半仿生酶法提取艾葉揮發(fā)油及微囊化制備工藝

黃宇玫，郭建業(yè)，袁鈺鋒，李夢(mèng)含，蔣柏泉，b

(南昌大學(xué)a.科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 共青城 332020；b.化學(xué)化工學(xué)院，江西 南昌 330031)

艾葉(又名艾草，艾蒿)具有較高的藥用價(jià)值，是我國(guó)南方很普遍的一種中草藥，來源廣泛，價(jià)廉易得。艾葉含多種生物有效活性成分，其中主要的有效活性成分之一是揮發(fā)油。艾葉揮發(fā)油主要應(yīng)用于化工醫(yī)療、食品安全、保健等各個(gè)領(lǐng)域，是食品、香料和生化工業(yè)中的一種重要原料[1]，目前從艾葉中提取揮發(fā)油已經(jīng)成為重要的研究熱點(diǎn)之一。

艾葉揮發(fā)油成分主要由脂肪類、萜類和芳香類化合物構(gòu)成，約100余種，主要為桉油精、側(cè)柏酮、龍腦、α-松油醇、β-松油烯、檸檬醛等，因其藥效成分復(fù)雜，提取得率較低，揮發(fā)油味道濃郁且易變質(zhì)，難以保存。有關(guān)艾葉揮發(fā)油的化學(xué)成分、藥理作用的研究較多[2-3]，但其制劑的研究鮮有報(bào)道。中藥材中植物藥占90%，其有效成分大多包裹在細(xì)胞壁中，傳統(tǒng)的熱水、酸、堿、有機(jī)溶劑浸提法,因受細(xì)胞壁纖維素的阻礙，往往提取效率較低。利用一定量的纖維素酶處理這些中藥材，可改變細(xì)胞壁的通透性，提高藥效成分的提取率。半仿生法是從生物藥劑學(xué)的角度出發(fā)，結(jié)合中醫(yī)所強(qiáng)調(diào)的整體觀，在傳統(tǒng)的分子藥物研究法的基礎(chǔ)上加入整體藥物研究法，對(duì)口服藥物在胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)過程的環(huán)境加以模擬，用近似胃腸道pH值的酸性或堿性提取液，依次連續(xù)提取得到藥物中有效成分的提取新技術(shù)，這樣提取得到的揮發(fā)油可以減輕機(jī)體消化的負(fù)擔(dān)，更利于人體的吸收[4-5]。艾葉揮發(fā)油氣味濃郁，易于揮發(fā)，微膠囊的作用可以屏蔽味道，改變體積、狀態(tài)，降低揮發(fā)性，起到隔離的作用。

本實(shí)驗(yàn)采用酶輔助半仿生法提取艾葉揮發(fā)油，確定其最優(yōu)提取工藝條件，并用復(fù)合凝聚法制備艾葉揮發(fā)油微膠囊，評(píng)價(jià)其生物利用率，為后續(xù)揮發(fā)油產(chǎn)品的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)，使艾葉資源具有更廣泛的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干艾葉(南陽仙草藥業(yè)有限公司)；鹽酸、無水乙醇、氫氧化鈣、甲醇、無水硫酸鈉、石油醚(60～90 ℃)、乙酸、氯化鈣、硫酸、丙酮，均為分析純；纖維素酶(酶活力為10 000 U·g-1，福州飛凈生物科技有限公司)；胃蛋白酶(國(guó)藥集團(tuán))；明膠、阿拉伯膠(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

MH-250型調(diào)溫型電熱套，北京科偉永興儀器有限公司；PH050A型干燥箱，上海一恒科技有限公司；磁力攪拌器，鄭州杜甫儀器廠；BA210型三目顯微鏡，麥克奧迪有限公司；TDL-50B型離心機(jī)，上海一恒科技有限公司

1.2 原料的預(yù)處理

將干燥的艾葉用粉碎機(jī)粉碎，然后過篩(篩孔尺寸為0.250 mm)，得到艾葉粗粉后貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 艾葉揮發(fā)油的提取

