沙棘、蘆薈、三七復(fù)配物對(duì)小鼠免疫力的影響

申開澤 萬慶家 王 艷 劉 莎 張應(yīng)龍 熊 宇

（1昭通學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南昭通 657000；2云南萬綠生物股份有限公司，云南玉溪 653300）

許多傳統(tǒng)中藥材具有多途徑、多靶點(diǎn)、多層次增強(qiáng)免疫的優(yōu)勢(shì)，是開發(fā)增強(qiáng)免疫功能產(chǎn)品的重要原料[1]。 沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）主產(chǎn)于我國四川、陜西、甘肅、寧夏、山西等地，多以果實(shí)入藥，中醫(yī)認(rèn)為其具有益氣生津、祛痰止咳、消食止瀉、活血散瘀等功效[2]?，F(xiàn)代研究表明，沙棘富含黃酮類、萜類、甾體類、蛋白質(zhì)和氨基酸類、有機(jī)酸類、多糖等成分，具有藥食兩用的價(jià)值[3]。沙棘在增強(qiáng)免疫力方面的功效已通過大量動(dòng)物試驗(yàn)研究證實(shí)[2-5]。最近的研究表明，沙棘多糖和果油是其發(fā)揮增強(qiáng)免疫功能的關(guān)鍵成分[6-7]。庫拉索蘆薈（Aloe vera L.）主要含多糖等功能成分，具有較好的增強(qiáng)免疫力作用[8-11]。三七（Panax notoginseng）中的總皂苷可從增強(qiáng)細(xì)胞免疫、增強(qiáng)體液免疫和自然殺傷細(xì)胞功能等多方面、多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[12-17]。本研究擬以沙棘果粉、庫拉索蘆薈提取物、三七提取物為主要原料開發(fā)復(fù)配產(chǎn)品，并對(duì)其進(jìn)行增強(qiáng)免疫力功能驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

沙棘果粉，由高原圣果沙棘制品有限公司提供；庫拉索蘆薈提取物（100∶1），由云南萬綠生物股份有限公司提供；三七提取物（三七總皂苷≥75%），由云南三七科技有限公司提供。3種功能原料復(fù)配結(jié)晶果糖、低聚果糖、三氯蔗糖和甜橙果粉等輔料制成沙棘、蘆薈、三七復(fù)配物，人體質(zhì)量按60 kg計(jì)，口服推薦量為每日1次，每次7.5 g（含沙棘果粉1.5 g、庫拉索蘆薈提取物1 g、三七總皂苷0.07 g），折合劑量為0.125 g/kg BW。

1.2 試驗(yàn)小鼠

采用體質(zhì)量為18～22 g的SPF級(jí)ICR雌性小鼠共200只進(jìn)行試驗(yàn)，小鼠購買自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。試驗(yàn)期間的動(dòng)物生存環(huán)境溫度為20～25℃，相對(duì)濕度為54%～58%。

1.3 主要儀器與試劑

1.3.1 主要儀器。MS-TS分析天平（梅特勒-托利多國際有限公司）；BBS-SDC潔凈工作臺(tái)（山東博科科學(xué)儀器有限公司）；離心機(jī)、Multiskan FC酶標(biāo)儀、二氧化碳培養(yǎng)箱（賽默飛世爾公司）；722S分光光度計(jì)（梅特勒-托利多國際有限公司）；顯微鏡（上海點(diǎn)應(yīng)光學(xué)儀器有限公司）。

1.3.2 試劑。綿羊紅細(xì)胞（SRBC）（北京博爾西科技有限公司）；生理鹽水（上海百特醫(yī)療用品有限公司）；Hank′s液（武漢卡諾斯科技有限公司）；RPMI1640 培養(yǎng)液（武漢普諾賽公司）；青鏈霉素（賽默飛世爾公司），ConA、Giemsa染液（美國 Sigma公司）；小牛血清（北京百奧萊博公司）；1%冰醋酸、1 mol/L的HCl溶液、0.1%的碳酸鈉、磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS緩沖液）（pH 值為 7.2～7.4），0.2 mol/L 的 Tris-HCl緩沖液（實(shí)驗(yàn)室配制）；SA緩沖液、雞紅細(xì)胞、補(bǔ)體（豚鼠血清）、MTT、YAC-1 細(xì)胞、都氏試劑、瓊脂糖、2.5%Triton（上海源葉生物科技有限公司）；酸性異丙醇、乳酸鈉、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸鹽、氧化型輔酶I、甲醇（分析純，廣東光華科技股份有限公司）；印度墨汁（上海哈靈生物科技有限公司）。

1.4 樣品劑量選擇和前處理

按人體推薦量的5倍、10倍和30倍設(shè)低、中、高3 個(gè)劑量組，即 0.625、l.250、3.750 g/kg BW。分別取復(fù)配物 6.25、12.5、37.5 g，用蒸餾水配制至 200 mL。

