電化學(xué)適配體傳感器檢測(cè)生物標(biāo)志物研究進(jìn)展

馮雪晴，居 漪，李 卿，金中淦

（上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 200126）

長期以來，生物傳感器一直被期望成為醫(yī)學(xué)診斷和醫(yī)療領(lǐng)域的重要檢測(cè)和治療技術(shù)[1-2]。然而，在人體樣本的復(fù)雜生物環(huán)境下，生物傳感器的檢測(cè)性能受到限制[3]。目前，除用于糖尿病監(jiān)測(cè)的血糖儀外，生物傳感器的商業(yè)化和實(shí)際應(yīng)用很少。為快速、準(zhǔn)確檢測(cè)疾病的生物標(biāo)志物，研究人員通過各種分子生物技術(shù)和納米技術(shù)來提高生物傳感器的性能[4-5]。近年來，適配體作為高親和性和高特異性的“化學(xué)抗體”，受到越來越多的關(guān)注。適配體生物傳感器的優(yōu)勢(shì)是能夠很好地模擬含有生物標(biāo)志物的天然生物界面[6]，可以利用電活性物質(zhì)在界面處通過構(gòu)象改變產(chǎn)生的信號(hào)變化產(chǎn)生可被捕捉的生物信號(hào)。本文對(duì)采用適配體納米技術(shù)構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器的方法，以及生物傳感器在疾病生物標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 生物傳感器

生物傳感器是用來檢測(cè)生物標(biāo)志物并將其轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)的信號(hào)的裝置，由靶受體和信號(hào)轉(zhuǎn)換器2個(gè)部分組成。靶受體與生物標(biāo)志物間的相互作用使信號(hào)形成，理想的靶受體應(yīng)具有高度特異性和選擇性，可有效識(shí)別和特異性結(jié)合生物標(biāo)志物，達(dá)到快速響應(yīng)和輸出信號(hào)的目的。

適配體通過被固定在傳感器的界面上來捕獲溶液中的生物標(biāo)志物。適配體識(shí)別生物標(biāo)志物后，其電活性物質(zhì)與電極的構(gòu)象發(fā)生改變，電流響應(yīng)隨電子轉(zhuǎn)移能力的改變發(fā)生相應(yīng)變化，進(jìn)而定量測(cè)定待測(cè)物濃度。與溶液中的識(shí)別不同，界面處的適配體識(shí)別受到待測(cè)生物標(biāo)志物可及性的限制，這些限制對(duì)靈敏度、特異性和檢測(cè)速度造成了影響，需要減少界面的異質(zhì)性，并克服能量障礙，以改善適配體在生物傳感界面處的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)反應(yīng)[7]。以在金電極表面組裝巰基適配體為例，適配體的巰基可以與金電極形成Au-S鍵，并相互作用，使其從溶液中自發(fā)吸附到金電極上，然后重組為自組裝單層[8]，當(dāng)Au-S鍵的自由能低于溶解適配體的溶劑時(shí)，即可以形成穩(wěn)定的自組裝單層。

2 適配體納米技術(shù)

適配體是一段寡核苷酸序列，利用指數(shù)富集進(jìn)化技術(shù)從寡核苷酸的配體庫中被篩選出來。與診斷試劑常用的抗體相比，適配體可以識(shí)別生物標(biāo)志物細(xì)微的結(jié)構(gòu)差異，且解離常數(shù)高，可識(shí)別皮摩爾～納摩爾級(jí)生物標(biāo)志物靶標(biāo)[9-11]。功能性適配體可與有機(jī)、無機(jī)、生物分子結(jié)合并發(fā)生反應(yīng)，如蛋白質(zhì)，氨基酸、金屬離子、病毒、細(xì)菌、藥物、甚至細(xì)胞[12-14]，在疾病診斷和治療、臨床檢驗(yàn)和藥物開發(fā)等方面有著巨大的發(fā)展?jié)摿Α?980年，JONES等[15]首次提出具有特定序列和結(jié)構(gòu)的寡核苷酸可以用于電極表面的自組裝，利用熱力學(xué)定律可以精確得出適配體的折疊狀態(tài)和適配體之間的相互作用。由于可以控制適配體的形狀和長短，且可被靈活修飾，這種高度靈活的組裝能夠形成具有特定理化性質(zhì)和功能的結(jié)構(gòu)。這些優(yōu)勢(shì)可以應(yīng)用在生物傳感器的構(gòu)建上。

