延胡索總堿理化性質(zhì)及體外經(jīng)皮滲透性的研究

姜明瑞 王志成 岳珠珠 張婧秋 魏曉彤 石雙慧 王夢琳 王慧楠 陳夢雨 王英姿

延胡索是中醫(yī)臨床理氣止痛之要藥，延胡索總堿是其主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，其中延胡索甲素、延胡索乙素及延胡索丑素是延胡索發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的主要活性成分[1-2]。目前與延胡索總堿體內(nèi)吸收、分布、代謝密切相關(guān)的溶解度、油水分配系數(shù)等重要理化參數(shù)研究報(bào)道較少，尚未見關(guān)于延胡索總堿體外經(jīng)皮滲透性能的研究。穴位貼敷療法是中醫(yī)內(nèi)病外治的一種特色療法，藥物貼敷神闕穴，預(yù)期能夠發(fā)揮穴位刺激和藥物療效的雙重作用[3-6]，因此，探究延胡索總堿穴位及非穴位給藥的體外經(jīng)皮滲透性能具有一定意義。本實(shí)驗(yàn)建立酸性染料比色法測定延胡索總生物堿含量，同時(shí)采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定延胡索總堿中延胡索甲素、延胡索乙素和延胡索丑素的含量，考察延胡索總堿包括延胡索甲素、延胡索乙素和延胡索丑素的溶解度、油水分配系數(shù)等理化常數(shù)，并研究延胡索甲素、延胡索乙素和延胡索丑素神闕穴與非穴位體外經(jīng)皮滲透性能，以期為延胡索總堿經(jīng)皮給藥制劑研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級健康SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～200 g，由斯貝福提供，許可證號：SCXK(京)2019-0010，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

延胡索飲片(山東百味堂炮制，批號：180406)，經(jīng)鑒定為罌粟科植物延胡索(CorydalisRhizoma)的干燥塊莖；延胡索總堿自制(批號：20200106、20200120、20200212)；延胡索甲素對照品(含量：98.0%，上海源葉生物科技有限公司，批號：Z25N8B49010)；延胡索乙素對照品(含量：99.8%，中國食品藥品檢定研究院，批號：110726-201819)；延胡索丑素對照品(含量：98.%，成都德思特生物技術(shù)有限公司，批號：DST200321-157)。

1.3 主要試劑與儀器

95%乙醇(北京虹湖聯(lián)合化工產(chǎn)品有限公司)；醋酸—醋酸鈉緩沖液、溴甲酚綠、三氯甲烷、三乙胺、磷酸、冰醋酸、乙酸乙酯(北京化工廠)；正辛醇(阿拉丁生化科技股份有限公司)；氮酮、薄荷油(麥克林生化科技有限公司)；甲醇(色譜純，美國Fisher Scientific公司)；其余試劑為分析純、水為去離子水以及純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

UltiMate 3000型HPLC，Chromeleon工作站；KH7200DB型超聲清洗機(jī)(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；756PC型UV(舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；TGL-16M型高速離心機(jī)(湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司)；ZD-88型恒溫振蕩器(天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠)；TK-12D型透皮吸收擴(kuò)散儀(上海鍇凱科技有限公司)；T10 basic高速電動(dòng)組織勻漿機(jī)(德國IKA公司)等。

1.4 酸性染料比色法測定延胡索總堿的含量

1.4.1 測定條件 精密量取待測溶液1 mL置于分液漏斗中，加pH 4.5醋酸—醋酸鈉緩沖液12 mL，溴甲酚綠3 mL，三氯甲烷9 mL，振搖2分鐘，室溫靜置1小時(shí)后取下層三氯甲烷液，用無水硫酸鈉0.4 g除去殘留水分，避免干擾測定。取pH 4.5醋酸—醋酸鈉緩沖液1 mL按相同操作得空白對照溶液，測定吸光度[1,7]。

