阿托伐他汀激活A(yù)MPK通路抑制COPD小鼠膈肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用機制

任慧敏， 韓樹池， 楊 淼， 王 慧， 劉宏強

膈肌是呼吸運動主要的驅(qū)動力，在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)的發(fā)病過程中，長期氣流受限會增加膈肌負荷，引起膈肌萎縮及收縮力下降。膈肌萎縮及收縮力下降會加重COPD患者的肺功能減退、嚴重者引起呼吸衰竭，影響疾病的長期預(yù)后[1-2]。相關(guān)研究認為，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress， ERS)介導(dǎo)的細胞凋亡是COPD發(fā)病過程中導(dǎo)致膈肌功能障礙的重要因素[3]。因此，研究膈肌ERS的調(diào)控機制有助于深入認識COPD發(fā)病機制、發(fā)現(xiàn)COPD新的治療靶點。

阿托伐他汀是臨床廣泛使用的降脂藥物，近年其抗炎和改善氣道功能的作用受到關(guān)注。國內(nèi)外臨床研究和基礎(chǔ)研究均證實阿托伐他汀對COPD的氣道功能及炎癥反應(yīng)具有抑制作用[4-6]。另有動脈粥樣硬化及脂肪肝相關(guān)的動物實驗證實，阿托伐他汀通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase， AMPK)的方式減輕ERS[7-8]，但阿托伐他汀在COPD發(fā)病過程中調(diào)控ERS的作用機制尚不清楚。本文將以膈肌ERS為靶點，在野生型(wild type， WT)小鼠及AMPK基因敲除(knockout， KO)小鼠中研究阿托伐他汀激活A(yù)MPK通路抑制COPD小鼠膈肌ERS的作用機制。

1 材料與方法

1.1動物 WT C57BL/6J小鼠(上海西普爾-必凱實驗動物公司)，生產(chǎn)許可SCXK(滬)2018-0006；AMPK KO小鼠(遺傳背景C57BL/6J)購自北京唯德生物科技有限公司。

1.2試劑 玉溪香煙(紅塔煙草基團)，焦油量10 mg、煙氣煙堿量0.9 mg、一氧化碳量 10 mg、84 mm；阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥)；HE染色試劑盒(上海歌凡生物公司)，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天公司)，AMPK、p-AMPK、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、肌醇酶1α(IRE1α)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-12一抗(Abcam公司)，真核起始因子2α(eIF2α)及磷酸化真核起始因子2α(p-eIF2α)一抗(CST公司)。

1.3儀器 小動物肺功能儀(上海塔望智能科技公司)，顯微鏡(Nikon公司)，凝膠電泳及成像系統(tǒng)(上海天能公司)。

1.4方法

1.4.1 動物分組、造模及給藥 WT C57BL/6J小鼠隨機分為AMPK-WT組、AMPK-WT+COPD組和AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀組，AMPK KO小鼠隨機分為AMPK-KO組、AMPK-KO+COPD組和AMPK-KO+COPD+阿托伐他汀組，每組各8只。采用香煙煙霧吸入法建立COPD模型：將小鼠放入40 cm×25 cm×20 cm的薰煙箱進行煙霧吸入，每日上午2次、下午2次，每次持續(xù)45 min、每次使用1支香煙，上午2次及下午2次的間隔為10 min，每周一至周五進行煙霧吸入，連續(xù)進行12周。阿托伐他汀干預(yù)參照何永鴻等[5]的研究進行，方法如下：造模第7周起，每天煙霧吸入前1 h給予阿托伐他汀10 mg/kg灌胃、1次/d，連續(xù)6周。

1.4.2 氣道功能檢測 腹腔注射1%戊巴比妥鈉、劑量40 mg/kg，麻醉后進行氣管插管，與小動物肺功能儀連接，測定0.3 s用力呼氣容積(forced expiratory volume in 0.3 second， FEV0.3)占用力肺活量(forced vital capacity， FVC)的比值(FEV0.3/FVC)、呼氣峰流速(peak expiratory flow， PEF)。

1.4.3 肺組織及膈肌病理改變的HE染色 完成氣道功能檢測后處死小鼠，解剖得到適量肺組織及膈肌組織，4%多聚甲醛固定后制作厚度4 μm的病理切片，采用HE染色試劑盒進行染色，按照試劑盒說明書進行操作，在顯微鏡下觀察肺組織及膈肌組織病理改變。

