低能N+注入誘導(dǎo)大腸桿菌對喹諾酮耐藥的研究

王 婷， 張 敏， 李天宇， 錢衛(wèi)東， 唐 朝， 蔡長龍*

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 陜西 西安 710021； 2.西安工業(yè)大學(xué) 光電工程學(xué)院, 陜西 西安 710021)

0 引言

大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)是人和動物腸道內(nèi)共生菌，也是導(dǎo)致腹瀉、腹膜炎和敗血癥等臨床病狀最常見的條件致病菌[1].

喹諾酮類藥物(4-quinolones)是一類人工合成的廣譜抗菌的抗生素，是臨床治療大腸桿菌感染的主要抗生素之一[2].近年來由于抗生素的濫用，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥性出現(xiàn).張小江等[3]、方潔等[4]、黎文君[5]、Wang Y等[6]發(fā)現(xiàn)臨床分離的大腸桿菌對喹諾酮類的耐藥比率大約在50%～58%以上，并呈現(xiàn)多藥耐藥(Multidrug resistance)和逐年上升的趨勢，給人體健康和畜禽養(yǎng)殖帶來極大的威脅和挑戰(zhàn).

毛培宏等[7,8]研究發(fā)現(xiàn)低能離子注入介導(dǎo)獲得的離子束重組沙漠寡營養(yǎng)細(xì)菌DOB073基因組中有21個新基因與磷霉素、青霉素及萬古霉素等抗生素的耐藥性相關(guān).提示低能離子輻照可誘導(dǎo)微生物體內(nèi)染色體畸變、DNA多態(tài)性變化[9,10]，從而改變細(xì)菌的耐藥特性，但其具體劑量效應(yīng)目前研究較少，其分子機(jī)制尚未闡明.

本研究通過不同劑量的低能N+注入誘變大腸桿菌ATCC25922獲取變異菌株庫，以抗性平板選擇對喹諾酮類耐藥的菌株，采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)和微量肉湯稀釋法測定誘變菌株耐藥譜和最小抑菌濃度(MIC)，并通過PCR和Sanger測序分析誘變菌株16SrRNA的序列差異，從而研究低能N+輻射對大腸桿菌抗喹諾酮類抗生素耐藥性的影響，為探索大腸桿菌的耐藥性形成機(jī)制研究提供參考.

1 材料和方法

1.1 菌株和試劑

大腸桿菌ATCC-25922， 購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心.

頭孢西丁(FOX30)等抗生素藥敏片，諾氟沙星(NOR)，MH培養(yǎng)基購自中國賽默飛世爾科技有限公司；細(xì)菌gDNA提取試劑盒、2×Taq Master Mix、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司.

1.2 儀器和設(shè)備

生物改性離子注入裝置，西安工業(yè)大學(xué)離子束生物工程及生物多樣研究中心；梯度PCR儀和電泳儀，美國Bio-rad；Alpha Ease FC凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Alpha Innotech.

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株復(fù)蘇及菌膜制備

將大腸桿菌ATCC25922株按照說明書稀釋并接種LB培養(yǎng)基，37 ℃，160 r/min活化培養(yǎng)24 h，再分離單菌落，以單菌落接種斜面繼續(xù)活化傳代2次，即得斜面種子.取1環(huán)斜面種子接種LB培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，6 000 r/min離心5 min，洗滌3次，用無菌水將菌懸液稀釋至1×108CFU/mL，然后取100μL菌懸液均勻涂布于無菌培養(yǎng)平皿中，無菌風(fēng)吹干成菌膜.

1.3.2 低能N+注入誘變劑量與大腸桿菌存活率

將菌膜置于生物改性離子注入裝置靶室中，設(shè)置真空度為10-3Pa，N+注入能量15 keV，注入劑量分別為0×1014ions/cm2、25×1014ions/cm2、50×1014ions/cm2、75×1014ions/cm2、100×1014ions/cm2、125×1014ions/cm2，并設(shè)置平行的真空對照.N+注入后，每板加1 mL LB培養(yǎng)基進(jìn)行沖洗，重懸，隨后以100μL/板將所有誘變菌液均勻涂布于LB平板上，37 ℃培養(yǎng)24～72 h，記錄平板菌落數(shù)，按公式(1)計算存活率，確定實驗誘變劑量.