1.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取延胡索乙素對照品8 mg至50 mL容量瓶中，加醋酸—醋酸鈉緩沖液溶解定容，得0.160 mg/mL的對照品溶液。

1.4.3 供試品溶液的制備 精密稱取延胡索總堿2 mg，加醋酸—醋酸鈉緩沖液溶解定容，即得。

1.4.4 方法學(xué)考察 (1)測定波長的確定：精密量取醋酸—醋酸鈉緩沖液、對照品溶液和供試品溶液各1 mL分別置于分液漏斗中，按照“1.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，于紫外—可見分光光度計(jì)上掃描(200～800 nm)，以確定最大吸收波長。結(jié)果顯示，延胡索總堿溶液與延胡索乙素溶液的最大吸收均在411 nm處，且空白對照溶液在該處無此吸收，因此以411 nm作為檢測波長，結(jié)果見圖1。(2)線性關(guān)系考察：精密量取對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別加醋酸—醋酸鈉緩沖液溶解定容至5 mL，按“1.4.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，延胡索乙素的線性回歸方程為Y=5.2887X-0.0474，R2=0.9994，在0.01612～0.1612 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。(3)精密度考察：取對照品溶液，按照“1.4.1”項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣測定6次，結(jié)果RSD為0.11%，精密度良好。(4)重復(fù)性考察：精密稱取同一批延胡索總堿6份，按“1.4.3”項(xiàng)下方法制備延胡索總堿溶液，按照“1.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，結(jié)果RSD為0.88%，重復(fù)性滿足樣品測定要求。(5)穩(wěn)定性考察：取延胡索總堿溶液，按照“1.4.1”項(xiàng)下方法操作，于顯色后0、10、20、40、60、120分鐘進(jìn)行測定，結(jié)果RSD為1.59%，表明樣品在120分鐘內(nèi)穩(wěn)定性良好。(6)加樣回收試驗(yàn)：取已知延胡索總堿含量的延胡索總堿溶液6份，每份1 mL，分別加入等量含量相當(dāng)?shù)难雍饕宜貙φ掌啡芤海凑铡?.4.3”的方法制備，按照“1.4.1”項(xiàng)下方法測定，平均加樣回收率為100.56%，RSD為1.63%，說明該方法回收率良好。

1.4.5 延胡索總堿樣品的測定 精密稱取3批不同批次的延胡索總堿，按照“1.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，計(jì)算延胡索總堿的含量，每個(gè)供試樣品平行測定3次。

1.5 HPLC法測定延胡索總堿中延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素的含量

1.5.1 色譜條件[8]Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱；流動(dòng)相甲醇-0.04 mol/L磷酸水溶液(70:30，用三乙胺調(diào)pH為6.0)；檢測波長281 nm；柱溫30℃；流速1 mL/分鐘；進(jìn)樣量10 μL。

注：A 空白溶液；B 延胡索乙素對照品；C 延胡索總堿供試品。

1.5.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素對照品，加甲醇超聲定容至5 mL，制得濃度分別為1.8522、0.7804、0.6233 mg/mL的母液。

1.5.3 供試品溶液的制備 精密稱取延胡索總堿3 mg，加甲醇超聲定容至10 mL，過0.22 μm濾膜，即得。

1.5.4 延胡索總堿樣品測定 取3批延胡索總堿樣品，按照“1.4.3”項(xiàng)下制備延胡索總堿溶液，按照“1.4.1”項(xiàng)下方法測定峰面積并計(jì)算延胡索總堿樣品中延胡索甲素、延胡索乙素以及延胡索丑素3種單體成分的含量。

