木薯UGT41基因?qū)?xì)菌性枯萎病的抗性研究

曾 堅(jiān)，謝雅倩，李寶瑩，張海涵，胡 偉

(1 韶關(guān)學(xué)院 英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東省粵北食藥資源利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東韶關(guān) 512005；2 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101)

糖基化是植物體內(nèi)針對(duì)天然化合物的一類常見修飾反應(yīng)，修飾過程通過糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl transferases, GTs)來完成[1-2]。GTs通過在底物分子上添加糖基來形成更加穩(wěn)定的天然糖苷或糖酯。糖基供體主要是鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖等。到目前為止，所有植物中都發(fā)現(xiàn)了糖基轉(zhuǎn)移酶的存在，證明了糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程具有重要意義。在植物的進(jìn)化過程中形成了龐大復(fù)雜的GTs家族，目前已鑒定得到的家族有110個(gè)(http://www.cazy.org/)。UDP依賴型糖基轉(zhuǎn)移酶 (UDP-glycosyltransferases, UGTs) 基因家族是一大類使用UDP活化糖基作為糖供體的GTs。

在植物的生物發(fā)育過程中，UGTs基因家族能夠?qū)ι飰A、類黃酮和植物激素等物質(zhì)進(jìn)行修飾從而實(shí)現(xiàn)相關(guān)調(diào)控[3-4]。UGTs基因家族在植物激素調(diào)節(jié)過程中具有重要作用。糖基化修飾可以影響植株中生長(zhǎng)素的含量，例如過表達(dá)UGT84B1基因能夠提高轉(zhuǎn)基因植株中糖基化的生長(zhǎng)素含量[5]。過表達(dá)UGT73C5和UGT73C6基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因植株的油菜素類固醇途徑缺陷，表現(xiàn)出油菜素類固醇含量降低[6-7]。UGTs基因家族通過調(diào)控內(nèi)源性ABA含量來參與植物非生物脅迫響應(yīng)過程，例如UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT71B6及其2個(gè)高度同源的UGT71B7和UGT71B8基因，通過調(diào)節(jié)ABA的含量從而改變轉(zhuǎn)基因植株在逆境脅迫中的適應(yīng)能力[8]。UGT71C5基因可通過糖酯化ABA來增加ABA的穩(wěn)定性從而降低轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性[9]。UGTs基因家族在植物的生物脅迫響應(yīng)中也具有重要作用。在植物生物脅迫響應(yīng)過程中，病原體的入侵通常會(huì)啟動(dòng)水楊酸和茉莉酸介導(dǎo)的防御信號(hào)途徑，這兩條信號(hào)通路往往是以拮抗的方式來發(fā)揮作用[10-11]。研究表明，小分子進(jìn)行糖基化修飾后能夠參與防御信號(hào)在植物中的傳遞，如UGT76B1基因被證明是聯(lián)系水楊酸和茉莉酸途徑的中間環(huán)節(jié)。過表達(dá)UGT76B1基因會(huì)降低水楊酸依賴型植物的病菌防御能力，提高茉莉酸依賴型植物的病菌防御能力。突變UGT76B1基因則會(huì)增強(qiáng)對(duì)丁香假單胞菌的防御能力，降低對(duì)壞死性銅斑病鏈球菌的防御能力[12]。

木薯(ManihotesculentaCrantz)是世界三大薯類之一，也是熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物，其地下塊根富含淀粉，是全世界約7億人口的主糧[13-14]。木薯對(duì)光、熱、水有較高的利用率，對(duì)人工管理需求較少，具有明顯的抗旱性，同時(shí)具有較高的淀粉產(chǎn)量，其優(yōu)質(zhì)淀粉不僅可以為人類提供碳水化合物，也可以用來生產(chǎn)工業(yè)酒精和飼料[13]。在木薯的病害中，由地毯草黃單胞菌 (Xamthomonasaxonopodispv.Manihotis,Xam) 引起的木薯細(xì)菌性枯萎病一直是造成國(guó)內(nèi)外木薯生產(chǎn)中毀滅性損失的病害之一[15]。UGTs基因在非生物脅迫/生物脅迫中的功能已有部分研究[8, 12]，但其在木薯細(xì)菌性枯萎病中的生物學(xué)功能尚未揭示。因此，本研究通過克隆顯著受到Xam誘導(dǎo)表達(dá)的MeUGT41基因，構(gòu)建MeUGT41基因的VIGS載體并轉(zhuǎn)化至木薯葉片中，對(duì)基因干擾植株在細(xì)菌性枯萎病中的抗性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為研究MeUGT41基因在木薯抵抗細(xì)菌性枯萎病過程中的抗病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

