水貂阿留申病碘凝集檢測(cè)技術(shù)

李鑫，劉進(jìn)軍，張偉濤，韓學(xué)良，劉潔，楊丹

（1.石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院/河北省毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖技術(shù)創(chuàng)新中心，河北石家莊 050041；2.河北省畜牧總站，河北石家莊 050035）

水貂阿留申病(AMD)又稱漿細(xì)胞增多癥(plas-macytasis)，是由主要侵害水貂免疫細(xì)胞的阿留申病毒(AMDV)感染所致，導(dǎo)致水貂自身免疫系統(tǒng)紊亂并引發(fā)強(qiáng)烈自身免疫反應(yīng)的慢性傳染性疾病[1]。水貂阿留申病毒（Aleutianmink diseasevirus，AMDV）屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒亞科阿留申病毒屬，是影響水貂養(yǎng)殖業(yè)的重要傳染病之一[2]。目前，該病無(wú)有效的疫苗和藥物能夠起到預(yù)防和治療作用，只能通過(guò)規(guī)?；木珳?zhǔn)檢測(cè)逐年將陽(yáng)性貂淘汰來(lái)抑制病毒的傳播。

阿留申病的檢測(cè)方法很多，主要分成兩大類(lèi)：AMDV基因檢測(cè)和血清學(xué)抗體檢測(cè)。AMDV基因檢測(cè)包括傳統(tǒng)PCR檢測(cè)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)、直接PCR檢測(cè)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)；血清學(xué)抗體檢測(cè)包括碘凝集試驗(yàn)法、對(duì)流免疫電泳法、膠體金試紙條法、斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法。其中碘凝集試驗(yàn)法被廣泛用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，雖為非特異性檢測(cè)，但在檢測(cè)過(guò)程中能夠快速檢出動(dòng)物是否患有慢性疫病[3]。該法相比于其他檢測(cè)法，操作簡(jiǎn)便、成本低、不需要昂貴的儀器投入，因此適合水貂養(yǎng)殖場(chǎng)阿留申病的初篩，被廣泛用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

1 阿留申病的危害

水貂阿留申病首次發(fā)現(xiàn)是在20世紀(jì)40年代后期，在美國(guó)發(fā)現(xiàn)了患有阿留申病的水貂，其全身被毛呈暗灰色，顏色表現(xiàn)與阿留申狐貍相似[4]。水貂被感染后，病毒在體內(nèi)復(fù)制，使巨噬細(xì)胞功能素亂，漿細(xì)胞增多，免疫球蛋白過(guò)度產(chǎn)生及免疫復(fù)合物在組織內(nèi)沉積出現(xiàn)超敏和自身免疫現(xiàn)象，從而導(dǎo)致抗原抗體復(fù)合物沉積造成組織損傷，病貂最終死于尿毒癥和繼發(fā)感染[5]，嚴(yán)重影響水貂繁殖機(jī)能和毛皮質(zhì)量，造成公貂配種能力下降，母貂空懷、流產(chǎn)、死胎及感染子代等，給養(yǎng)貂業(yè)造成極其嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，為水貂三大疫病之一。我國(guó)每年因阿留申病造成的經(jīng)濟(jì)損失初步估計(jì)超過(guò)50億元。該病普遍存在，感染率為30%～40%，有的高達(dá)80%～90%。

2 碘凝集檢測(cè)技術(shù)

2.1 材料

玻璃板（10厘米×10厘米）、牙簽、10微升移液器、毛細(xì)采血管（20微升肝素鈉抗凝的毛細(xì)玻璃管，長(zhǎng)度75毫米，直徑1.55毫米）、標(biāo)簽紙、記號(hào)筆、毛細(xì)管盒、指甲刀、工業(yè)橡皮泥。

2.2 樣品采集

每年結(jié)合選種工作，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)水貂群進(jìn)行3次阿留申病檢測(cè)。第一次在分窩初選時(shí)，第二次是在9～11月份終選時(shí)，第三次是在翌年2月份配種前，采集水貂血液作為檢測(cè)樣本進(jìn)行碘凝集檢測(cè)，將阿留申陽(yáng)性水貂檢測(cè)出并淘汰。

2.2.1水貂編號(hào)