1.4.4 膈肌組織細胞凋亡率的TUNEL檢測 另取膈肌組織的病理切片，采用TUNEL試劑盒進行染色，按照試劑盒說明書進行操作，在顯微鏡下觀察TUNEL陽性染色和DAPI陽性染色的細胞并計數(shù)，凋亡率=TUNEL陽性細胞數(shù)/DAPI陽性細胞數(shù)×100%。

1.4.5 膈肌組織中蛋白表達的Western blot檢測 另取適量膈肌組織，加入RIPA裂解液并勻漿，提取得到蛋白后采用BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度取30 μg蛋白加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進行Western blot實驗，電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，孵育1∶1000稀釋的p-AMPK、AMPK、PERK、IRE1α、ATF6、PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP、Caspase-12一抗或1∶3000稀釋的β-actin一抗過夜，孵育1∶2000稀釋的二抗1 h，在凝膠成像系統(tǒng)中顯影并計算蛋白條帶吸光度，以β-actin為內(nèi)參，對p-AMPK、AMPK、PERK、IRE1α、ATF6、PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP、Caspase-12的表達水平進行半定量分析。

1.4.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)均為計量資料，經(jīng)正態(tài)性檢驗符合正態(tài)分布，多組間比較采用方差分析、差異有統(tǒng)計學(xué)意義的資料進一步采用LSD-t檢驗進行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1氣道功能比較 與AMPK-WT組比較，AMPK-WT+COPD組小鼠的FEV0.3/FVC、PEF明顯降低(P<0.05)；與AMPK-WT+COPD組比較，AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀組小鼠的FEV0.3/FVC、PEF明顯增加(P<0.05)，AMPK-KO+COPD組小鼠的FEV0.3/FVC、PEF明顯降低(P<0.05)；與AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀組比較，AMPK-KO+COPD+阿托伐他汀組小鼠的FEV0.3/FVC、PEF明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠氣道功能的比較

2.2肺組織及膈肌病理改變

2.2.1 肺組織 AMPK-WT組和AMPK-KO組小鼠肺組織內(nèi)支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)規(guī)則；AMPK-WT+COPD組小鼠肺組織內(nèi)肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、肺泡壁破裂、肺泡腔擴大；AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀組小鼠肺組織病理改變較AMPK-WT+COPD組減輕；AMPK-KO+COPD組小鼠肺組織病理改變較AMPK-WT+COPD組加重；AMPK-KO+COPD+阿托伐他汀組小鼠肺組織病理改變較AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀組加重。見圖1。

2.2.2 膈肌 AMPK-WT組和AMPK-KO組小鼠膈肌內(nèi)肌纖維排列規(guī)整；AMPK-WT+COPD組小鼠膈肌內(nèi)肌纖維斷裂、排列混亂；AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀組小鼠膈肌病理改變較AMPK-WT+COPD組減輕；AMPK-KO+COPD組小鼠膈肌病理改變較AMPK-WT+COPD組加重；AMPK-KO+COPD+阿托伐他汀組小鼠膈肌病理改變較AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀組加重。見圖2。

2.3膈肌中p-AMPK表達 AMPK-WT+COPD組小鼠膈肌中p-AMPK表達較AMPK-WT組增加(P<0.05)；AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀組小鼠膈肌中p-AMPK表達較AMPK-WT+COPD組增加(P<0.05)。AMPK-KO組、AMPK-KO+COPD組和AMPK-KO+COPD+阿托伐他汀組小鼠膈肌中均不表達AMPK和p-AMPK。見圖3。

2.4膈肌中細胞凋亡率 AMPK-WT+COPD組膈肌中細胞凋亡率較AMPK-WT組增加(P<0.05)；AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀組膈肌中細胞凋亡率較AMPK-WT+COPD組降低(P<0.05)；AMPK-KO+COPD組膈肌中細胞凋亡率較AMPK-WT+COPD組增加(P<0.05)；AMPK-KO+COPD+阿托伐他汀組膈肌中細胞凋亡率較AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀組增加(P<0.05)。見圖4。

2.5膈肌中ERS通路比較 AMPK-WT+COPD組膈肌中PERK、IRE1α、ATF6表達較AMPK-WT組增加(P<0.05)；AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀組膈肌中PERK表達較AMPK-WT+COPD組降低(P<0.05)，IRE1α、ATF6表達與AMPK-WT+COPD組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；AMPK-KO+COPD組小鼠膈肌中PERK、IRE1α、ATF6表達較AMPK-WT+COPD組增加(P<0.05)；AMPK-KO+COPD+阿托伐他汀組膈肌中PERK、IRE1α、ATF6表達較AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀組增加(P<0.05)。見表2、圖5。