依據(jù)半仿生酶法[6-7]，稱取艾葉粗粉10 g，置于250 mL圓底燒瓶中，然后往圓底燒瓶中加入一定量水，調(diào)節(jié)溶液的pH為2.0,充分震蕩使其形成均一相，置于一定溫度的恒溫水浴鍋中加熱一定時(shí)間后過濾，取出濾液1。將濾渣重新置于圓底燒瓶中，繼續(xù)加入水一定量，調(diào)節(jié)溶液的pH為4.5，然后加入0.05 g纖維素酶，充分震蕩均勻后，置于一定溫度的恒溫水浴鍋中加熱一定時(shí)間后過濾，取出濾液2。將第2次分離出的濾渣置于圓底燒瓶中添加水一定量，調(diào)節(jié)溶液的pH為7.5，然后置于一定溫度的恒溫水浴鍋中加熱一定時(shí)間后過濾，取出濾液3。將第3次分離出的濾渣置于圓底燒瓶中并添加水一定量，調(diào)節(jié)溶液的pH為8.3，置于一定溫度的恒溫水浴鍋中加熱一定時(shí)間后過濾，取出濾液4。將4次提取出的濾液合并，然后用水蒸氣蒸餾裝置蒸餾，得到油水混合物，加入石油醚用分液漏斗萃取，靜置分層，放出下層水分，將上層的有機(jī)層倒出，將分液后的石油醚萃取液用無水硫酸鈉除去剩余的水分，減壓濃縮即得艾葉揮發(fā)油，最后將艾葉揮發(fā)油稱重，計(jì)算最終提取率[8]。

艾葉揮發(fā)油提取率的計(jì)算：

y=m1/m×100%

式中：y為揮發(fā)油提取率，%；m1為艾葉揮發(fā)油質(zhì)量，g；m為艾葉粗粉質(zhì)量，g。

1.4 艾葉揮發(fā)油提取工藝的優(yōu)化

1.4.1 提取溫度的選擇

取10 g艾葉粗粉，根據(jù)上述半仿生酶法的步驟，固定提取時(shí)間和料液比，設(shè)置水浴溫度分別為40，50，60，70，80 ℃，考察不同溫度對(duì)艾葉揮發(fā)油提取率的影響，并確定較適宜的提取溫度[9]。

1.4.2 提取時(shí)間的選擇

取10 g艾葉粗粉，利用上述半仿生酶法的步驟，固定提取溫度(1.4.1確定的較適宜提取溫度)和料液比，設(shè)置提取時(shí)間分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，考察不同提取時(shí)間對(duì)艾葉揮發(fā)油提取率的影響，并確定較適宜的提取時(shí)間。

1.4.3 料液比的選擇

取10 g艾葉粗粉，利用上述半仿生酶法的步驟，固定提取溫度(1.4.1確定的較適宜提取溫度)和提取時(shí)間(1.4.2確定的較適宜提取時(shí)間)，設(shè)置料液比分別為1:6，1:8，1:10，1:12和1:14，考察不同料液比對(duì)艾葉揮發(fā)油提取率的影響，并確定較適宜的料液比。

取單因素實(shí)驗(yàn)初步確定的較適宜的提取溫度，提取時(shí)間和料液比作為考察因素，每個(gè)因素各選取3個(gè)水平，以揮發(fā)油提取率為考察目標(biāo)，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定最佳工藝參數(shù)[9]。

1.5 微膠囊的制備與穩(wěn)定性測(cè)試

采用復(fù)合凝聚法[10]。該方法是一種將芯材分散在兩種帶相反電荷的混合壁材溶液中，通過改變體系的pH值、溫度等因素，使混合壁材溶液相互作用形成復(fù)合物，隨后降低溶解度，使其凝聚，析出，形成微膠囊的方法。

1.5.1 明膠-阿拉伯膠混合溶液的制備

稱取5 g明膠，加入100 mL蒸餾水，浸泡一段時(shí)間使明膠溶脹后于60 ℃下加熱溶解，50 ℃下保存?zhèn)溆谩７Q取5 g阿拉伯膠，加入100 mL蒸餾水，40 ℃下加熱溶解，45 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

45 ℃下兩者混合水浴加熱。

1.5.2 微膠囊的制備

將4 mL艾葉揮發(fā)油滴加到混合溶膠中，45 ℃下水浴加熱，滴加6%乙酸溶液，調(diào)節(jié)pH至4左右，2 500 r·min-1分散3 min。將400 mL 30 ℃左右的溫水加入到混合溶液中，1 500 r·min-1下攪拌30 min后，放置于冰浴中降溫至10 ℃。隨后加入2 mL的37%甲醛溶液攪拌15 min進(jìn)行固化。加入4%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為8，一直攪拌，直至有沉降物析出，靜置[11-12]。

待沉降完全后，用滴管吸取上清液，在3 500 r·min-1下離心15 min，最后將得到的微囊用蒸餾水洗至無甲醛味，放入干燥箱中于30 ℃下干燥即得。用吸管取一滴微膠囊懸浮液，滴在載玻片上，顯微鏡下拍照觀察。

1.5.3 穩(wěn)定性測(cè)試方法

模擬胃液的配制：精密量取23.4 mL濃鹽酸倒入100 mL容量瓶，加水稀釋定容，制成10%稀鹽酸溶液。

取稀鹽酸1.64 mL于燒杯，加適量水稀釋將稀鹽酸pH調(diào)節(jié)為2，加入胃蛋白酶1 g搖勻，溶液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，加水稀釋定容即得。

