注干施藥后黃山松體內(nèi)甲維鹽含量檢測及殘留動態(tài)分析

孫薇，張立華，王勇軍，陳安良

（1.浙江省臨海市林業(yè)技術(shù)推廣和場圃旅游服務(wù)總站，浙江 臨海 317000；2.浙江省泰順縣自然資源和規(guī)劃局，浙江 泰順 325500；3.浙江農(nóng)林大學(xué) 生物農(nóng)藥高效制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，浙江 杭州 311300）

松材線蟲病是由松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus引起的松屬植物Pinussp.的一種毀滅性病害，導(dǎo)致大量松樹枯死，在我國已經(jīng)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)損失，是目前最為嚴(yán)重的森林病蟲害之一[1]。松材線蟲自然傳播依靠松墨天牛Monochamus alternatus攜帶傳播，其生活史主要在松樹和松墨天牛體內(nèi)完成，松墨天牛的幼蟲主要在松樹體內(nèi)活動[2]。傳統(tǒng)的噴粉、噴霧等藥劑防治方法，無法使藥劑直接接觸到靶標(biāo)生物，導(dǎo)致防治效果低下、藥劑漂移等問題[3]。注干施藥技術(shù)是將藥劑有效成分注入樹體，依靠樹木蒸騰作用使藥劑在樹體內(nèi)擴(kuò)散分布而發(fā)揮藥效，具有施藥精準(zhǔn)、防治效率高、環(huán)境污染小等優(yōu)點[4-5]。目前，注干施藥技術(shù)已在我國重要生態(tài)區(qū)和古樹名木的松材線蟲病防治中得到了較好的應(yīng)用，是一種重要的主動預(yù)防措施[3]。

甲維鹽，全稱甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽，是以阿維菌素B1 為原基團(tuán)合成的生物源殺蟲劑。與阿維菌素相比，甲維鹽因其較高的水溶性而表現(xiàn)出更為高效的殺蟲活性和傳導(dǎo)性能[6]。Takai 等發(fā)現(xiàn)甲維鹽對松材線蟲具有顯著的殺線蟲活性，并開發(fā)出針對松材線蟲病的甲維鹽水溶性注干劑，取得了顯著的防治效果[7-9]。本課題組前期采用2.3%甲維鹽微乳劑進(jìn)行注干施藥防治松材線蟲病，效果顯著[10-12]。

甲維鹽在松樹體內(nèi)的含量和殘留，是其發(fā)揮功能的重要前提。當(dāng)前，甲維鹽在松樹體內(nèi)的分布規(guī)律，尚未有系統(tǒng)研究。本研究測定了甲維鹽注干施藥后在黃山松Pinus taiwanensis體內(nèi)的殘留動態(tài)，分析了注干施藥后藥劑的分布規(guī)律，旨在為注干施藥防治技術(shù)的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與藥劑

Waters 600 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；IKA RV10 基本型立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司）；超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；搖擺式萬能高速粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；RD1000 樹木主干測量儀（美國激光技術(shù)公司）。

95.6 %甲維鹽（emamectin benzoate）標(biāo)準(zhǔn)品（佳木斯興宇生物技術(shù)有限公司）；注干施藥用甲維鹽藥劑選用2.3%（W/V）甲維鹽微乳劑（浙江錢江生化股份有限公司）。甲醇、乙腈等試劑為色譜純，其他試劑均為分析純，均購自中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 松樹二元材積測算方法

采用華偉平等建立的黃山松立木二元材積模型[13]，以距地面1.3 m 處的胸徑（cm）及株高（m）為參數(shù)，計算黃山松材積量（m3）。樹木胸圍采用測樹鋼圍尺量測，樹木株高采用樹木主干測量儀或皮尺量測。

1.3 林間注干施藥試驗

1.3.1 試驗地點 研究地點設(shè)置在浙江括蒼山國家森林公園（以下簡稱括蒼山）黃山松林（地理坐標(biāo)為120°56'14''E，28°48'41" N；海拔為900 m），該地自2017 年發(fā)生松材線蟲病，為疫區(qū)。2019 年，該地松材線蟲病發(fā)生面積100 余hm2，枯死松樹1 000 余株。試驗區(qū)黃山松生長均一，平均胸徑為16.7 cm，密度約為335 株·hm-2，平均株高為7.6 m，平均材積為0.16 m3。