表2 各組小鼠膈肌中PERK、IRE1α、ATF6表達比較

2.6膈肌中PERK下游基因表達 AMPK-WT+COPD組膈肌中p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12表達較AMPK-WT組增加(P<0.05)；AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀組膈肌中p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12表達較AMPK-WT+COPD組降低(P<0.05)；AMPK-KO+COPD組膈肌中p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12表達較AMPK-WT+COPD組增加(P<0.05)；AMPK-KO+COPD+阿托伐他汀組膈肌中p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12表達較AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀組增加(P<0.05)。見圖6、表3。

表3 各組小鼠膈肌中p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12表達比較

3 討論

近些年，臨床常用的降脂藥物阿托伐他汀在COPD治療中的價值受到越來越多關(guān)注。有臨床研究[4]報道阿托伐他汀改善COPD患者的氣道功能，也有基礎(chǔ)研究[5-6]證實阿托伐他汀改善COPD模型動物肺組織的ERS及炎癥反應(yīng)。本研究采用被動香煙煙霧吸入的方法建立COPD小鼠模型，造模后給予阿托伐他汀干預(yù)并發(fā)現(xiàn)氣道功能指標FEV0.3/FVC、PEF增加，肺組織內(nèi)肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、肺泡壁破裂、肺泡腔擴大及炎癥細胞浸潤等病理改變明顯改善，與既往研究[5-6]報道一致。COPD病情的發(fā)展變化不僅涉及肺組織炎癥反應(yīng)激活等病理改變，還與膈肌萎縮及收縮力下降密切相關(guān)。長期氣流受限、呼吸肌負荷增加是造成COPD患者膈肌功能障礙的重要因素，為了更加全面了解阿托伐他汀在COPD治療中的價值，本研究以膈肌功能障礙為切入點，觀察了其對COPD小鼠膈肌的影響及機制。

COPD發(fā)病過程中膈肌功能障礙的組織學(xué)特征為肌纖維斷裂、生物學(xué)特征為膈肌細胞凋亡[9-10]。本研究在被動香煙煙霧吸入建立的COPD模型小鼠中觀察到膈肌內(nèi)肌纖維大量斷裂、細胞凋亡率明顯增加，與既往其他研究[9-10]關(guān)于COPD發(fā)病過程中膈肌組織學(xué)特征及生物學(xué)特征的報道一致。從造模第7周起給予阿托伐他汀灌胃干預(yù)、連續(xù)6周，經(jīng)阿托伐他汀干預(yù)后，COPD小鼠膈肌中肌纖維斷裂明顯改善，細胞凋亡率明顯降低，表明阿托伐他汀對COPD小鼠的膈肌功能障礙具有改善作用，這一現(xiàn)象是對既往阿托伐他汀改善COPD氣道功能及肺組織病理改變等實驗結(jié)果的補充，從改善膈肌功能障礙的角度揭示了阿托伐他汀治療COPD的價值，進而有助于今后更加全面地認識阿托伐他汀在COPD治療中的價值。在此基礎(chǔ)上，本研究還深入探究了阿托伐他汀改善膈肌障礙的相關(guān)分子機制。

ERS是在吸煙、感染、缺氧等病理條件下調(diào)控細胞凋亡的重要生物學(xué)環(huán)節(jié)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是負責(zé)蛋白質(zhì)合成、加工、轉(zhuǎn)運的細胞器，發(fā)生ERS時未折疊及錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集，進而通過下游PERK、IRE1α、ATF6三種膜蛋白進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引起未折疊蛋白反應(yīng)，促進細胞凋亡的發(fā)生[11-13]。有研究報道，COPD患者膈肌中存在過度激活的ERS及未折疊蛋白反應(yīng)[4]。本研究在COPD小鼠的膈肌中檢測到ERS的三種信號蛋白PERK、IRE1α、ATF6均表達增加，與既往臨床研究的結(jié)果吻合。阿托伐他汀抑制ERS的作用已經(jīng)在動脈粥樣硬化模型、脂肪肝模型中得到證實[7-8]，本研究在COPD小鼠接受阿托伐他汀干預(yù)后檢測到膈肌中PERK的表達水平降低，IRE1α、ATF6的表達無明顯變化，表明阿托伐他汀抑制COPD小鼠膈肌中PERK介導(dǎo)的ERS。