1.6 延胡索總堿溶解性的測定

精密稱取過量的延胡索總堿，分別加入到2 mL以下10種溶媒中：PBS緩沖液(pH 5.5)、PBS緩沖液(pH 6.86)、PBS緩沖液(pH 7.2)、生理鹽水、去離子水、5%乙醇的生理鹽水、10%乙醇的生理鹽水、20%乙醇的生理鹽水、甲醇、乙酸乙酯，37℃超聲溶解，得到延胡索總堿過飽和溶液，密封。于37℃的水浴中振搖48小時(shí)后，8000 r/分鐘，離心20分鐘，上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，采用酸性染料比色法和HPLC法分別測定，計(jì)算延胡索總堿在各個(gè)溶媒中的飽和溶解度以及延胡索總堿飽和狀態(tài)下各個(gè)溶媒中延胡索甲素、延胡索乙素以及延胡索丑素的溶解度，各組均平行測定3次。

1.7 延胡索總堿油水分配系數(shù)的測定

采用經(jīng)典搖瓶法測定延胡索總堿油水分配系數(shù)，以正辛醇為油相，純水以及pH分別為5.5、6.86和7.2的磷酸鹽緩沖液為水相，等體積混合，常溫磁力攪拌飽和24小時(shí)后，靜置2小時(shí)，將上下兩層溶液分開，得到互相飽和的油相和水相。

取適量延胡索總堿分別加入用正辛醇飽和過的純水以及pH分別為5.5、6.86和7.2的磷酸鹽緩沖液5 mL，超聲溶解，振搖平衡4小時(shí)后于10000 r/分鐘，離心20分鐘，取上清液稀釋后，分別采用酸性染料比色法和HPLC法，測定初始濃度C。然后精密量取上述水相延胡索總堿溶液3 mL，分別加入預(yù)飽和的正辛醇3 mL，密封，37℃振搖48小時(shí)，靜置后于10000 r/分鐘，離心20分鐘，取下層水溶液，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，采用酸性染料比色法及HPLC法測定濃度CW，按照公式(1)計(jì)算延胡索總堿、延胡索甲素、延胡索乙素和延胡索丑素的油水分配系數(shù)，各組均平行測定3次。

1.8 延胡索總堿體外經(jīng)皮滲透性能研究

1.8.1 供給液的配制 為測定延胡索總堿的穩(wěn)態(tài)經(jīng)皮滲透速率，所用的供給液為延胡索總堿的飽和溶液。取過量的延胡索總堿加入到pH 5.5的PBS緩沖液中，超聲溶解后，加塞密閉后將此混懸液磁力攪拌10小時(shí)，試驗(yàn)時(shí)取出制成3組供給液：不含促透劑的飽和藥物溶液；飽和藥物溶液加入3%氮酮；飽和藥物溶液加入3%薄荷油，各組均平行測定3次。

1.8.2 神闕穴與非穴位的定位與離體皮膚的制備 神闕穴與非穴位定位時(shí)，在大鼠腹白線上，劍突與恥骨聯(lián)合上緣連線間的上2/3與下1/3的交點(diǎn)處為神闕穴，距離神闕穴區(qū)域約1 cm處的腹部皮膚為非穴位，盡量避開其他穴位[9]。離體皮膚的制備時(shí)，將大鼠處死，剃毛，迅速剝?nèi)∩耜I穴和非穴位皮膚，剔除皮下筋膜、脂肪等組織，生理鹽水洗凈，濾紙吸干，置于-20℃冰箱備用。試驗(yàn)前將鼠皮自然解凍，并確保皮膚的完整性和均勻性。

1.8.3 體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn) 擴(kuò)散池為體積約8 mL的垂直式擴(kuò)散池，接收池有效接觸面積為3.14 cm2。取神闕穴和腹部非穴位鼠皮，置于供給池與接收池之間，真皮層朝向接收池，在接收池中放入磁力攪拌子并注入預(yù)熱至37℃的接收液，至液面恰與真皮接觸，排凈氣泡。將擴(kuò)散池置于(37±0.2)℃的恒溫水浴中，以300 r/分鐘開啟磁力攪拌。平衡30分鐘后，取供給液2 mL加至供給池中，分別于1、2、4、6、8、12、24小時(shí)取接收液0.2 mL，并立即補(bǔ)充等量37℃預(yù)熱的空白接收液。體外透皮結(jié)束后，用接收液洗凈大鼠皮膚，濾紙吸干，剪碎，加甲醇2 mL，高速勻漿2分鐘，10000 r/分鐘離心10分鐘，上清液以0.22 μm濾膜過濾，采用HPLC法法測定，按公式(2)計(jì)算延胡索甲素、延胡索乙素和延胡索丑素的單位面積累積滲透量(Qn)、滯留量(Qm)，以Qn對時(shí)間t作圖得體外經(jīng)皮滲透曲線，直線部分的斜率為穩(wěn)態(tài)滲透速率(JS)，增滲倍數(shù)(enhancement ratio，ER)為24小時(shí)的累積透過量(Q24)之比，樣品可儲(chǔ)存于4℃。