3 生物傳感器組裝方式

3.1 小分子輔助界面

適配體可以通過非特異性吸附于金電極表面來有效識(shí)別標(biāo)志物。小分子輔助界面可以使適配體垂直定向在界面上，并通過6-巰基己醇、二硫蘇糖醇和3-巰基丙酸等分子取代適配體堿基的非特異性吸附，提高其特異性識(shí)別能力。由巰基適配體和6-巰基己醇組成的間隔雙組分單分子層可以最大限度地減少適配體和金電極的非特異性吸附，提高適配體在金電極界面的識(shí)別效率。目前，小分子輔助界面已被廣泛應(yīng)用于提高適配體傳感器的識(shí)別效率、降低檢測(cè)限、增強(qiáng)靈敏度。ZHANG等[16]使用適配體/6-巰基己醇混合自組裝單層，將表面識(shí)別效率提高到了85%，通過將適配體的表面分子密度從1.2×1013個(gè)/cm2降低到1.2×1012個(gè)/cm2，提高了檢測(cè)靈敏度，證實(shí)了使用6-巰基己醇和巰基適配體形成二元自組裝單層有利于提高生物傳感器的性能。

3.2 多腺嘌呤介導(dǎo)的界面

適配體堿基和金電極相互作用的相關(guān)研究結(jié)果表明，適配體堿基對(duì)金電極的親和力遵循A>C≥G>T的順序[17]。腺嘌呤在金電極表面上吸附力很強(qiáng)，結(jié)合力可與眾所周知的Au-S鍵相媲美，金元素的存在甚至可以使腺嘌呤和胸腺嘧啶的雙鏈體變性。腺嘌呤與金電極的強(qiáng)結(jié)合親和力在設(shè)計(jì)不含巰基的適配體中具有很好的應(yīng)用前景[18]。為了控制適配體的構(gòu)象和接枝密度，可用腺嘌呤作為錨定基團(tuán)和密度控制基團(tuán)，使電極上的適配體密度隨著腺嘌呤長度的增加而降低；此外，腺嘌呤可優(yōu)先與金電極結(jié)合，阻止其他材料吸附于金電極，這一特性非常有效地阻止了其他材料的非特異性吸附。

3.3 納米材料組裝界面

納米材料[19-20]組裝界面一般通過改變界面處的傳質(zhì)來提高生物傳感器的便捷性。BESANT等[21]開發(fā)了納米材料微電極，用于研究生物傳感器的靈敏度；他們通過在硅片上制備電沉積后組裝巰基適配體來制備納米材料微電極，并進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，證實(shí)了納米材料微電極可以抑制適配體聚集，并增加界面?zhèn)髻|(zhì)，從而提高適配體的識(shí)別性能；該研究結(jié)果顯示，納米材料微電極適配體傳感器的靈敏度與普通電極相比，提高了10 000倍；并發(fā)現(xiàn)納米材料微電極傳感器的超高靈敏度具有很多優(yōu)勢(shì)，如可以在30 min內(nèi)檢測(cè)到細(xì)菌的RNA?；诩{米材料微電極的適配體檢測(cè)平臺(tái)可用于檢測(cè)一系列生物標(biāo)志物，包括病原抗菌藥物耐藥性標(biāo)志物和腫瘤生物標(biāo)志物。