(1)

1.3.3 大腸桿菌耐藥譜的K-B 法鑒定

根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)《抗微生物藥物敏感性實驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》[11]進(jìn)行大腸桿菌耐藥譜的檢測和判定.將大腸桿菌接種MHB，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)到對數(shù)期，然后將菌液稀釋至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度，均勻涂布于MHA平板，將藥敏紙片緊貼于培養(yǎng)基表面，于37 ℃倒置培養(yǎng)16～18 h，測定其抑菌圈直徑，判讀結(jié)果.

1.3.4 抗生素對大腸桿菌的MIC檢測

采用微量肉湯稀釋法確定諾氟沙星(NOR)對大腸桿的MIC.分別向96孔深孔板中加入400μL 0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度的大腸桿菌懸液，并加入倍比稀釋的NOR，使藥物終濃度分別達(dá)到800μg/mL、400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL和1.56μg/mL，并分別設(shè)置陰性對照(不含藥物)和空白對照(不含菌)，于37 ℃，200 r/min培養(yǎng)16～20 h，用酶標(biāo)儀測定OD600值，分析藥物對大腸桿菌的MIC.

1.3.5 耐喹諾酮類大腸桿菌突變菌株的篩選

根據(jù)1.3.2確定的注入劑量對大腸桿菌ATCC2592進(jìn)行低能N+注入，隨后分別涂布于LB平板和含20 ug/mLNOR的抗性平板(LB-NOR+)，37 ℃培養(yǎng)24～72 h，記錄平板菌落數(shù)，并對初篩的耐藥株在LB-NOR+平板傳代3次，以獲得遺傳穩(wěn)定的耐NOR大腸桿菌突變株.

1.3.6 大腸桿菌16S rRNA的擴(kuò)增、測序和分析

選擇上游引物8F 5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′，下游引物1942R 5′-TAG GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′作為大腸桿菌16sRNA的基因引物.按照 DNA 提取試劑盒提取大腸桿菌DNA做模板，并按照PCR 擴(kuò)增試劑盒操作指南進(jìn)行PCR擴(kuò)增.具體反應(yīng)體系為： PCR Master Mix (2×) 10 μL，引物各 0.5 μL ，模板1 μL 的，補(bǔ)ddH2O至20 μL ；PCR 的反應(yīng)程序：95 ℃5 mim→94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃1 min，重復(fù) 40個循環(huán)→72 ℃10 min.利用瓊脂糖凝膠電泳分析大腸桿菌中16S rRNA 基因擴(kuò)增情況，擴(kuò)增正確的送上海生工有限公司進(jìn)行測序，用NCBI-blast對測序結(jié)果進(jìn)行對比分析.

1.3.7 大腸桿菌acc(6′)-Ib-cr基因的擴(kuò)增和分析

氨基糖苷類乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(acc(6′)-Ib-cr)，分別以5′-TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTA-3′為上游引物，5′-CTCGAATGCCTGGCGTGTTT-3為下游引物，按照1.3.6方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增(退火溫度為53 ℃)分析.

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每組實驗設(shè)3組平行，結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，用SPSS 20.0軟件和 Origin2018進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和圖片繪制.

2 結(jié)果與討論

2.1 低能N+注入劑量對大腸桿菌存活率的影響

由圖1可知，當(dāng)真空度為10-3Pa，N+離子源注入能量為15 keV，大腸桿菌的存活率隨著注入的劑量增加，呈現(xiàn)下降-上升-下降的馬鞍形曲線,在注入劑量為100×1014ions/cm2時，細(xì)菌的存活率達(dá)到二次高峰，為15.99%.

圖1 低能N+注入劑量對大腸桿菌存活率的影響

因為加速后低能N+具有一定的靜止質(zhì)量，注入后可使質(zhì)量、動量、能量和電荷共同作用于細(xì)菌，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量自由基,從而造成胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解，雙鏈DNA的解鏈和堿基的損傷.隨著注入劑量不斷增加，N+離子束損傷作用越來越強(qiáng),導(dǎo)致細(xì)菌存活率下降；但隨著注入劑量繼續(xù)增加，細(xì)菌的修復(fù)機(jī)制被激活，使得存活率略有回升；在該劑量下,低能N+離子束會產(chǎn)生的大量次級粒子,從而引起細(xì)菌DNA雙鏈斷裂，進(jìn)而發(fā)生遺傳變異，出現(xiàn)新的表征.因此,根據(jù)低能離子束輻射生物效應(yīng)的“反常照射損傷”原理[12,13]，確定100×1014ions/cm2為最適誘變劑量.