由于毛細(xì)采血管比較細(xì)，無(wú)法在采血管上進(jìn)行編號(hào)，只能在采血管盒上編號(hào)，需要每個(gè)血液樣品與相應(yīng)的水貂籠進(jìn)行一一對(duì)應(yīng)，如果對(duì)應(yīng)不上，無(wú)法定位阿留申病陽(yáng)性水貂，檢測(cè)就失去意義。具體方法是水貂以12為一組與毛細(xì)管盒一一對(duì)應(yīng)進(jìn)行編號(hào)，編號(hào)方法為棟舍號(hào)+籠號(hào)。

2.2.2水貂保定

保定者戴上棉手套從籠內(nèi)抓取水貂，在該籠的產(chǎn)箱上進(jìn)行保定。

2.2.3血液采集

術(shù)者一手固定水貂后爪，另一手取滅菌的指甲刀在趾甲與趾墊的結(jié)合處剪斷趾甲，棄去第一滴血，然后將毛細(xì)采血管一端輕觸血滴，待血流入管的2/3處，用手指堵住毛細(xì)采血管的上端，另一端垂直插入工業(yè)用橡皮泥進(jìn)行封口。

2.2.4血樣保存

采血管按照編號(hào)順序放入毛細(xì)管盒中，將毛細(xì)管封口端朝下豎直放置，如果不能及時(shí)檢測(cè)，宜放置在4℃冰箱中保存。

2.2.5血漿制備

采集的血樣可用毛細(xì)采血管專用離心機(jī)2500～3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘也可在室溫或4℃冰箱內(nèi)放置過(guò)夜析出血漿。溶血的血樣應(yīng)棄去，重新采集。

2.3 碘凝集試驗(yàn)

2.3.1配制試劑

稱取碘化鉀4克、碘顆粒2克、蒸餾水30毫升，先將碘化鉀用少量的蒸餾水溶解于玻璃燒杯中，再加入碘顆粒，震蕩使其充分溶解，最后加入剩余的蒸餾水，充分混勻，放置于棕色瓶，靜置24小時(shí)即可使用，4℃冰箱保存。

2.3.2操作方法

將干凈的玻璃板平放，劃成24個(gè)方格，橫數(shù)4個(gè)格，縱數(shù)6個(gè)格，每格2.5厘米×1.5厘米，用砂輪輕劃毛細(xì)采血管血漿與紅細(xì)胞界面，掰斷毛細(xì)管，用10微升的移液器將血漿吹出，按順序滴到玻璃方格內(nèi)，每滴血漿旁加10微升的碘凝集試劑，然后用牙簽將二者混勻，每個(gè)血樣更換一個(gè)牙簽。

2.3.3結(jié)果判定

混勻后，1分鐘內(nèi)進(jìn)行觀察，結(jié)果判定見(jiàn)下表。

碘凝集試驗(yàn)結(jié)果判定

2.3.4試驗(yàn)記錄

將試驗(yàn)過(guò)程中檢測(cè)的血液樣本編號(hào)與檢測(cè)結(jié)果一一對(duì)應(yīng)記錄下來(lái)，還要將檢測(cè)時(shí)間、檢測(cè)人等信息一并記錄。

3 凈化措施

對(duì)檢出的陽(yáng)性水貂進(jìn)行嚴(yán)格的隔離淘汰處理，陽(yáng)性貂用過(guò)的籠具進(jìn)行嚴(yán)格消毒，淘汰的陽(yáng)性水貂可以轉(zhuǎn)到皮獸養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行飼養(yǎng)取皮。阿留申病毒能夠垂直傳播，因此陽(yáng)性貂產(chǎn)的仔貂會(huì)攜帶病毒，不能留作種用。阿留申陽(yáng)性貂與陰性貂要分開(kāi)飼養(yǎng)，建議將陽(yáng)性貂養(yǎng)在陰性貂的下分口方向，配種期間禁止陰性貂與陽(yáng)性貂交配，籠舍、用具、飼養(yǎng)人員都要嚴(yán)格區(qū)分，避免交叉感染。將阿留申病毒檢測(cè)作為每年的重點(diǎn)工作，通過(guò)碘凝集檢測(cè)及時(shí)淘汰陽(yáng)性貂，逐年提高陰性貂比例，最終達(dá)到凈化的目的。