1.3.2 注干施藥試驗 在括蒼山黃山松林區(qū)分別選取2 塊林地作為注干施藥試驗樣地和不施藥空白對照區(qū)，面積均為0.72 hm2。在注干施藥區(qū)，按照每株50 mL 進(jìn)行注干施藥。按照黃山松材積測算，有效成分甲維鹽的平均施藥量為7.19 g·m-3。在距地面30 cm 高處松樹主干基部斜向下45°方向，使用電動打孔機(jī)打直徑4～ 7 mm、深5～ 8 cm 的小孔，將藥品開口注入孔內(nèi)。于2020 年1 月31 日進(jìn)行注干施藥，共注干施藥251 株，空白對照區(qū)共240 株。

1.3.3 防治效果計算 分別于2020 年10 月和2021 年10 月調(diào)查試驗林地和對照林地當(dāng)年松樹死亡數(shù)量（死亡松樹每年定期全部清理），計算注干施藥處理的預(yù)防效果。伐倒試驗樣地中的死亡松樹，鋸取松樹靠上部的莖干，粉碎后采用貝爾曼漏斗法收集松樹體內(nèi)的線蟲，根據(jù)松材線蟲雌蟲尾部鈍圓的典型結(jié)構(gòu)判斷是否為松材線蟲，從而判斷試驗區(qū)松樹死亡原因。預(yù)防效果計算公式為：

式中，Dc為對照林地的松樹死亡率，Da為注干施藥防治林區(qū)的松樹死亡率。

1.4 甲維鹽在松樹體內(nèi)的含量測定

1.4.1 松樹樣品采集 結(jié)合伐區(qū)作業(yè)，收集試驗樣本材料。將注干后健康松樹伐倒后，松樹主干每隔1 m 用電鋸鋸取0.2 m 厚的松木圓盤備用。松樹側(cè)枝沿主干自下往上編號取樣，記錄側(cè)枝外圍直徑（cm），每個側(cè)枝每隔0.5 m 用電鋸鋸取0.2 m 厚的松木圓盤備用。松樹松針按照側(cè)枝編號進(jìn)行取樣并編號。主干頂梢的松針作為主干松針。在試驗區(qū)，注干施藥處理組隨機(jī)取黃山松3 株，空白對照處理取1 株。

1.4.2 樣品提取處理 將待測的松樹主干、側(cè)枝及松針進(jìn)行自然晾干，晾干后粉碎至100 目。準(zhǔn)確稱取10.0 g樣品置于三角瓶中，加入50 mL 95%甲醇（V/V）作為提取液，超聲振蕩提取1 h，抽濾，用30 mL 甲醇淋洗殘渣，重復(fù)3 次。合并濾液及甲醇淋洗相，減壓濃縮至干，用甲醇溶解并定容至2 mL，得提取液，待凈化。

1.4.3 樣品純化 采用ODS 凈化小柱進(jìn)行純化。選用5 mL 無菌注射器（不帶針頭），在底部放置脫脂棉，真空抽氣，依次加入1 mL 無水硫酸鎂和3 mL ODS 填料。先用5 mL 甲醇/水（95∶5，V/V）活化平衡凈化小柱，再將提取液轉(zhuǎn)入柱中上樣，加入甲醇至5 mL，開始淋洗，待液面降至3 mL 時立即開始收集淋洗液至10 mL 容量瓶中，用甲醇/水（95∶5，V/V）分次淋洗，每次約1 mL，收集洗脫液至10 mL，得凈化液。

1.4.4 HPLC 檢測條件 采用Waters XBridge C18 色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；檢測波長為244 nm；流動相為V（乙腈）∶V（甲醇）∶V [水（含0.1%三乙胺）]=50∶42∶8；流速為1 mL·min-1；進(jìn)樣量為20 μL；柱溫為25℃。