模擬胃液耐受性考察:100 mL燒杯中加入1 g微膠囊，加入配置好的模擬胃液10 mL，搖勻，于恒溫油浴鍋中37 ℃、160 r·min-1，攪拌溶解，每隔半小時(shí)調(diào)節(jié)pH。釋放特性：根據(jù)以下公式計(jì)算微膠囊的釋放率。

式中：F為微膠囊釋放率，%；mt為時(shí)間t內(nèi)釋放的揮發(fā)油的質(zhì)量，g；m0為初始微膠囊中揮發(fā)油的質(zhì)量，g。

貯藏穩(wěn)定性考察：分別取1 g微膠囊在20，40，60 ℃恒溫箱中放置10 h后測(cè)微膠囊釋放率。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取溫度的影響

艾葉揮發(fā)油提取率隨提取溫度的變化見圖1。

θ/℃圖1 提取溫度對(duì)揮發(fā)油提取率的影響Fig.1 Effet of extraction temperature on yield of volatile oil

由圖1可知，當(dāng)提取溫度從40 ℃升到60 ℃時(shí),艾葉揮發(fā)油提取率隨溫度升高而提高，且在60 ℃時(shí)達(dá)最高值，但是當(dāng)溫度從60 ℃升溫到80 ℃時(shí)，艾葉揮發(fā)油提取率呈下降趨勢(shì)。由此可知，溫度升高有利于艾葉揮發(fā)油提取率的提高，但溫度過高反而會(huì)使提取率下降，由于溫度過高使酶活性下降，導(dǎo)致分解艾葉細(xì)胞壁效果降低。參考同類實(shí)驗(yàn)[13]，本實(shí)驗(yàn)取60 ℃為較適宜的提取溫度。

2.1.2 提取時(shí)間的影響

艾葉揮發(fā)油提取率隨提取時(shí)間的變化見圖2。

由圖2可知，當(dāng)提取時(shí)間從1.0 h增加到2.0 h時(shí)，艾葉揮發(fā)油的提取率有顯著的提高，但當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)至3.0 h后，發(fā)現(xiàn)艾葉揮發(fā)油提取率變化不大，說明在本實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到2.0 h時(shí)，艾葉揮發(fā)油提取率已接近最大值，再增加提取時(shí)間意義不大，且增加能源損耗，因此本實(shí)驗(yàn)取2 h為較適宜的提取時(shí)間。

t/h圖2 提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取率的影響Fig.2 Effet of extraction time on yield of volatile oil

2.1.3 料液比的影響

艾葉揮發(fā)油提取率隨料液比ρ的變化見圖3。

ρ/(g·mL-1)圖3 料液比對(duì)揮發(fā)油提取率的影響Fig.3 Effet of power/liquid ratio on yield of volatile oil

由圖3可知，當(dāng)料液比ρ在(1:6)～(1:12)范圍內(nèi)，艾葉揮發(fā)油的提取率呈上升趨勢(shì)，且在料液比為1:12時(shí)達(dá)到最高。由此可知，當(dāng)料液比高時(shí)，艾葉粗粉不能充分與水接觸，揮發(fā)油浸出量低；隨著料液比減小，加入的水量增大，揮發(fā)油與水之間兩相的接觸面積增大，有利于揮發(fā)油的自由擴(kuò)散和溶解析出，使得提取率得以升高。但當(dāng)料液比小于1:12后，提取率不升反降，且增加能耗。因此本實(shí)驗(yàn)取1:12為較適宜的料液比。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別選取提取溫度θ=60 ℃、提取時(shí)間t=2.0 h和料液比ρ=1:12為中心水平，以提取率為考察目標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并開展實(shí)驗(yàn)L9(34)，確定艾葉揮發(fā)油提取的最佳工藝參數(shù)。

正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素與水平Tab.1 Factors and levels of experiment

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 半仿生酶法優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Semi bionic enzyme orthogonal test results

由表2可知，3個(gè)因素的極差分別為：提取溫度(RA)1.02，提取時(shí)間(RB)0.88，料液比(RC)0.57，它們之間的大小關(guān)系為RA>RB>RC，由此可得出3種因素對(duì)艾葉揮發(fā)油提取率的影響大小為：A(提取溫度)>B(提取時(shí)間)>C(料液比)。表中第5組實(shí)驗(yàn)(A2B2C3)所獲得的提取率為9組實(shí)驗(yàn)中最大(2.20%)，但小于單因素實(shí)驗(yàn)較適宜組合(A2B2C2)時(shí)的提取率(2.23%)。又根據(jù)KA2>KA3>KA1,KB3>KB2>KB1,KC2>KC3>KC1，可得另一可能的最優(yōu)組合為A2B3C2,但該組合實(shí)驗(yàn)未在表2中出現(xiàn)，按此條件做3次平行實(shí)驗(yàn)，得平均提取率為2.24%,略高于因素水平組合A2B2C2的提取率。

