基于網絡藥理學探討黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的作用機制?

馬增斌，邸學士，袁巧妹，孫悅禮，龍水文，冉 宇，覃昌龍，張 超，李忠澤，鄭志堅，陳 江,7△，王擁軍4,△

(1.北京醫(yī)院，北京 100730；2.國家老年醫(yī)學中心，北京 100730；3.中國醫(yī)學科學院老年醫(yī)學研究院，北京 100730；4.上海中醫(yī)藥大學，上海 201203；5.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；6.上海中醫(yī)藥大學脊柱病研究所，上海 200032；7.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700)

頸椎病是指由多種原因引起的以頸椎間盤退變?yōu)橹?，累及周圍結構、組織發(fā)生病理改變的一種臨床綜合征[1]。近年來，頸椎病的發(fā)病逐漸年輕化，嚴重威脅著人們的生活健康[2]。頸椎病臨床治療主要包括手術和非手術治療兩種方式,非手術治療包括西藥、中藥、康復手法、外治等方式。西藥治療以緩解癥狀為主，具有一定不良反應及副作用，中藥治療從病因入手，其副作用小且具有明顯優(yōu)勢[3]。

頸椎病屬于中醫(yī)“項痹”“血痹”“項強”“頸肩痛”等范疇，國家中醫(yī)藥管理局將其分為風寒濕痹、氣血虧虛、氣滯血瘀、痰濕阻滯、肝腎不足5型[3]。中醫(yī)認為肝主筋，脾主肉，腎主骨，該病的發(fā)生發(fā)展與肝脾腎三臟關系密切，經絡痹阻、氣虛血瘀為其基本病機[4]。黃芪桂枝五物湯出自《金匱要略》，由黃芪、桂枝、白芍、生姜、大棗5味中藥組成，黃芪為君甘溫益氣，配合桂枝散風寒而益氣和血通經，配伍白芍合營通痹，佐使姜棗合營衛(wèi)、調諸藥，5味中藥相配伍益氣活血、活絡通痹。大量臨床研究證實，黃芪桂枝五物湯治療各類型頸椎病均具有一定療效[5-7]。本研究采用網絡藥理學方法，從整體角度探討黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的藥效物質基礎和作用機制，為后續(xù)深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 中藥化合物獲取及活性成分篩選

以“黃芪”“桂枝”“白芍”“生姜”“大棗”為檢索詞，在TCMSP平臺[8]進行檢索，將參數生物利用度設置大于或等于30%，類藥性設置大于或等于0.18，篩選5味中藥的活性成分。

1.2 活性成分靶點預測

通過TCMSP平臺獲取各中藥成分相關靶點蛋白，并對蛋白名稱標準化。

1.3 頸椎病靶點獲取

將“cervical myelopathy”“cervical spondylosis”“cervical spondylotic radiculopathy”作為檢索詞，分別在疾病靶點數據庫篩選相關靶點。通過ImageGP平臺繪制成分靶點、疾病靶點韋恩圖。

1.4 中藥-活性成分-靶點網絡構建

采用Cytoscape 3.7.1軟件構建網絡圖，每個節(jié)點所具有的關系數量記為度值，度值越高其代表節(jié)點所關聯(lián)的節(jié)點越多，該節(jié)點重要性就越高。

1.5 蛋白質互相作用關系網絡構建

利用STRING數據庫獲取交集靶點互相作用關系(protein-protein interaction，PPI)，通過cytoscape繪制蛋白相互作用關系網絡圖。

1.6 GO功能及通路富集分析

通過DAVID6.8數據庫進行GO及通路富集(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析，通過微生信平臺繪圖。

2 結果

2.1 中藥活性成分篩選結果

經TCMSP數據庫篩選，剔除無對應靶標及與疾病靶點無交集靶標的化合物后，共獲得活性成分41種，其中包括quercetin、beta-sitosterol、kaempferol等化合物(詳見表1)。

表1 黃芪桂枝五物湯中藥活性成分比較

2.2 靶點預測

通過GeneCards數據庫、OMIM數據庫、DisGeNET數據庫獲取頸椎病相關靶點12358個，通過TCMSP數據庫獲取黃芪桂枝五物湯中藥靶點227個。通過ImageGP平臺對2組靶點取交集，獲得187個黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的潛在作用靶點(見圖1)。