木薯品種SC124 (Manihotesculentacv.SC124) 由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所保存并提供。RNA提取和反轉(zhuǎn)錄試劑分別購(gòu)自天根生化 (DP437) 和Fermentas (K1622)。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 載體構(gòu)建根據(jù)克隆得到的MeUGT41基因序列，設(shè)計(jì)引物構(gòu)建干擾載體pTRV2-MeUGT41 (表1)。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為222 bp，然后連接至T載體進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確后酶切連接至pTRV2載體構(gòu)建pTRV2-MeUGT41重組載體并轉(zhuǎn)化，隨后進(jìn)行菌液PCR和提取質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證，全部正確后保留相應(yīng)的菌液和重組質(zhì)粒備用。

表1 載體構(gòu)建引物和熒光定量引物

1.2.2 病毒誘導(dǎo)木薯MeUGT41基因沉默將單獨(dú)轉(zhuǎn)化pTRV2-MeUGT41和pTRV載體的2種農(nóng)桿菌分別注射到木薯葉片中，植株侵染后，置于溫室并保持濕潤(rùn)，侵染2周后收集相關(guān)植株的樣品提取RNA進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)目的基因MeUGT41在相關(guān)植株中的相對(duì)表達(dá)量，引物見表1。

1.2.3Xam侵染和MeUGT41基因表達(dá)分析將Xam母液進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，取1 mL 復(fù)蘇后菌液接種至新配置的LB液體培養(yǎng)基，震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6左右。使用MgCl2溶液稀釋菌液至OD600為0.4(MgCl2終濃度10 mmol/L)。將稀釋的菌液用注射器注射到木薯葉片，然后置于溫室中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中注意保濕[16]。提取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理葉片的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用設(shè)計(jì)好的MeUGT41基因的定量引物進(jìn)行熒光定量PCR，根據(jù)2-ΔΔCT方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4Xam細(xì)菌數(shù)目統(tǒng)計(jì)和葉片表型分析分別取侵染0 和6 d木薯葉片(打孔器)，樣品用無菌水漂洗3次，每次2 min，然后碾碎樣品。將碾碎的樣品進(jìn)行稀釋 (濃度梯度為103～108)，不同濃度的樣品分別接種至LB平板(每個(gè)樣品取10 μL)，每濃度梯度重復(fù)3次。LB平板密封后置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) (28 ℃, 16 h)，培養(yǎng)結(jié)束后統(tǒng)計(jì)細(xì)菌數(shù)量，每個(gè)處理至少收集10個(gè)葉圓盤進(jìn)行細(xì)菌數(shù)量統(tǒng)計(jì)。在0 和6 d時(shí)觀察表型變化并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 Xam 對(duì)MeUGT41基因表達(dá)的誘導(dǎo)

為分析MeUGT基因家族的功能，從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示MeUGT41基因受到Xam菌株的誘導(dǎo)[17]。進(jìn)一步用Xam菌株處理木薯葉片，表達(dá)數(shù)據(jù)分析顯示處理葉片中的MeUGT41基因確實(shí)受到Xam處理的誘導(dǎo)。如圖1所示，葉片中MeUGT41基因的表達(dá)量在Xam侵染后被顯著提高并不斷上升，在7 d時(shí)達(dá)到峰值；相比對(duì)照0 d，MeUGT41基因的表達(dá)量在5 和7 d時(shí)分別提高了2.7和3.1倍。這些結(jié)果表明Xam菌株會(huì)誘導(dǎo)MeUGT41基因的表達(dá)。

2.2 構(gòu)建pTRV2-MeUGT41干擾載體

根據(jù)MeUGT41基因序列選擇合適的片段構(gòu)建干擾載體，隨后設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為222 bp的片段，雙酶切位點(diǎn)分別為EcoR Ⅰ和KpnⅠ，將擴(kuò)增片段連接至T載體后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序正確后通過雙酶切將片段連接至載體pTRV2，得到pTRV2-MeUGT41重組干擾載體，通過菌液PCR和雙酶切對(duì)pTRV2-MeUGT41載體進(jìn)行驗(yàn)證(圖2)，結(jié)果表明，pTRV2-MeUGT41干擾載體構(gòu)建成功。

2.3 病毒誘導(dǎo)MeUGT41基因沉默

通過VIGS誘導(dǎo)沉默木薯葉片中MeUGT41基因的表達(dá)來分析MeUGT41基因在木薯中的功能。據(jù)熒光定量PCR結(jié)果，共獲得3株陽(yáng)性，分別命名為MeUGT41V-1，MeUGT41V-2和MeUGT41V-3，對(duì)照植株為TRV。相比TRV，3株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株中的MeUGT41基因表達(dá)量均顯著降低，分別降低了64%、35%和53%(圖3)。這些結(jié)果表明，MeUGT41基因在木薯葉片中被明顯抑制。

