恥垢分枝桿菌精氨酸代謝變化對(duì)細(xì)菌毒力及肺上皮細(xì)胞線粒體功能的影響

周紫薇，林 晨，李燁雨，王玉臣，張 鷺

（復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438）

20世紀(jì)90年代初，全球結(jié)核病疫情開(kāi)始呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，特別是結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）和人類(lèi)免疫缺陷病毒共感染、耐藥、耐多藥（multi-drug resistance，MDR）和廣泛耐藥（extensively-drug resistance，XDR）菌株的不斷出現(xiàn)，使結(jié)核病成為世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問(wèn)題。2019年，全球約有1 000萬(wàn)人患上結(jié)核病，其中約有140萬(wàn)例結(jié)核病患者死亡，因MDR結(jié)核病死亡的患者約18.2萬(wàn)例[1]。作為胞內(nèi)致病菌，MTB與宿主細(xì)胞的相互適應(yīng)及調(diào)控機(jī)制，是值得關(guān)注的重要科學(xué)問(wèn)題。

精氨酸不僅是細(xì)菌蛋白質(zhì)合成中重要的氨基酸，還可以作為細(xì)菌生長(zhǎng)的唯一氮源，甚至是碳源和能量來(lái)源[2]，它是合成多胺的底物，對(duì)細(xì)菌的極端耐酸能力非常重要。此外，精氨酸胍基參與多種生命活動(dòng)，涉及許多調(diào)節(jié)和組織特征的復(fù)雜相互作用，包括與蛋白質(zhì)和核酸的相互作用，對(duì)細(xì)菌的生理和致病性有重要影響，了解精氨酸代謝對(duì)于病原和宿主的影響有重要意義。精氨酸從頭合成通路受到破壞會(huì)使細(xì)胞內(nèi)精氨酸供應(yīng)不足，中間產(chǎn)物和活性氧積累，并發(fā)揮快速殺菌的作用[3]，這個(gè)合成通路涉及多種酶的作用，相應(yīng)編碼基因構(gòu)成ARG box，位于argC上游啟動(dòng)子區(qū)域；抑制性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ArgR可在精氨酸存在的情況下與ARG box結(jié)合，抑制該通路的轉(zhuǎn)錄。

恥垢分枝桿菌（Mycolicibacterium smegmatis，M.smeg）與MTB的同源基因超過(guò)2 000個(gè)，具有較MTB更為廣泛的天然耐藥譜，迄今為止，唯一獲批的抗結(jié)核新藥苯達(dá)奎林就是以M.smeg作為模式菌株進(jìn)行篩選而確證的[4]。MTB中的11個(gè)雙組分系統(tǒng)和5個(gè)組蛋白激酶（共7個(gè)）均與M.smeg具有高度同源性，缺氧持留下的相關(guān)基因也在M.smeg中被找到[5]。因此，M.smeg不僅可以作為篩選抗菌藥物的良好模型，還是研究MTB基因表達(dá)和病原宿主互作的良好模式菌株。本研究中的精氨酸代謝途徑已被證明在細(xì)菌中相對(duì)保守[6]，分析精氨酸在M.smeg中的代謝途徑，有助于對(duì)致病性MTB中精氨酸代謝特征的解析。肺泡上皮細(xì)胞是分枝桿菌入侵宿主細(xì)胞的第一道防線，分枝桿菌感染人類(lèi)Ⅱ型肺上皮細(xì)胞的能力已被證實(shí)[7]，其在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中的增殖率比其他細(xì)胞高15～20倍[8]，且具有一定的胞間播散能力[9-10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞感染過(guò)程中，M.smeg可以通過(guò)感染A549細(xì)胞轉(zhuǎn)化為致病表型[11]。因此，本研究選擇A549細(xì)胞作為模式細(xì)胞株，初步探索分枝桿菌精氨酸代謝變化對(duì)細(xì)菌-宿主相互作用的影響。