1.4.5 甲維鹽HPLC 標(biāo)準(zhǔn)曲線 用甲醇配制1 000 mg·L-1的甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品母液，稀釋成0.5、1.0、5.0、10.0 和20.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以甲維鹽質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，高效液相色譜測定響應(yīng)值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.6 甲維鹽添加回收試驗 在黃山松側(cè)枝和針葉制備樣中，分別添加甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品，添加水平分別為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 和10.0 mg·kg-1，進(jìn)行添加回收試驗，計算甲維鹽的回收率。

1.5 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS v.19 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 林間注干施藥防治效果

注干施用甲維鹽后，試驗區(qū)松材線蟲病發(fā)生調(diào)查結(jié)果見表1。由表1 表明，甲維鹽注干施藥對黃山松林的松材線蟲病防治效果顯著。2020 年10 月，注干處理區(qū)黃山松無松樹死亡，預(yù)防效果達(dá)到100%。2021 年10 月，黃山松林試驗區(qū)，注干施藥處理預(yù)防效果保持100%。空白對照區(qū)發(fā)病嚴(yán)重，每年4 月前清理死樹，2020 年和2021 年，松樹死亡率分別達(dá)到5.42%和9.25%。所有死亡松樹體內(nèi)，都分離獲得了松材線蟲，判斷為松材線蟲病致死松樹。

表1 甲維鹽注干施藥對黃山松松材線蟲病的預(yù)防效果Table 1 Effect of trunk injection of emamectin benzoate onpine wilt disease on P.taiwanensis

2.2 甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線及添加回收率

甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。在0.1～ 20.0 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，甲維鹽質(zhì)量濃度與HPLC 峰面積呈良好的線性關(guān)系，得出回歸方程為y=12 546x– 1 051，相關(guān)系數(shù)R2為0.999。采用凈化小柱進(jìn)行純化后，添加回收試驗結(jié)果見表2。由表2 表明，在0.1～ 10.0 mg·kg-16 個添加水平下，甲維鹽在黃山松枝干的回收率在81.18%～ 86.41%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.33%～ 5.83%。甲維鹽在針葉中的回收率較高，為92.81%～ 94.07 %，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.39%～ 3.48%。根據(jù)添加回收試驗結(jié)果，甲維鹽的最低添加水平確定定量限（LOQ）設(shè)為0.1 mg·kg-1。

表2 黃山松枝干和針葉中甲維鹽添加回收率Table 2 Recovery of emamectin benzoate in truck,branch and needle of P.taiwanensis

圖1 甲維鹽檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of emamectin benzoate by HPLC

2.3 注干施藥后甲維鹽在黃山松體內(nèi)的分布動態(tài)

采用HPLC 方法，測定了注藥后不同時間甲維鹽在樹體內(nèi)的殘留量（表3），在注干施藥當(dāng)年，甲維鹽在松樹體內(nèi)維持著較高的殘留濃度，其中在主干上的殘留濃度較高，表現(xiàn)出在注射點附近濃度較高，隨著距注射點距離的增加總體呈下降趨勢。甲維鹽最高殘留濃度出現(xiàn)在距注入孔2 m處，殘留濃度為29.95 mg·kg-1，最低殘留濃度出現(xiàn)在距注入孔5 m 處，殘留濃度為8.43 mg·kg-1，主干針葉中的殘留濃度為8.46 mg·kg-1。甲維鹽在側(cè)枝上的分布從分支處到頂部表現(xiàn)出下降的趨勢，第1 側(cè)枝中殘留濃度從15.07 mg·kg-1下降到5.92 mg·kg-1，第1 側(cè)枝針葉中殘留濃度為3.53 mg·kg-1；第2 側(cè)枝中殘留濃度從11.20 mg·kg-1下降到3.02 mg·kg-1，第2 側(cè)枝針葉中殘留濃度為3.12 mg·kg-1?？瞻讓φ账蓸渲鞲?、枝和針葉組織內(nèi)均未檢測到甲維鹽。

表3 注干施藥后甲維鹽在黃山松的殘留濃度Table 3 Residue of emamectin benzoate in P.taiwanensis after trunk injection

