氨基酸和氨基葡萄糖在離子對LC-MS中保留規(guī)律及應(yīng)用研究

孫 杰，孫 月，李 博 (.南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院，江蘇南京 298；2.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 20009；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 20095；4.中國藥科大學(xué)(杭州)創(chuàng)新藥物研究院，浙江杭州 30038)

殼寡糖又叫殼聚寡糖、幾丁寡糖、低聚殼聚糖，學(xué)名β-1，4-寡糖-葡萄糖胺，是殼聚糖經(jīng)水解得到的一類聚合度在2～20的低聚物，也是天然糖中唯一大量存在的堿性氨基寡糖，其具有水溶性較好、功能作用大、生物活性高、易被人體吸收等特點。目前，殼寡糖已經(jīng)被應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、日用化工等領(lǐng)域，在人們生活中扮演著越來越重要的作用。隨著對殼寡糖研究的不斷深入，其檢測技術(shù)方法也不斷增多，但目前對于殼寡糖中氨基酸含量測定的相關(guān)研究相對較少，所以該研究旨在建立一種測定殼寡糖中總氨基酸含量的方法。

用于氨基酸分析的離子對色譜技術(shù)已被廣泛使用，發(fā)展成熟。離子對色譜法中應(yīng)用較廣的是反相離子對色譜法，它適用于經(jīng)典反相色譜柱，具有操作簡單、分析周期短等優(yōu)勢。其中，離子對試劑是反相離子對色譜法實現(xiàn)上述優(yōu)點的關(guān)鍵因素。在氨基酸分析中一般在流動相中添加陰離子對試劑改善各氨基酸在經(jīng)典色譜柱上的分離，例如烷基磺酸鹽，常用的有正戊磺酸鈉、正己磺酸鈉和正庚磺酸鈉等。未衍生的氨基酸的紫外吸收較弱，常采用質(zhì)譜作為檢測器，因為相比于烷基磺酸鹽而言，全氟羧酸具有較低表面能、沸點更低等特點，因此更適合質(zhì)譜(MS)檢測器。常用的全氟羧酸有三氟乙酸(TFA)、七氟丁酸(HFBA)、九氟戊酸(NFPA)、全氟庚酸(TDFHA)和全氟辛酸(PDFOA)等。該研究采用離子對色譜法，考察pH、離子對試劑種類和濃度等對氨基酸和氨基葡萄糖色譜保留行為的影響，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化氨基酸和氨基葡萄糖分離條件，建立殼寡糖中氨基酸的離子對LC-MS色譜分析方法。

1 材料與方法

氨基酸對照品：丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、賴氨酸(Lys)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、蛋氨酸(Met)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)，購自BHD Chemicals Ltd.，Poole England，純度>98.5%；氨基丁酸(內(nèi)標(biāo))，購自BHD Chemicals Ltd.，Poole England，純度>98.5%；氨基葡萄糖對照品，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，純度>99.0%；七氟丁酸，購自Sigma-Aldrich公司，純度>99.0%；全氟庚酸，購自Sigma-Aldrich公司，純度>99.0%；水為Milli-Q蒸餾水(去離子水)；乙腈、甲酸、醋酸銨均為色譜純；其他試劑為分析純。殼寡糖樣品(產(chǎn)地?zé)o錫)。

TQS LC-MS/MS聯(lián)用儀，美國Finnigan公司；Xcalibur1.1工作站，美國Finnigan公司；EL104分析天平，瑞士梅特勒公司；FE20 pH計，瑞士梅特勒公司。

氨基酸和氨基葡萄糖對照儲備液。分別精密稱取16種氨基酸對照品及氨基葡萄糖對照品各10 mg置于100 mL容量瓶，用0.1 mol/L HCl稀釋至刻度，配制成濃度為100 μg/mL的氨基酸對照儲備液和氨基葡萄糖對照儲備液。

氨基酸和氨基葡萄糖對照溶液。分別精密移取氨基酸對照儲備液和氨基葡萄糖對照儲備液各500 μL置于10 mL容量瓶，用0.1 mol/L HCl稀釋至刻度，配制成1 μg/mL的氨基酸對照溶液和氨基葡萄糖對照溶液。

水解樣品前處理。精密稱取殼寡糖0.25 g于水解管中，按照國際官定分析檢測協(xié)會(AOAC)方法，用10 mL的6 mol/L HCl溶液混合殼寡糖，真空下封口，在110 ℃ 下水解24 h，冷卻后開口，取水解液2 mL，進行減壓干燥，將殼寡糖水解殘渣置于10 mL容量瓶，用乙醇稀釋至刻度，作為水解殼寡糖樣品溶液。

色譜條件。采用Lichrospher C(4.6 mm×150 mm，5 μm)柱，流動相A為0.5 mmol/L 的TDFHA水溶液(pH=2.4)；流動相B為 0.5 mmol/L的 TDFHA乙腈溶液，梯度洗脫程序見表1。