其中Cn和Ci分別是第n個(gè)和第i個(gè)取樣點(diǎn)的藥物濃度，V0為接收液體積(8 mL)，V為取樣體積(0.2 mL)，A為有效擴(kuò)散面積(3.14 cm2)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 酸性染料比色法測定延胡索總堿的含量

采用酸性染料比色法測定自制延胡索總堿樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果表明酸性染料比色法靈敏度較高，操作較簡單，重現(xiàn)性好，適用于延胡索總生物堿的含量測定。三批延胡索總堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(59.54±0.64)%、(72.57±0.73)%、(67.37±1.63)%，均大于50%，自制所得的延胡索總堿純度較高，批間穩(wěn)定性較好。

2.2 延胡索總堿中延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素的含量測定

3批延胡索總堿樣品中延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素的HPLC含量測定結(jié)果為延胡索甲素(80.04±3.32)mg/g、延胡索乙素(65.46±4.52)mg/g、延胡索丑素(37.00±2.61) mg/g。結(jié)果顯示延胡索總堿樣品中延胡索甲素的含量最高，約為延胡索乙素含量的1.2倍，延胡索丑素含量的2.2倍。

2.3 延胡索總堿溶解性的測定

延胡索總堿在10種不同溶劑中的溶解性結(jié)果見表1，隨著pH的增大，延胡索總堿在PBS緩沖液中的溶解度依次減小。延胡索總堿在生理鹽水和去離子水中的溶解度相近，但不同濃度乙醇的加入能夠增大其溶解度，其中延胡索總堿在含10%乙醇的生理鹽水的溶解性相對更好。甲醇和乙酸乙酯對延胡索總堿的溶解度相對較低，但是對延胡索甲素、延胡索乙素和延胡索丑素3種單體成分的溶解度較高，而且兩種溶劑中均為延胡索甲素>延胡索乙素>延胡索丑素，可能因?yàn)橐宜嵋阴プ鳛橛袡C(jī)溶劑更易溶解延胡索總堿中的脂溶性生物堿，而對其它季銨類水溶性生物堿溶解性較差，從而導(dǎo)致對延胡索總堿整體的溶解度較小。10種溶劑除乙酸乙酯外，其余均為略溶，均滿足試驗(yàn)所需漏槽條件，最終根據(jù)延胡索總堿溶解度選擇含10%乙醇的生理鹽水作為后續(xù)體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)的接收介質(zhì)。

2.4 延胡索總堿油水分配系數(shù)的測定

正常皮膚表面偏酸性，pH約為5.5～7.0[10]，因此以經(jīng)典搖瓶法測定延胡索總堿在純水和pH分別為5.5、6.86和7.2的磷酸鹽緩沖液中的油水分配系數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。延胡索總堿在純水以及pH為5.5～7.2 PBS緩沖液中的油水分配系數(shù)值為-1

2.5 延胡索總堿體外經(jīng)皮滲透性能研究

大鼠神闕穴與非穴位體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)結(jié)果如圖2，神闕穴給藥的24小時(shí)累積滲透量高于非穴位，且3%氮酮和3%薄荷油能夠明顯促進(jìn)延胡索總堿中延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素的透皮吸收，且3%薄荷油的促透效果最佳。