圖1 “黃芪桂枝五物湯靶標基因-頸椎病相關基因”韋恩圖

2.3 中藥-活性成分-交集靶點網絡構建及分析

構建“中藥-活性成分-交集靶點-疾病“網絡圖，(見圖2)，該網絡由235個節(jié)點879條邊組成，其中節(jié)點代表中藥及其活性成分和靶點，邊代表中藥與活性成分、活性成分與靶點的相互關系(如圖2)。

注：其中綠色節(jié)點代表黃芪桂枝五物湯中藥，紫色、灰色、紅色、青色節(jié)點代表中藥活性成分，藍色節(jié)點代表交集靶點

2.4 PPI分析

經STRING數據庫獲取黃芪桂枝五物湯治療頸椎病潛在作用靶點的互相作用關系，通過Cytoscape 3.7.1繪制靶點蛋白互相作用關系網絡圖(如圖3)，節(jié)點表示靶點蛋白，邊表示2個蛋白相連，網絡中共計167個靶點蛋白1292條邊，度值越高節(jié)點越大，在網絡中所占有的地位越大，其中度值排名的靶點包括AKT1、TP53、JUN、TNF、IL6、CTNNB1、EGFR、CASP3、RELA、VEGFA，推測其在黃芪桂枝五物湯治療頸椎病過程中具有重要地位。

圖3 黃芪桂枝五物湯中藥與頸椎病交集靶點蛋白質互相作用關系網絡圖

2.5 GO富集分析及KEGG通路分析

對黃芪桂枝五物湯治療頸椎病潛在作用靶點進行GO、KEGG分析。通過bioinformatics平臺對分析結果進行可視化展示(見圖4)。GO分析結果示，BP相關條目699條，生物過程主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、DNA復制、藥物反應、信號傳導、凋亡的負調控等生物過程。MF相關條目134條，分子功能主要包括參與蛋白質、酶、轉錄因子、DNA、ATP等生命物質的結合作用，并影響蛋白質異二聚體、轉錄因子活性；CC相關條目46條，靶基因主要與細胞核、細胞質、質膜、線粒體等部位關系密切。

圖4 黃芪桂枝五物湯中藥與頸椎病交集靶點GO富集分析柱狀圖

KEGG富集分析結果顯示，共獲取黃芪桂枝五物湯治療頸椎病潛在作用靶點相關通路130個(圖5)。

圖5 黃芪桂枝五物湯中藥與頸椎病交集靶點KEGG通路富集分析氣泡圖

3 討論

頸椎病是一種病程漫長、癥狀復雜，以頸肩僵硬、疼痛、麻木較為常見，伴或不伴有頭痛、頭暈，嚴重者可出現四肢無力、走路不穩(wěn)等特點的臨床綜合癥。頸椎病病理機制復雜，多由頸椎間盤退行性改變、椎體骨質增生、韌帶肥厚鈣化等誘因導致，并與年齡、生活方式等因素關系密切[9]。張仲景首次提出“血痹陰陽俱微……黃芪桂枝五物湯主之”。中醫(yī)認為頸椎病患者病程漫長，久病則氣血失和，經絡失于濡養(yǎng)，不榮則麻；瘀血、頑痰有形之邪共同阻滯經脈，不通則痛[10]。黃芪桂枝五物湯具有益氣活血、活絡通痹之功。現代藥理學研究證實，黃芪桂枝五物湯能夠調節(jié)免疫，降低氧化反應，促進神經修復[11-13]。