表1 離子對色譜法的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure for ion pair chromatography

質(zhì)譜條件。離子化方式為氣動輔助電噴霧離子化(ESI)；離子檢測方式為正離子，反應(yīng)離子檢測(MRM)；離子化電壓5 000 V；霧化室壓力137.9 kPa；干燥氣溫度300 ℃；CID電壓5 V，柱后添加0.5%甲酸的甲醇溶液，MRM方式檢測。

離子對色譜法測定殼寡糖中總氨基酸的含量。分別取氨基酸對照溶液、氨基葡萄糖對照溶液和水解殼寡糖樣品各5 μL，注入LC-MS/MS儀，記錄圖譜，測定各氨基酸峰面積，計算總氨基酸含量。

2 結(jié)果與分析

配制10 μg/mL 16種氨基酸對照溶液為樣品，流動注射，以15 eV為初始碰撞電壓，通過逐個比較子母離子對，得到優(yōu)化后的質(zhì)譜條件，見表2。同時柱后添加0.5%甲酸的甲醇溶液，以輔助離子對的解離，提高氨基酸和氨基葡萄糖的質(zhì)譜響應(yīng)。

首先考察了不添加離子對試劑時，流動相pH對各氨基酸和氨基葡萄糖保留行為的影響。采用pH耐受范圍較大的Benetnach C(2.1 mm×150 mm，5 μm)柱，取氨基酸對照溶液和氨基葡萄糖對照溶液各2 μL，注入LC-MS/MS儀，分別用甲酸和氨水調(diào)節(jié)水相(10 mmol/L醋酸銨緩沖液)pH至2.5～10.0，并以水相(A)-乙腈(B)95∶5的流動相進行等度洗脫，記錄圖譜，測定各氨基酸保留時間，見表3。

表2 優(yōu)化后氨基酸和氨基葡萄糖的質(zhì)譜條件Table 2 Optimized mass spectrometry conditions of amino acids and glucosamine

從表3可以看出，除了芳香族氨基酸及個別分子量較大的氨基酸外，其余氨基酸均在死時間出峰，在C柱上保留極弱。這主要因為氨基酸在各pH溶液中均呈現(xiàn)離子狀態(tài)，這也是直接測定氨基酸時普遍存在的問題。

離子對試劑可增強氨基酸在C柱上的保留，且相比于柱前衍生法，它可以避免衍生反應(yīng)的副產(chǎn)物、試劑本身干擾等問題，如Waterval等使用含有0.5 mmol/L的TDFHA水溶液和乙腈作為流動相，建立了一種應(yīng)用于定量分析血漿和尿液中氨基酸的電噴霧電離超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)。該法可以快速、準(zhǔn)確地同時測定多種氨基酸，因此，考察了不同全氟取代羧酸離子對試劑對氨基酸和氨基葡萄糖保留行為的影響。

隨著離子對試劑碳鏈長度的增加，其保留量也逐漸增大，但短碳鏈離子對試劑TFA即使在高濃度下也無法有效提升極性氨基酸的選擇性。在氨基酸分析中使用最多的離子對試劑是中等碳鏈的HFBA和長碳鏈的TDFHA。該研究比較了HFBA和TDFHA作為離子對試劑對氨基酸和氨基葡萄糖保留行為的影響。

七氟丁酸(HFBA)。將pH為2.4～6.5的8 mmol/L HFBA溶液作為流動相A，乙腈作為流動相B，按表1進行梯度洗脫，以氨基酸對照溶液、氨基葡萄糖對照溶液進行LC-MS分析，記錄保留時間，比較各氨基酸和氨基葡萄糖保留情況，結(jié)果見表4。

表3 不同pH條件下氨基酸和氨基葡萄糖的保留時間Table 3 Retention time of amino acids and glucosamine at different pH min

表4 不同pH對HFBA為離子對試劑時保留時間的影響 Table 4 Effect of different pH on retention time when HFBA is an ion pair reagent min

從表4可以看出，除Gly和Met外，各氨基酸的保留時間隨pH降低而延長，在pH為2.4時保留時間最長，而氨基葡萄糖則對pH變化并不敏感。同時pH對His、Arg等堿性氨基酸及Asp、Glu等酸性氨基酸的保留時間影響較小，而對Phe、Leu、Ile、Thr等不帶電荷的氨基酸保留時間影響較大，在pH 2.4條件下保留時間顯著延長。

在流動相pH為2.4的條件下，進一步優(yōu)化HFBA濃度。設(shè)計HFBA濃度為5、8、15和20 mmol/L分別測定16種氨基酸和氨基葡萄糖的保留時間，結(jié)果見表5。由表5可見，隨HFBA濃度增加，各氨基酸保留時間略有延長，但濃度為8、15、20 mmol/L時，各氨基酸的保留時間無顯著差異。這與Chaimbault等的研究結(jié)果一致。氨基葡萄糖的保留時間較為穩(wěn)定，未隨著HFBA濃度的增加而變化。由于氨基葡萄糖保留時間與Ser、Pro、His等氨基酸保留時間接近，因此HFBA作為離子對試劑無法分離氨基酸與氨基葡萄糖，氨基葡萄糖可能干擾這些氨基酸的測定。