3.4 基于框架核酸的組裝界面

框架核酸的中空結(jié)構(gòu)使空間能夠被最大化利用，非常適合在界面處組裝[22]，可以提供具有低成本和高重現(xiàn)性的高分辨率的界面。適配體連接的框架核酸錨定到界面上，可用于生物傳感的開發(fā)。PEI等[23]在框架核酸的頂部連上1個(gè)適配體，結(jié)果顯示，凝血酶與適配體形成了穩(wěn)定的夾層結(jié)構(gòu)，這一方法可用來特異性檢測(cè)凝血酶。類似的方法也可以應(yīng)用于其他標(biāo)志物的檢測(cè)。

4 適配體傳感器在生物標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用

4.1 用于腫瘤生物標(biāo)志物檢測(cè)

目前，適配體生物傳感器已被用于各種腫瘤生物標(biāo)志物、抗原和細(xì)胞的檢測(cè)，如人類表皮生長因子受體2、血管內(nèi)皮生長因子、表皮生長因子受體、PDGF黏液蛋白1、前列腺特異性抗原和癌胚抗原。

4.1.1 抗原類生物標(biāo)志物檢測(cè) 過去幾十年，基于適配體的生物傳感器因其良好的靈敏度和選擇性、快速響應(yīng)和低成本等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于低濃度抗原類標(biāo)志物的檢測(cè)。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是在胚胎內(nèi)胚層上皮中發(fā)現(xiàn)的潛在生物標(biāo)志物，一般用于監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌的治療效果，以及輔助診斷乳腺癌、胃腸道腫瘤、肝癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌。MAZLOUM-ARDAKANI等[24]開發(fā)了一種基于多壁碳納米管、血紅素和石墨烯納米片的電化學(xué)適配體傳感器，用于檢測(cè)CEA，線性范圍為1.0×10-15～1.0×10-8g/mL，檢測(cè)限為0.82 fg/mL；檢測(cè)原理為納米復(fù)合材料多壁碳納米管可提高導(dǎo)電性，并加速血紅素和電極之間的電子轉(zhuǎn)移，當(dāng)CEA結(jié)合適配體時(shí)，血紅素的信號(hào)會(huì)進(jìn)一步降低。這種低成本、高靈敏度和特異性的生物傳感器在臨床樣本CEA檢測(cè)中有較大的應(yīng)用價(jià)值。見圖1。

圖1 用于檢測(cè)CEA的適配體傳感器的制備和工作示意圖[24]

4.1.2 循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè) 循環(huán)腫瘤細(xì)胞由原發(fā)腫瘤組織脫落后，可進(jìn)入血液循環(huán)和淋巴循環(huán)，因其在腫瘤轉(zhuǎn)移早期階段出現(xiàn)，已成為癌癥監(jiān)測(cè)和診斷的重要生物標(biāo)志物[25]。YANG等[26]開發(fā)了一種DNA標(biāo)記夾心電化學(xué)生物傳感器，基于3D石墨烯和金納米籠/氨基化多壁碳納米管混合物，采用差分脈沖伏安法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞MCF-7；由于納米材料具有放大信號(hào)的優(yōu)勢(shì)，這種電化學(xué)傳感器檢測(cè)MCF-7細(xì)胞時(shí)表現(xiàn)出高特異性和高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)范圍為1.0×102～1.0×106個(gè)/mL，檢測(cè)限低至80 個(gè)/mL。這種方法具有很大的實(shí)際應(yīng)用潛力，在癌癥診斷中具有較好的前景。

4.1.3 外泌體檢測(cè) 外泌體是一種細(xì)胞外囊泡，直徑為30～150 nm，可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，被認(rèn)為是最重要的腫瘤生物標(biāo)志物之一[27]。

ZHOU等[28]將適配體固定在電極的表面，在互補(bǔ)適配體的一端修飾電活性物質(zhì)亞甲藍(lán)，當(dāng)目標(biāo)外泌體存在時(shí)，CD63適配體可以識(shí)別外泌體上的CD63蛋白膜，電活性物質(zhì)在電極上的電信號(hào)發(fā)生改變，從而實(shí)現(xiàn)外泌體的檢測(cè)。見圖2。