2.2 大腸桿菌的耐藥譜及對諾氟沙星的MIC

應(yīng)用K-B法對大腸桿菌ATCC-25922的耐藥特征進(jìn)行檢測.結(jié)果如表1所示，出發(fā)菌株ATCC-25922菌株對β內(nèi)酰胺類抗生素，如阿莫西林/克拉維酸(AMC3)、頭孢西丁(FOX30)和頭孢曲松(CRO30)，氟喹諾酮類抗生素，如諾氟沙星(NOR10)、環(huán)丙沙星(CIP5)、左氧氟沙星(LEV5)和莫西沙星(MXF5)，以及替考拉寧(TEC30)、阿奇霉素(AZM15)、慶大霉素(CN30)等抗生素都比較敏感，無耐藥現(xiàn)象.采用微量肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法確定大腸桿菌ATCC25922對喹諾酮類抗生素NOR敏感，其MIC為1.56 μg/mL.

表1 低能N+注入對大腸桿菌耐藥譜的影響

隨著抗生素使用頻率和劑量不斷增加，細(xì)菌耐藥性不斷增加.ATCC25922是CLSI推薦的大腸桿菌參考菌株，本研究檢測結(jié)果ATCC25922對多數(shù)抗生素敏感，與CLSI[11]的參考范圍一致，并且其遺傳背景清晰，適于作為誘導(dǎo)篩選耐藥菌株的出發(fā)菌株.

2.3 低能N+注入誘變大腸桿菌獲得諾氟沙星抗性

設(shè)置離子源注入能量為15 keV，注入劑量為100×1014ions/cm2對大腸桿菌ATCC25922進(jìn)行低能N+注入，隨后分別涂布于LB和LB-NOR+平板，37 ℃培養(yǎng)48 h后，LB平板共計長出4 797個菌落(如圖2(a)所示)，LB-NOR+平板共計長出12個菌落(如圖2(b)所示)，且傳代3次后有5個仍然能在LB-NOR+平板生長，說明低能N+注入誘變大腸桿菌獲得了NOR抗性，陽性突變率為1.04‰，并將其依次命名為25922-NOR1、25922-NOR2、25922-NOR3、25922-NOR4和25922-NOR5.

圖2 耐諾氟沙星大腸桿菌的篩選

低能N+離子束引起細(xì)菌發(fā)生遺傳變異，耐藥表征經(jīng)常出現(xiàn)代次間不穩(wěn)定現(xiàn)象，可能隨著菌體傳代發(fā)生耐藥基因突變的修復(fù)、丟失，或者旁路途徑的代償，從而失去耐藥表征[12,13].因此本研究通過反復(fù)的抗生素平板篩選和傳代的方法，篩選獲得遺傳和表征穩(wěn)定的ATCC25922抗諾氟沙星耐藥突變株，為進(jìn)一步分析耐藥菌株表型和基因變化提供可靠的研究材料.

2.4 低能N+注入對大腸桿菌耐藥性的影響

大腸桿菌NOR抗性菌株25922-NOR1～25922-NOR5，對氟喹諾酮類抗生素NOR10、CIP5和LEV5抑菌圈直徑減小，耐藥性增強(qiáng)(如圖3所示).特別是菌株29522-NOR1和2獲得了對NOR10、CIP5、LEV5、MXF5四種喹諾酮類抗生素的交叉耐藥性，并且對FOX30、CRO30的耐藥性增強(qiáng)，產(chǎn)生多藥耐藥趨勢(如表1所示).進(jìn)一步，耐藥株25922-NOR1、2、3和5的對NOR生物MIC分別增加為100μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、50μg/mL(如圖4所示)，耐藥指數(shù)(RI)分別為16～32倍，說明低能N+注入使參考株ATCC25922獲得了耐NOR的特征.

圖3 低能N+注入對大腸桿菌抑菌圈的影響

圖4 大腸桿菌耐藥株對NOR的MIC

目前，臨床上廣泛使用第三代喹諾酮類藥物主要包括諾氟沙星、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星.近幾年，第四代喹諾酮類藥物莫西沙星上市，該類藥物活性更高，抗菌譜更廣，能通過多位點(diǎn)抑制Ⅱ、Ⅳ拓?fù)洚悩?gòu)酶，誘導(dǎo)耐藥難度大，臨床耐藥現(xiàn)象比較罕見[14,15].本研究僅2株誘導(dǎo)菌株對莫西沙星產(chǎn)生耐藥，與臨床耐藥現(xiàn)象一致.