本研究共篩選出黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的41種活性成分，其中槲皮素是一種天然黃酮類化合物。有研究表明，槲皮素能夠減少髓核細胞凋亡，防止髓核細胞外基質變性[14]，還可以通過SIRT1-自噬途徑減輕椎間盤退變[15]。此外槲皮素可抑制髓核細胞中衰老相關因子的表達，從而減緩椎間盤退變的進展[16]；山柰酚同屬黃酮類化合物，可通過降低細胞凋亡、增強細胞活力、增加抗炎細胞因子水平來減緩椎間盤退變[17]；β-谷甾醇和異鼠李素2種化合物均具有抗炎、抗氧化作用[18-20]，炎性反應及過氧化均為椎間盤退變的誘因[21]，筆者推測β-谷甾醇和異鼠李素可能通過上述途徑減緩椎間盤退變。通過PPI靶點網絡拓撲分析，對靶點按照度值排序，排名越靠前的靶點在黃芪桂枝五物湯治療頸椎病過程中越重要，其中排名靠前的靶點包括AKT1、細胞腫瘤抗原p53(Cellular tumor antigen p53，TP53)、轉錄因子AP-1(transcription factor AP-1，JUN)、TNF、白細胞介素(Interleukin，IL)-6、EGFR、CASP3、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)。AKT1屬于蘇氨酸蛋白激酶，能夠調控細胞的增殖和生長。王云浩等[22]認為該蛋白與髓核細胞外基質降解有關，進而影響椎間盤退變；TNF是一種常見的蛋白家族，國外細胞實驗證實TNF參與髓核細胞鈣化，從而影響椎間盤退變[23]，其家族成員TNF-α被證實能夠參與炎癥反應[24]，并可影響生長因子的表達[25]，進而促使椎間盤退變。此外，TGF-α和EGFR均可促進血管組織向髓核內生長，加重椎間盤退變[26]。

通過GO富集分析結果推測，黃芪桂枝五物湯有效成分可能作用于靶點蛋白的細胞核、細胞質、質膜、線粒體等部位，并通過RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、DNA復制、藥物反應、信號傳導、凋亡的負調控等生物過程，參與蛋白質、酶、轉錄因子、DNA等生命物質的結合作用，并影響蛋白質異二聚體、轉錄因子活性。KEGG通路富集分析中，PI3K-Akt、MAPK、NF-κB、缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)-1、叉頭框蛋白(forkhead box，FOX)O等信號通路富集靶點較多。PI3K-Akt作為一個經典的信號通路，國內學者劉福水等[27]發(fā)現，PI3K-Akt通路能介導頸后伸肌細胞的自噬、凋亡平衡；童秀冰等[28]在1項動物試驗中也發(fā)現，PI3K-Akt通路相關蛋白的表達可能影響頸椎間盤軟骨細胞的凋亡水平；此外，該通路已被證實能夠誘導退變髓核細胞的血管長入，抑制隨髓核細胞凋亡[29]，促進髓核細胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型膠原的表達[30]。MAPK通路是細胞信息傳遞的重要通路。國外研究證實，MAPK通路能夠抑制大鼠退行性頸椎間盤模型炎癥反應和基質變性[31]。國內學者董良杰等[32]發(fā)現，該通路能夠介導血清疼痛介質釋放，減輕頸椎病患者疼痛癥狀，并能抑制機體的炎癥反應。此外該通路還能促進髓核細胞增殖[33]，減弱髓核細胞的凋亡[34]，調節(jié)髓核細胞的自噬[14]；NF-κB通路廣泛存在于動物和人體細胞內，能夠參與細胞對外界刺激的響應。何堅等[35]認為，NF-κB通路可通過釋放多種炎癥因子減輕頸椎間盤的炎癥損傷。陳會濱等[36]在1項動物試驗研究中發(fā)現，藥物可能通過該通路對神經根型頸椎病發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用；FOXO是FOXO通路重要組成蛋白，研究證實該蛋白的缺失會促進椎間盤的退化[37]。值得一提的是，癌癥信號通路盡管富集靶點較多，但其報道頸椎病相關甚少，其與頸椎病的相關機制有待進一步研究證實。此外，本研究中PI3K-Akt、MAPK、NF-κB、HIF-1、FOXO等通路富集靶點較多并參與髓核細胞凋亡、炎性反應等過程，可能成為今后研究黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的重要方向。

綜上，本研究通過網絡藥理學方法，闡述了黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的活性成分、基因靶點、信號通路之間的相互關系，為今后黃芪桂枝五物湯治療頸椎病分子層面的深入研究提供參考。