘤診斷與治療指南(第四版)》診斷標準[7]，經(jīng)病理學確診為卵巢上皮性癌； ② 均行卵巢分期手術(shù)或腫瘤細胞減滅術(shù)；③術(shù)前未接受放化療或抗腫瘤治療； ④患者簽署自愿受試同意書，患者及其家屬需簽署知情同意書。排除標準：① 患者資料收集未完整；②合并其他惡性腫瘤；③合并其他器官嚴重性病變患者；④合并神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

1.2 免疫組化法檢測PD-1、PD-L1表達

4%中性甲醛固定標本，經(jīng)脫水、石蠟包埋，切片后分別進行HE及免疫組化染色，光鏡顯微鏡下觀察組織形態(tài)學特征。采用PV600二步法，以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性組織作為陽性對照。結(jié)果判定：PD-1陽性染色定位于細胞質(zhì)，呈黃色或棕黃色，當著色細胞≥5%時可定義為陽性。PD-L1陽性染色定位于細胞膜，呈黃色或棕黃色，當著色細胞≥5%時定義為陽性。

1.3 CD4+ CD25+CD127-Treg 細胞檢測

抽取患者靜脈血5 mL，加入抗凝管，取80 μL抗凝全血于流式檢測管底部，加抗人CD3、CD4、CD45、CD25和CD127抗體，各10 μL，充分混勻后避光孵育15 min；加1 mL溶血劑，混勻，避光15 min；離心后去上清，加入2 mL PBS混勻，離心后去上清；上機檢測，以CD45/SSc設(shè)門圈定淋巴細胞群，以CD3/CD4設(shè)門圈定CD4+T細胞，再分析該群細胞中CD25+CD127-細胞比例。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 PD-L1、PD-1的表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

PD-L1表達與卵巢癌患者的FIGO分期有關(guān)，F(xiàn)IGO Ⅲ+Ⅳ期患者PD-L1陽性表達率顯著高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)；PD-1蛋白表達與其他臨床病理參數(shù)均無顯著相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

表1 PD-L1、PD-1的表達與患者臨床病理特征的關(guān)系/例

2.2 Treg 細胞頻率比較

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，PD-1、PD-L1陽性患者CD4+CD25+CD127-Treg頻率顯著高于PD-1、PD-L1陰性患者(P<0.05)，見表2。

表2 Treg 細胞頻率比較

3 討論

卵巢癌有漿液性囊腺癌、透明細胞癌、卵巢子宮內(nèi)膜樣癌、卵巢黏液性囊腺癌等多種類型，臨床病理類型復雜多樣，其中以上皮性卵巢癌發(fā)病率最高，大多數(shù)患者確診時已為中晚期，常會出現(xiàn)腫瘤細胞腹膜轉(zhuǎn)移，是目前EOC患者死亡的主要原因[8-9]。手術(shù)治療聯(lián)合化療是目前臨床用于EOC患者的常規(guī)治療方案，但是由于手術(shù)難以根治以及化療易產(chǎn)生耐藥等原因，導致EOC患者易出現(xiàn)治療以及預后效果不佳的情況[10-11]。近年來，由于新輔助技術(shù)和靶向治療技術(shù)在不斷發(fā)展，EOC患者的預后以及生存期有所改善。免疫治療是一種通過激活自身的免疫系統(tǒng)，來增強腫瘤微環(huán)境抗腫瘤免疫力，從而控制和殺傷腫瘤細胞的腫瘤治療新方案，是目前腫瘤免疫治療的主要靶點之一[12-13]，其主要機制是協(xié)同刺激分子通過提供正性或負性信號，調(diào)節(jié)T細胞活化、增殖及免疫應答等生物學功能[14]。

PD-L1是B7家族成員之一，主要在活化的T細胞和B細胞以及巨噬細胞表面表達。PD-1是CD28/CTLA-4家族成員之一，編碼Ⅰ型跨膜糖蛋白，是PD-L1的受體[15-16]。PD-1和PD-L1結(jié)合后，下調(diào)下游激活信號的磷酸化，向T細胞內(nèi)傳遞抑制信號，可防止T細胞過度活化，從而抑制免疫反應的發(fā)生[17-18]。腫瘤細胞中的PD-1和PD-L1結(jié)合后可以抑制T細胞抗腫瘤免疫應答的發(fā)生，促使腫瘤發(fā)生免疫逃避[19]。研究報道稱，在卵巢癌、胃癌、淋巴瘤等多種腫瘤細胞上均有PD-L1的表達，與患者的預后差及生存期短顯著相關(guān)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)PD-L1表達與卵巢癌患者的FIGO分期有關(guān)，F(xiàn)IGO Ⅲ+Ⅳ期患者PD-L1陽性表達率顯著高于Ⅰ+Ⅱ期，提示PD-L1可能參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展進程。

腫瘤的形成與發(fā)展可能與某些轉(zhuǎn)化的細胞逃避機體免疫清除作用有關(guān)[21]，其中CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性細胞屬于特異的T淋巴細胞亞群，已成為腫瘤免疫學領(lǐng)域的研究熱點[22]。CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性細胞作為負性免疫調(diào)節(jié)細胞，具有免疫抑制性，主要通過直接的細胞與細胞接觸、間接的分泌可溶性細胞因子等途徑來降低抗腫瘤特異性T淋巴細胞的功能，從而達到促使腫瘤發(fā)生免疫逃逸的目的[23-24]。目前多種研究發(fā)現(xiàn)，Treg在乳腺癌、卵巢癌、胃腸道腫瘤等患者的外周血和腫瘤局部均有所增加[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)PD-1、PD-L1陽性患者CD4+CD25+CD127-Treg頻率顯著高于PD-1、PD-L1陰性患者，提示EOC患者PD-1、PD-L1的表達與免疫抑制相關(guān)因子存在密切聯(lián)系，這與既往研究報道一致[27]。

綜上所述，EOC患者PD-L1的表達水平與腫瘤分期有關(guān)，還與免疫抑制相關(guān)因子密切相關(guān)。但是本研究依然存在局限性，首先是納入樣本量不足以及中心單一，易對結(jié)果造成影響；其次是本研究采用免疫組化的實驗方法，可能存在蛋白降解的情況，對試驗結(jié)果造成影響，因此需要未來更為前瞻性的試驗研究來驗證此結(jié)果。