圖2 基于適配體檢測(cè)外泌體的示意圖[28]

4.2 用于心血管疾病生物標(biāo)志物檢測(cè)

心血管疾病是人類健康的最大威脅，具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)。開發(fā)操作簡(jiǎn)單、靈敏、低成本的心血管疾病生物標(biāo)志物傳感器非常必要。QIAO等[29]開發(fā)了基于適配體-MoS2納米共軛物的電化學(xué)傳感器，用于檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I，并與基于Au@SiO2@Au納米顆粒的電化學(xué)傳感器的檢測(cè)效能進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，2種傳感器均可以檢測(cè)人血液樣本中的心肌肌鈣蛋白I，但基于適配體-MoS2納米共軛物的電化學(xué)傳感器檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I的線性范圍為10 pmol/L～1.0 μmol/L，檢測(cè)限為0.95 pmol/L，較適配體Au@SiO2@Au傳感器具有更低的檢測(cè)限；此外，在不含有肌酸激酶MB同工酶和肌紅蛋白的樣本中，2種傳感器均表現(xiàn)出良好的診斷效能。

4.3 用于阿爾茨海默病生物標(biāo)志物檢測(cè)

阿爾茨海默病的神經(jīng)紊亂是進(jìn)行性且不可逆的，會(huì)導(dǎo)致患者記憶喪失，且患者后期一般生活無法自理。β-淀粉樣蛋白是臨床早期診斷阿爾茨海默病的生物標(biāo)志物。目前，已經(jīng)有適配體生物傳感器用于Aβ蛋白檢測(cè)，基于這種電化學(xué)生物傳感器開發(fā)的檢測(cè)設(shè)備，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定、成本低、可小型化的優(yōu)點(diǎn)，有較好的臨床應(yīng)用前景。

ZHANG等[30]發(fā)現(xiàn)，具有電活性的莖環(huán)適配體被固定在金電極上后，適配體上修飾的電活性物質(zhì)二茂鐵（Fc）可通過識(shí)別淀粉樣蛋白寡聚體前后的構(gòu)象變化導(dǎo)致的電荷轉(zhuǎn)移量的變化來檢測(cè)淀粉樣蛋白寡聚體，莖環(huán)（B-3'Fc）適配體與淀粉樣蛋白寡聚體結(jié)合后，F(xiàn)c峰電流會(huì)降低；此外，通過優(yōu)化交流伏安法的檢測(cè)頻率，可以進(jìn)一步降低傳感器的檢測(cè)限，但同時(shí)會(huì)使檢測(cè)范圍變窄；基于這一發(fā)現(xiàn)，他們開發(fā)了一種基于莖環(huán)的電化學(xué)適配體傳感器，可高選擇性和高靈敏度地定量亞皮摩爾濃度的淀粉樣蛋白寡聚體，可能有利于阿爾茨海默病的診斷。

4.4 病原微生物標(biāo)志物檢測(cè)

微生物中的致病菌可以導(dǎo)致人類疾病，給人類健康和公共衛(wèi)生帶來諸多挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法需要在培養(yǎng)基中培養(yǎng)病原菌，然后進(jìn)行鑒定。用這種方法得到的結(jié)果雖然準(zhǔn)確，但是至少需要4～7 d才能得到結(jié)果。其他方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，依賴于抗原-抗體反應(yīng)，易受pH值和溫度等環(huán)境因素的影響。電化學(xué)適配體生物傳感器病原體檢測(cè)技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高、信號(hào)穩(wěn)定、可小型化等諸多優(yōu)勢(shì)，且可與微制造工藝兼容，并進(jìn)行真實(shí)樣品檢測(cè)[29]。