2021 年10 月，即注干施藥翌年，松樹體內(nèi)仍有甲維鹽殘留，和2020 年相比，殘留濃度均有降低。甲維鹽濃度隨著分布點到注射點距離的增加逐漸下降，主干中的平均殘留濃度為2.95～ 5.38 mg·kg-1，主干針葉中的平均殘留濃度為1.12 mg·kg-1；第1 側(cè)枝中的平均殘留濃度為1.36～ 2.41 mg·kg-1，第1 側(cè)枝針葉中的平均殘留濃度為0.53 mg·kg-1；第2 側(cè)枝中的平均殘留濃度為1.02～ 2.20 mg·kg-1，第2 側(cè)枝針葉中的平均殘留濃度為0.46 mg·kg-1。

3 結(jié)論與討論

甲維鹽注干施藥技術(shù)在國內(nèi)外防治松材線蟲病中得到了成功的應(yīng)用[3,9-10]，但甲維鹽注干施藥后的殘留分布動態(tài)尚未有系統(tǒng)研究。黃山松為松材線蟲易感樹種[14]。本研究以浙江括蒼山的黃山松為研究對象，跟蹤測定了甲維鹽注干施藥后對松材線蟲病的防治效果及在松樹體內(nèi)的殘留動態(tài)分布。甲維鹽注干施藥后黃山松在2 年內(nèi)免受松材線蟲的侵染，具有顯著的防治效果，與在馬尾松P.massoniana上的試驗效果一致[10]。甲維鹽注干后，可在主干、側(cè)枝以及松針組織內(nèi)檢測得到較高濃度的甲維鹽殘留，并在2 a 內(nèi)維持殘留藥效。研究結(jié)果為甲維鹽注干施藥防治松材線蟲病提供了理論基礎(chǔ)。

甲維鹽殘留含量測定主要包括樣品前處理和含量測定兩個環(huán)節(jié)[15]。甲維鹽含量測定，通常采用液相色譜-熒光法[16]、柱前衍生-高效液相色譜法[17]以及反相HPLC-910UVD 法[18]等，檢測靈敏度均較高。樣品的前處理方式往往是影響農(nóng)藥殘留含量測定的主要因素[19]。目前，針對松木等硬質(zhì)植物樣品的提取及純化的方法較少。李長強(qiáng)等測定了松木烘干粉碎后，阿維菌素添加回收率為65%～ 75%，最低檢測質(zhì)量濃度為0.1 mg·kg-1[20]。本研究采用松木烘干粉碎后，用無水硫酸鎂和ODS 填料進(jìn)行凈化處理，甲維鹽在松木枝干中的回收率在81%～ 86%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，在針葉中的回收率在92%～ 94 %，最低添加水平的定量限（LOQ）為0.1 mg·kg-1。本研究采用的前處理方法顯著提高了甲維鹽的回收率，可用于甲維鹽在硬質(zhì)植物材料中的殘留測定。

注干施藥后甲維鹽殘留含量動態(tài)是分析藥劑發(fā)揮藥效及時效的重要依據(jù)[7]。本研究在浙江括蒼山黃山松林開展了注干施藥后甲維鹽殘留動態(tài)的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在注干施藥當(dāng)年，甲維鹽在松樹體內(nèi)維持著較高殘留濃度，其中在主干上的殘留濃度高于在側(cè)枝內(nèi)的殘留濃度，針葉內(nèi)含有一定濃度的甲維鹽。注干施藥后第二年，甲維鹽在主干、枝干以及針葉中依然維持高于松材線蟲致死中濃度[10]，進(jìn)一步解釋了在注干施藥第二年，試驗區(qū)松林的松材線蟲預(yù)防效果保持100%。本研究結(jié)果為松材線蟲病主動預(yù)防和松材線蟲病綜合防控提供了依據(jù)，也將為藥劑在森林環(huán)境中的衰退規(guī)律及對生態(tài)的影響提供基礎(chǔ)。下一步，將針對藥劑種類、松樹品種以及地理氣候條件等因素對藥劑的殘留分布動態(tài)及防控效果的影響開展研究。