2.5 低能N+注入對大腸桿菌16S rRNA的影響

對大腸桿菌分別進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增，擴(kuò)增片段送上海生工生物技術(shù)有限公司測序，用NCBI的Blast分析發(fā)現(xiàn)，耐藥株29522-NOR1～5的16S rRNA與參考株ATCC25922同源性分別為96.5%、96.5%、97.5%、99.2%和97.5%，其中菌株29522-NOR4與出發(fā)菌株ATCC25922，三重耐藥的菌株29522-NOR3和29522-NOR5同源性達(dá)到99.2%，四重耐藥的菌株29522-NOR1和29522-NOR2同源性達(dá)到99.6%(如圖5(a)所示)，基因的V4區(qū)(約600-900)點(diǎn)突變發(fā)生較多(如圖5(b)所示).

圖5 大腸桿菌16S rRNA基因同源性分析

16S rRNA是目前公認(rèn)的原核微生物系統(tǒng)發(fā)育和分子進(jìn)化的分子計時器，其突變與進(jìn)化可能是耐藥相關(guān)基因的起源[16].包姍姍等[17]對低能離子注入介導(dǎo)獲得的31株離子束重組沙漠寡營養(yǎng)菌株測序，結(jié)果其16S rRNA 基因均發(fā)生了不同程度的突變，其中3株的16s rRNA基因的拷貝數(shù)增加了5個拷貝，其新基因數(shù)目增加了34～37個，有21個新基因與抗生素抗性相關(guān).

本研究測序結(jié)果表明，低能離子注入能誘導(dǎo)大腸桿菌16sr RNA基因突變和對NOR耐藥表征改變，且16sr RNA基因突變率與耐藥指數(shù)呈正相關(guān)(r=0.342，p≤0.05)，說明低能離子注入可能通過誘導(dǎo)大腸桿菌16sRNA基因突變從而獲得對喹諾酮類抗生素的耐藥表征.

2.6 低能N+注入對大腸桿菌acc(6′)-Ib-cr基因影響

通過對大腸桿菌分別進(jìn)行acc(6′)-Ib-cr基因擴(kuò)增，凝膠電泳鑒定，僅四重耐藥株29522-NOR1和29522-NOR2擴(kuò)增得到大約481 bp擴(kuò)增片段(如圖6所示)，其余菌株均未擴(kuò)增出.

圖6 大腸桿菌acc(6′)-Ib-cr基因擴(kuò)增結(jié)果

大腸桿菌產(chǎn)生喹諾酮耐藥主要由QRDR類基因(gyrA和parC)基因突變和質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因(qnrS、acc(6′)-Ib-cr)造成，其中acc(6′)-Ib-cr可使大腸桿菌等革蘭氏陰性菌獲得對氨基糖苷類和喹諾酮類的耐藥性[18].王麗娟等[19]、Piekarska K等[20]研究發(fā)現(xiàn)分離的75株大腸桿菌中有16株acc(6′)-Ib-cr基因陽性(21.33%)并且具有氟喹諾酮類藥物耐藥性，說明acc(6′)-Ib-cr基因與大腸桿菌的氟喹諾酮耐受性相關(guān)，并可能通過質(zhì)粒水平傳播，提高敏感菌株的耐藥風(fēng)險.

3 結(jié)論

(1)通過低能N+注入誘變大腸桿菌 確定了低能N+注入誘變大腸桿菌ATCC25922的最佳誘變劑量為100×1014ions/cm2.

(2)通過低能N+注入，建立了4 797株誘變菌株庫，結(jié)合抗生素平板篩選獲得了5株耐諾氟沙星的大腸桿菌菌株，其耐藥指數(shù)為16～32倍.

(3)耐諾氟沙星的誘變菌株16S rRNA的突變率0.8%～3.6%，其中四重耐藥菌株29522-NOR1和29522-NOR2的突變率較高，且檢出了耐藥基因acc(6′)-Ib-cr1.

研究結(jié)果說明低能N+注入可以引發(fā)大腸桿菌16S rRNA基因的突變和進(jìn)化，從而引發(fā)其耐藥基因的發(fā)生和起源.研究為探索低能離子注入介導(dǎo)大腸桿菌的耐藥發(fā)生機(jī)制提供參考.