表5 HFBA濃度對保留時間的影響Table 5 Effect of HFBA concentration on retention time min

全氟庚酸(TDFHA)。比較了TDFHA濃度為0.5 mmol/L、pH 2.4～6.5時各氨基酸和氨基葡萄糖的保留時間，結(jié)果見表6。由表6可見，除Ile外，其他氨基酸在pH 2.4保留時間顯著延長，特別是Thr、Phe、Tyr等不帶電荷的氨基酸保留時間均有明顯延長。而氨基葡萄糖在pH 2.4的保留時間則略有縮短，可能由于低pH條件影響了氨基葡萄糖和TDFHA離子對的形成，也可能因為它與氨基酸兼性離子存在形式不同，與TDFHA形成離子對后呈中性，沒有可電離的羧基，因此保留規(guī)律與氨基酸不同。

表6 不同pH對TDFHA為離子對試劑時保留時間的影響Table 6 Effect of different pH on retention time when TDFHA is an ion pair reagent min

在流動相pH為2.4時，比較流動相中含有TDFHA濃度分別為0.5、1.0、1.5 mmol/L時各氨基酸和氨基葡萄糖的保留時間，結(jié)果見表7。采用TDFHA作為離子對試劑，在0.5 mmol/L時顯著延長各氨基酸和氨基葡萄糖的保留時間，且保留時間較HFBA有較大幅度延長。由表7可見，進一步增加TDFHA濃度，各氨基酸和氨基葡萄糖的保留時間均有一定延長，以Ser、Val、Ile、Leu、Tyr等不帶電荷的氨基酸較為明顯，而酸性、堿性氨基酸的保留時間變化不大，同時氨基葡萄糖保留時間的增加幅度較小。

由于pH 2.4、0.5 mmol/L TDFHA條件下氨基葡萄糖和各氨基酸的保留時間差異大、分離好，不影響各氨基酸測定，因此選擇該條件作為流動相，用于含氨基葡萄糖樣品中氨基酸的分析。

HFBA和TDFHA水溶液的pH為2.4，在C柱的pH耐受范圍內(nèi)。比較了Symmetry C(3.9 mm×150 mm，5 μm)柱和Lichrospher C(4.6 mm×150 mm，5 μm)柱，以A相∶B相60∶40為流動相，取5 μg/mL氨基葡萄糖對照溶液5 μL，注入LC-MS/MS儀，記錄圖譜。依次從柱子的理論塔板數(shù)、分離度和拖尾因子3個方面衡量柱效，見表8，Lichrospher C柱的理論塔板數(shù)及分離度均好于Symmetry C柱，且其拖尾因子也小于Symmetry C柱，因此選擇Lichrospher C柱作為該試驗的色譜柱。

表7 TDFHA濃度對保留時間的影響Table 7 Effect of TDFHA concentration on retention time min

表8 不同色譜柱比較Table 8 Comparison of different columns

由于殼寡糖工藝中可能引入蛋白質(zhì)、多肽，通常采用酸水解方式將蛋白質(zhì)多肽水解成氨基酸后測定。但水解中Cys、Trp等氨基酸會損失，所以未對它們進行考察。同時，酸水解可將殼寡糖水解成氨基葡萄糖，也避免了殼寡糖對氨基酸分析的干擾。該研究中僅針對了色譜條件進行了優(yōu)化，未針對殼寡糖樣品中氨基酸分析進行完整的方法驗證，但通過對殼寡糖中16種氨基酸的測定(表9)，已初步證實該色譜方法具有良好的可行性。

表9 殼寡糖中氨基酸含量(n=2)Table 9 Content of amino acids in chitosan oligosaccharide

3 結(jié)論

該研究比較了pH、離子對試劑種類、濃度等對氨基酸和氨基葡萄糖保留行為規(guī)律，發(fā)現(xiàn)HFBA和TDFHA均可增加氨基酸和氨基葡萄糖保留，且TDFHA對保留的改善更為明顯。低pH時保留增加最為明顯，且濃度的增加對保留影響較小。在此基礎(chǔ)上優(yōu)化了色譜條件，實現(xiàn)了氨基酸和氨基葡萄糖的分離，并將該色譜條件用于殼寡糖中氨基酸的測定，測得殼寡糖總氨基酸含量為1.03%，各氨基酸含量在<0.01%～0.84%。該研究為離子對色譜技術(shù)用于氨基酸分析，特別是含氨基葡萄糖等化合物樣本中氨基酸的快速分離分析提供基礎(chǔ)和方法。