DAI等[31]發(fā)現(xiàn)，具有反式切割活性的Cas12a核酸內(nèi)切酶可對(duì)單鏈DNA啟動(dòng)反式切割，將標(biāo)記有亞甲基藍(lán)的單鏈DNA固定在金電極電化學(xué)傳感器，在待測(cè)物存在的條件下，Cas12acrRNA可啟動(dòng)對(duì)非特異性單鏈DNA 的反式切割，使亞甲藍(lán)的電流降低；基于這一發(fā)現(xiàn)，他們開發(fā)了一種基于CRISPR Cas12a（cpf1）的電化學(xué)生物傳感器——E-CRISPR，為了證明其系統(tǒng)通用性，他們將開發(fā)的E-CRIPSR首次應(yīng)用于人乳頭瘤病毒和細(xì)小病毒B1916核酸檢測(cè)，結(jié)果顯示，由于優(yōu)化了Cas12a體外反式切割的化學(xué)環(huán)境，無需任何酶促進(jìn)擴(kuò)增，E-CRISPR達(dá)到了皮摩爾水平的檢測(cè)限；他們進(jìn)一步設(shè)計(jì)了基于E-CRISPR級(jí)聯(lián)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，用于檢測(cè)臨床樣本中的轉(zhuǎn)化生長因子-β1蛋白。相信在電化學(xué)和CRISPR的結(jié)合下，E-CRISPR可以成為便攜、精準(zhǔn)和低成本的即時(shí)診斷系統(tǒng)的強(qiáng)大推動(dòng)力。E-CRISPR的檢測(cè)原理見圖3。

圖3 E-CRISPR的檢測(cè)原理[31]

5 總結(jié)和展望

適配體傳感器在生物標(biāo)志物的定量和定性檢測(cè)上有很多的應(yīng)用。寡核苷酸適配體被認(rèn)為是可識(shí)別生物標(biāo)志物的智能分子。但是，盡管適配體已經(jīng)被用于多種傳感平臺(tái)，仍有很多需要解決的問題和挑戰(zhàn)。

（1）大規(guī)模生產(chǎn)DNA/RNA適配體成本較高，且由于酶的存在，許多適配體在人血液中會(huì)被快速降解。有研究發(fā)現(xiàn)，添加具有生物相容性的官能團(tuán)可提高其耐酶性；開發(fā)異種核酸作為有效和通用的適配體，在適配體的實(shí)際應(yīng)用中也有較好的前景[32]。

（2）靈敏度需要進(jìn)一步提高。將適配體與量子點(diǎn)、金屬納米粒子等納米材料結(jié)合[33-34]，采用DNA納米機(jī)器和滾動(dòng)圓放大、聚合酶鏈反應(yīng)等技術(shù)，可以提高適配體傳感器的靈敏度。ZHANG等[35]提出了一種組裝方法——Bindinginduced DNA，可以檢測(cè)復(fù)雜樣本中低濃度的目標(biāo)分子，這種檢測(cè)方法可以應(yīng)用于脂類、核酸、低聚糖、病毒和病原體等多種生物分子的檢測(cè)。另外，信號(hào)放大也是在極低濃度被測(cè)物條件下提高檢測(cè)靈敏度的有效策略[36]。

（3）適配體臨床檢測(cè)應(yīng)用受限。雖然目前關(guān)于適配體傳感器的研究較多[37-38]，但因信噪比較低、細(xì)胞基質(zhì)和體液可能會(huì)掩蔽適配體、多通道檢測(cè)困難等不足，使適配體傳感器的臨床應(yīng)用受到很大限制。傳感器的設(shè)計(jì)方面，可以將多個(gè)適配體固定在檢測(cè)平臺(tái)上，以同時(shí)檢測(cè)多種疾病標(biāo)志物；另外，以納米技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測(cè)平臺(tái)，有望實(shí)現(xiàn)高選擇性、高特異性、低成本、高效、快速、多通道檢測(cè)的目標(biāo)。相信隨著研究的不斷深入，適配體傳感器會(huì)廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)。