對經(jīng)皮滲透曲線的直線部分進(jìn)行回歸，計(jì)算各試驗(yàn)組的穩(wěn)態(tài)透過速率(JS)、增滲倍數(shù)(ER)，其中，試驗(yàn)組1至6分別為，結(jié)果見表3至表5，3種藥效成分的穩(wěn)態(tài)透過速率與增滲倍數(shù)的大小順序均為神闕穴+3%薄荷油>非穴位+3%薄荷油>神闕穴+3%氮酮>非穴位+3%氮酮>神闕穴>非穴位，與非穴位組相比，神闕穴組的24小時(shí)累積透過量和穩(wěn)態(tài)透過速率均增大，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而其他各組的24小時(shí)累積透過量和穩(wěn)態(tài)透過速率均顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，神闕穴的增滲倍數(shù)為對應(yīng)非穴位組增滲倍數(shù)的1～1.5倍，且神闕穴+3%薄荷油的增滲倍數(shù)最大，對延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素的增滲倍數(shù)分別為9.757、 9.821、 4.126， 能夠明顯促進(jìn)其經(jīng)皮吸收，表明藥物經(jīng)神闕穴給藥更有助于其滲透吸收。此外神闕穴的皮膚滯留量顯著高于非穴位(P<0.05)，與穴位經(jīng)皮給藥的皮膚貯庫效應(yīng)相吻合，且延胡索甲素的皮膚滯留量高于乙素和丑素，推測可能與其脂溶性較高有關(guān)。綜上，延胡索甲素、延胡索乙素以及延胡索丑素的體外經(jīng)皮滲透性能良好，3%氮酮和3%薄荷油能夠促進(jìn)3種藥效成分的透皮吸收，且3%薄荷油促透效果更佳；神闕穴用藥的累積透過量與滯留量高于非穴位皮膚，能夠初步證實(shí)延胡索總堿神闕穴用藥的可行性。

表1 延胡索總堿及3種單體成分在10種溶劑中的溶解性

表2 延胡索總堿及3種單體成分在不同溶劑中的油水分配系數(shù)

圖2 延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素經(jīng)神闕穴和非穴位皮膚的經(jīng)皮滲透曲線(n=3)

表3 延胡索甲素的體外經(jīng)皮滲透相關(guān)滲透參數(shù)

表4 延胡索乙素的體外經(jīng)皮滲透相關(guān)滲透參數(shù)

表5 延胡索丑素的體外經(jīng)皮滲透相關(guān)滲透參數(shù)

3 討論

適宜的溶解性、油水分配性能等理化性質(zhì)是藥物制劑研發(fā)所需的基礎(chǔ)信息，直接影響其劑型設(shè)計(jì)[11-13]。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，延胡索總堿以及延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素在不同溶媒中的溶解性能不同，除乙酸乙酯外，延胡索總堿在其余9種溶媒中均為略溶，最終以10%乙醇生理鹽水作為后續(xù)體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)的接收介質(zhì)。延胡索總堿在純水以及pH為5.5～7.2 的PBS緩沖液中的油水分配系數(shù)值-1

藥物的溶解性能、油水分配系數(shù)以及體外透皮吸收性能是新劑型研發(fā)中的重要理化性質(zhì)參數(shù)，有助于預(yù)測藥物在體內(nèi)的溶解、吸收、分布與轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)[14]。本研究建立了酸性染料比色法測定延胡索總堿樣品，并將HPLC法用于延胡索甲素、延胡索乙素及延胡索丑素的含量測定，考察延胡索總堿的溶解性、油水分配系數(shù)，對延胡索總堿的成藥性進(jìn)行了評價(jià)，同時(shí)采用離體透皮試驗(yàn)，研究了延胡索總堿在神闕穴與非穴位的體外透皮與滯留差異，初步確定神闕穴用藥的優(yōu)勢，為后續(xù)延胡索總堿作為外用經(jīng)皮給藥制劑的發(fā)展及其機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。