考慮節(jié)省時(shí)間和能耗，最終確定酶輔助半仿生法提取艾葉揮發(fā)油的最優(yōu)參數(shù)為A2B2C2，即提取溫度60 ℃，提取時(shí)間2.0 h，料液比1:12，在此條件下可獲得較高的揮發(fā)油提取率。

2.3 微膠囊性能測(cè)試

2.3.1顯微鏡觀察

按1.5.2制備的艾葉揮發(fā)油的微膠囊。圖4為100倍顯微鏡下的微膠囊圖。

圖4 100倍顯微鏡下艾葉揮發(fā)油微膠囊圖Fig.4 Microcapsules of Artemisia vulgaris volatile oil at 100x magnification

在顯微鏡下觀察可見，微膠囊呈雙層結(jié)構(gòu)，可以清晰地觀察到內(nèi)部包裹著油狀液體,包被完整。

2.3.2 載藥量

載藥量L的計(jì)算公式如下：

式中:m3為微囊內(nèi)藥量,g；m2為微囊總質(zhì)量,g；L為載藥量，%。

表3 3次實(shí)驗(yàn)的測(cè)量結(jié)果Tab.3 Result of three experiments

2.3.3 包埋率

包埋率E的計(jì)算公式如下：

式中：m5為微囊表面油含量,g；m4為加入總油量，g。

2.3.4 穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

2.3.4.1 對(duì)模擬胃液的耐受性

微膠囊在模擬胃液中隨時(shí)間的變化見表4。

2.3.4.2 在模擬消化液中的釋放特性

在模擬消化液中時(shí)間與釋放率之間的關(guān)系見圖5。

t/h圖5 時(shí)間與釋放率之間的關(guān)系Fig.5 Relationship between time and release rate

不同食物在胃液中停留時(shí)間各不相同，水僅停留幾分鐘，油脂類最長(zhǎng)可達(dá)5 h，艾葉揮發(fā)油微膠囊在模擬消化液中的釋放曲線如圖5所示，在模擬胃環(huán)境中壁材逐漸破裂，在前3 h內(nèi)由于內(nèi)外濃度差大，釋放速度較快,而后由于胃酸不能完全水解壁材，濃度差降低，揮發(fā)油的釋放速度明顯降低，4 h過后釋放量率達(dá)到60%后幾乎不變，說明在胃液環(huán)境中已完成主要成分的釋放。

2.3.4.2 穩(wěn)定性

溫度與釋放率之間的關(guān)系見圖6。

θ/℃圖6 溫度與釋放率之間的關(guān)系Fig.6 Relationship between temperature and release rate

由于復(fù)合壁材在高溫情況下遭到破壞，出現(xiàn)縫隙，因此芯材會(huì)以一定速度釋放，由圖6可以觀察分析出溫度升高到40 ℃之后，阿拉伯膠開始溶解，膠囊壁開始出現(xiàn)裂痕，釋放少量芯材，60 ℃后到達(dá)明膠熔點(diǎn)后，膠囊壁完全裂解，芯材釋放率增加，超過60%，由此可以看出膠囊穩(wěn)定性很好，常溫下因?yàn)楸诓牡谋Ｗo(hù)不易揮發(fā)，可以提高揮發(fā)油常溫的保存率，同時(shí)提高了揮發(fā)油的熱穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

以艾葉為原料，通過半仿生酶法提取艾葉揮發(fā)油，在設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù)。在酶輔助半仿生法提取艾葉揮發(fā)油的條件下，發(fā)現(xiàn)提取溫度對(duì)提取率影響最大，其次是提取時(shí)間和料液比。確定的最佳提取工藝參數(shù)分別是提取溫度為60 ℃，提取時(shí)間為2 h，料液比為1:12，提取率為2.23%。將提取的艾葉揮發(fā)油利用復(fù)合凝聚法制備微膠囊，最優(yōu)的壁材配比為阿拉伯膠與明膠1:1，加入少量吐溫，乳化效果更好，用壁材量20%的甲醛進(jìn)行交聯(lián)，攪拌轉(zhuǎn)速2 500 r·min-1，包埋率可達(dá)到83.5%，效果最佳。經(jīng)過模擬胃液測(cè)試證明制備的微膠囊可以穩(wěn)定釋放，且常溫下能夠穩(wěn)定保存，極大地提高了艾葉揮發(fā)油的保存率和熱穩(wěn)定性。