在PERK介導(dǎo)ERS激活的過程中，高表達的PERK能夠引起eIF2α磷酸化，而后依次引起ATF4、CHOP表達增加，最終增加cleaved caspase-12表達增加并介導(dǎo)細胞凋亡[14-16]。為了進一步驗證膈肌中PERK介導(dǎo)的ERS及細胞凋亡在COPD發(fā)病及阿托伐他汀發(fā)揮治療價值中的作用，本研究對PERK下游的四種蛋白進行了檢測。COPD模型小鼠膈肌中p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12的表達水平均明顯增加，與PERK表達及細胞凋亡率增加的結(jié)果一致。經(jīng)阿托伐他汀干預(yù)后，COPD小鼠膈肌中p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12的表達水平均明顯降低，與阿托伐他汀抑制COPD小鼠膈肌中PERK表達及細胞凋亡的作用吻合。由此進一步確認阿托伐他汀對COPD小鼠膈肌中PERK介導(dǎo)ERS的抑制作用。

根據(jù)Xiong等[7]及Zhang等[8]的研究，阿托伐他汀抑制ERS的作用與激活A(yù)MPK通路有關(guān)。AMPK是具有廣泛生物學(xué)作用的絲蘇氨酸激酶，炎癥、缺氧、吸煙等應(yīng)激因素能夠促進AMPK發(fā)生磷酸化并代償性起到抗炎、抗ERS等作用[17-18]。已有研究[19-21]在COPD中證實肺組織中p-AMPK的表達增加，使用AMPK激動劑顯著減輕COPD的肺組織病理改變。本研究在COPD模型小鼠的膈肌中檢測到p-AMPK的表達水平增加，與既往其他學(xué)者關(guān)于COPD發(fā)病過程中AMPK通路激活、p-AMPK表達增加的研究結(jié)果[19-20]一致；同時本研究還在阿托伐他汀干預(yù)后觀察到COPD小鼠膈肌中p-AMPK的表達水平進一步增加，提示阿托伐他汀在COPD中的治療價值可能與激活A(yù)MPK通路有關(guān)。

為了深入認識AMPK通路在COPD膈肌功能障礙及阿托伐他汀減輕膈肌PERK介導(dǎo)ERS中的作用，本研究通過Cre-Loxp系統(tǒng)獲得了AMPK基因敲除小鼠，采用被動香煙煙霧吸入法建立AMPK基因敲除的COPD小鼠模型，與野生型COPD小鼠比較，敲除AMPK后COPD模型小鼠的氣道功能減退及肺組織病理改變均加重，表明AMPK在COPD發(fā)病過程中起到氣道保護作用，與既往AMPK激動劑改善COPD病情的報道[21]一致。進一步觀察膈肌情況發(fā)現(xiàn)，敲除AMPK后COPD模型小鼠膈肌內(nèi)肌纖維斷裂、細胞凋亡及PERK介導(dǎo)的ERS均明顯加劇，表明AMPK在COPD的膈肌功能障礙中起保護作用。在AMPK基因敲除的COPD小鼠接受阿托伐他汀干預(yù)后，與阿托伐他汀在野生型COPD小鼠中改善膈肌內(nèi)肌纖維斷裂、細胞凋亡及PERK介導(dǎo)ERS的作用比較，敲除AMPK基因使阿托伐他汀的上述改善作用明顯減弱，表明阿托伐他汀改善COPD小鼠膈肌功能障礙及膈肌中PERK介導(dǎo)ERS的作用與激活A(yù)MPK通路有關(guān)。

綜上所述，本研究為深入認識AMPK通路在COPD發(fā)病中的作用及阿托伐他汀在COPD治療中的作用提供了依據(jù)。首先，AMPK通路在COPD的發(fā)病中起保護作用，對氣道功能、肺組織病理改變及膈肌功能障礙均有改善作用，敲除AMPK后COPD病情加重；第二，阿托伐他汀明顯改善COPD小鼠的氣道功能、肺組織病理改變和膈肌功能障礙，其中阿托伐他汀改善膈肌功能障礙是本項目的創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)之一；第三，阿托伐他汀改善膈肌功能障礙的作用與其通過激活A(yù)MPK通路減輕膈肌中PERK介導(dǎo)的ERS有關(guān)。