2.4 MeUGT41基因沉默木薯葉片抗病性表現(xiàn)

為分析MeUGT41基因在木薯葉片中的抗病能力，在MeUGT41基因沉默的葉片和對(duì)照葉片上分別接種Xam菌株。如圖4所示，接種0 d時(shí)，細(xì)菌數(shù)在轉(zhuǎn)基因葉片和對(duì)照葉片上都沒有顯著差異；而接種6 d后，MeUGT41基因沉默植株葉片上的細(xì)菌數(shù)量較對(duì)照組顯著增加。干擾植株中MeUGT41基因的表達(dá)量最低的是植株MeUGT14V-1(圖3)，而細(xì)菌數(shù)量最少的也是植株MeUGT14V-1(圖4)，基因表達(dá)量和細(xì)菌數(shù)量之間沒有呈現(xiàn)明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。但從葉片表型圖可以看出，MeUGT41基因沉默葉片上的菌斑更明顯(圖5)。以上結(jié)果表明，抑制MeUGT41基因的表達(dá)降低了木薯葉片抵抗Xam病菌侵染的能力。

3 討 論

木薯是熱帶和亞熱帶地區(qū)大戟科木薯屬植物，其地下塊根富含淀粉，被譽(yù)為“地下糧倉(cāng)”。木薯塊根不僅可以作為主糧，也可作為生產(chǎn)工業(yè)酒精和飼料的原料[13]。木薯細(xì)菌性枯萎病的致病菌是地毯草黃單胞菌，該病菌最初在拉丁美洲發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在已經(jīng)傳播至全世界，曾經(jīng)毀滅性打擊過多個(gè)國(guó)家的木薯產(chǎn)業(yè)。在中國(guó)木薯產(chǎn)區(qū)(廣西、廣東、海南)，也都發(fā)生過木薯細(xì)菌性枯萎病，嚴(yán)重危害中國(guó)木薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[15]。

UGTs家族基因能夠通過糖基化修飾植物體內(nèi)不同的天然化合物從而參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程。如通過糖基化修飾影響ABA、油菜素類固醇和生長(zhǎng)素等物質(zhì)的含量來調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)非生物脅迫過程[5-8, 18]。也有研究報(bào)道指出UGTs基因參與調(diào)控植物中水楊酸和茉莉酸的含量來響應(yīng)生物脅迫[12]。如ugt74f1擬南芥突變體植株中的水楊酸含量降低，突變體植株對(duì)病菌Pseudomonassyringae表現(xiàn)出易感性[19]；而ugt76b1擬南芥突變體則使得植株對(duì)病菌Alternariabrassicicola的抵抗力下降，而此時(shí)與茉莉酸相關(guān)的標(biāo)記基因的表達(dá)量被明顯抑制[12]。在本研究中，對(duì)MeUGT41基因的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該基因和木薯中的MeUGT85K5，MeUGT85K4基因的蛋白序列高度同源，有研究報(bào)道指出木薯中MeUGT85K4及MeUGT85K5基因和氰苷的合成密切相關(guān)[20]。目前沒有發(fā)現(xiàn)其他課題組對(duì)MeUGT41基因在木薯中的抗病功能進(jìn)行研究。本研究顯示Xam病菌處理會(huì)誘導(dǎo)MeUGT41基因的表達(dá)上升，抑制MeUGT41基因的表達(dá)量會(huì)降低木薯葉片對(duì)Xam病菌的抵抗力。雖然MeUGT41基因表達(dá)量被抑制的程度和細(xì)菌數(shù)量之間沒有明顯的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，但也能證明MeUGT41基因在木薯葉片抵抗Xam病菌侵染的過程中發(fā)揮了作用。而基因表達(dá)量和細(xì)菌數(shù)量之間的無對(duì)應(yīng)現(xiàn)象，推測(cè)可能是因?yàn)槿~片不同位置的MeUGT41基因被抑制的程度不同而導(dǎo)致。對(duì)MeUGT41、UGT76B1以及UGT74F1基因的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示它們之間有較近的進(jìn)化關(guān)系，推測(cè)MeUGT41基因可能是通過影響水楊酸和茉莉酸的合成來響應(yīng)Xam病菌侵染。綜上所述，MeUGT41基因表達(dá)和木薯抵抗細(xì)菌性枯萎病的能力密切相關(guān)，這些結(jié)果為研究MeUGT41基因抵抗木薯細(xì)菌性枯萎病的機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究木薯的抗生物脅迫機(jī)制提供了一定參考。