1.5 試驗(yàn)方法

將小鼠平均分為5個(gè)大組（每組40只），第一組開展碳廓清試驗(yàn)；第二組采用MTT法開展ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、NK細(xì)胞的活性測試；第三組開展臟體比值、半數(shù)溶血值（HC50）和抗體生成細(xì)胞數(shù)測定；第四組采用足跖腫脹法進(jìn)行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（delayed type hypersensitivity，DTH）試驗(yàn)；第五組開展小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)。每個(gè)大組隨機(jī)分為4個(gè)小組（每組10只），即低、中、高3個(gè)劑量組和1個(gè)空白對(duì)照組（CK）。各小組按照20 mL/kg BW對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，對(duì)照組用等量的蒸餾水，每日1次，持續(xù)30 d。數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化和統(tǒng)計(jì)分析采用Excel、SPSS軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)配物對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

與對(duì)照組相比，每個(gè)大組中的各劑量組小鼠在試驗(yàn)初期、中期和末期的體質(zhì)量及試驗(yàn)期間的體質(zhì)量變化均無顯著性差異（P＞0.05），說明復(fù)配物對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量及增長無明顯影響。

2.2 復(fù)配物對(duì)小鼠免疫器官臟器與體質(zhì)量比值的影響

各劑量組的小鼠胸腺與體質(zhì)量比值和脾臟與體質(zhì)量比值均與對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05），說明受試物對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的免疫器官臟器與體質(zhì)量比值無明顯影響（表1）。

表1 復(fù)配物對(duì)小鼠免疫器官臟器與體質(zhì)量比值的影響

2.3 復(fù)配物對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

采用足跖腫脹法進(jìn)行小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力測試。用藥24 h后，1.250 g/kg BW與3.750 g/kg BW劑量組的小鼠足跖腫脹度均與對(duì)照組有顯著性差異（P＜0.05），表明樣品能增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫。但采用MTT法開展ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明，各劑量組對(duì)淋巴細(xì)胞增殖能力（用OD差值表示）無顯著性影響（P＞0.05）（表 2）。

表2 復(fù)配物對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 復(fù)配物對(duì)小鼠體液免疫的影響

小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)檢測采用Jerne玻片改良法。結(jié)果顯示，1.250 g/kg BW和3.750 g/kg BW劑量組的溶血空斑數(shù)與對(duì)照組有顯著性差異（P＜0.05）；3.750 g/kg BW劑量能顯著提高小鼠的半數(shù)溶血值（HC50）（P＜0.05）。 試驗(yàn)綜合表明，復(fù)配物能顯著增強(qiáng)試驗(yàn)小鼠的體液免疫（表3）。

表3 復(fù)配物對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)和半數(shù)溶血值的影響

2.5 復(fù)配物對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

在小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能影響試驗(yàn)中，以吞噬指數(shù)（a）來表示復(fù)配物的碳廓清能力。結(jié)果表明，復(fù)配物各劑量組吞噬指數(shù)統(tǒng)計(jì)均與對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05）。在小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)中，各劑量組的吞噬率和吞噬指數(shù)與對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05）（表 4）。

表4 復(fù)配物對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清及巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞吞噬率的影響

2.6 復(fù)配物對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

各劑量組小鼠NK細(xì)胞活性均高于對(duì)照組，并隨劑量增高呈一定的遞增關(guān)系，而且1.250 g/kg BW和3.750 g/kg BW劑量組均與對(duì)照組有顯著性差異（P＜0.05）（表 5）。 由此可知，復(fù)配物能顯著提高小鼠NK細(xì)胞活性。

表5 復(fù)配物對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

3 結(jié)論與討論

本研究全面評(píng)價(jià)了沙棘、蘆薈、三七復(fù)配物對(duì)小鼠免疫力的影響。結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組比較，連續(xù)30 d每天 1次經(jīng)口灌胃給予小鼠 0.625、1.250、3.750 g/kg BW劑量，該復(fù)配物對(duì)小鼠體質(zhì)量增長、胸腺與體質(zhì)量比值、脾臟與體質(zhì)量比值無顯著影響，1.250、3.750 g/kg BW劑量能顯著提高小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力、NK細(xì)胞活性以及抗體生成細(xì)胞數(shù)，3.750 g/kg BW劑量能顯著提高小鼠半數(shù)溶血值?？梢钥闯?，沙棘、蘆薈、三七復(fù)配物具有增強(qiáng)免疫力的功能。本研究為以沙棘、庫拉索蘆薈和三七為功能原料進(jìn)行增強(qiáng)免疫力功能保健食品的開發(fā)提供了試驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。鑒于本研究只采用動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行了初步的功能驗(yàn)證，未進(jìn)行相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)，后續(xù)還應(yīng)盡量開展多中心、大樣本的隨機(jī)對(duì)照人體試食研究，以進(jìn)一步論證其功能。