1 材料和方法

1.1 菌株和載體

大腸埃希菌（Escherichia coli） Trans 5α感受態(tài)菌株（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；恥垢分枝桿菌（M.smeg MC2155）野生型菌株（本課題組保存）；pCR-Hyg質(zhì)粒、pJV53-Cpf1質(zhì)粒（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院結(jié)核病研究中心惠贈(zèng)）；A549細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)室留存）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和培養(yǎng)基

細(xì)菌基因組小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）清潔試劑盒（美國(guó)Axygen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）；Talent熒光定量試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]；7H9液體培養(yǎng)基、7H10固體培養(yǎng)基（美國(guó)BD公司）。

1.3 M.smeg argR的敲除及驗(yàn)證

參考文獻(xiàn)[12]，利用Crispr技術(shù)構(gòu)建argR敲除的M.smeg。RNA抽提：從-80 ℃冰箱中取出保存的細(xì)菌，在7H10平板上進(jìn)行劃線，37 ℃培養(yǎng)48 h后，挑取生長(zhǎng)良好的單個(gè)菌落，37 ℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期[600 nm處吸光度（A）值為0.8～1.0]，1∶1 000接種至3 mL無(wú)抗7H9（含0.2%甘油、0.05%Tween-80和10%OADC）中，待其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期，1 800×g離心10 min收取菌體，采用Trizol法抽提RNA。采用分光光度計(jì)（德國(guó)Eppendorf公司）定量，并使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）進(jìn)行驗(yàn)證。精氨酸代謝相關(guān)基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 精氨酸代謝相關(guān)基因引物序列

1.4 細(xì)菌體外生長(zhǎng)

將野生型mc2155M.smeg（WT）以及argR敲除的M.smeg突變株（ΔargR）在7H9培養(yǎng)基（含有0.05%Tween-80和10%ADC）中37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，分別稀釋至不含0.2%甘油和含0.2%甘油的7H9培養(yǎng)基（含有0.05%Tween-80）中，使A600nm值為0.05，37 ℃搖床培養(yǎng)。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)曲線后，選取對(duì)數(shù)前期、對(duì)數(shù)中期、對(duì)數(shù)后期、穩(wěn)定期菌液測(cè)量A600nm值。

1.5 細(xì)菌脂類(lèi)代謝相關(guān)基因

嚴(yán)格按試劑盒要求，采用RT-qPCR對(duì)脂肪酸代謝相關(guān)基因進(jìn)行驗(yàn)證。M.smeg脂類(lèi)代謝相關(guān)基因及引物見(jiàn)表2。

表2 M.smeg脂類(lèi)代謝相關(guān)基因及引物

1.6 細(xì)胞侵染

復(fù)蘇A549細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳代2次后，稀釋至1×105個(gè)/mL，按每孔1 mL加至24孔板內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)24 h，使其完全貼壁。WT和ΔargR在7H9培養(yǎng)基（含0.2%甘油、0.05%Tween-80和10% OADC）中37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)至A600nm值為0.8～1.0，取適量菌液1 800×g離心10 min，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，使用含10%胎牛血清的DMEM稀釋至MOI為25進(jìn)行侵染，2 h后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，貼壁緩緩加入等體積磷酸鹽緩沖液，輕晃平皿后棄去，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次后加入1 mL 0.1%Triton-X100，37 ℃孵育15 min，用1 mL槍頭充分吹洗平皿，吹打混勻使細(xì)胞充分裂解，轉(zhuǎn)移至1.5 mL Eppendorf管，用磷酸鹽緩沖液（含0.05% Tween-80）稀釋涂板。

1.7 CCK8細(xì)胞活力檢測(cè)

按照上述細(xì)胞侵染條件在96孔板侵染CCK8細(xì)胞，分別于浸染2、18、24、48 h后測(cè)定細(xì)胞活力。吸凈原培養(yǎng)基，換用新的DMEM完全培養(yǎng)基100 μL，迅速用排槍加入10 μL CCK8試劑，避免產(chǎn)生氣泡，用搖板輕輕混勻，37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育40 min，檢測(cè)A450nm值。細(xì)胞活力（%）=[A（實(shí)驗(yàn)組）-A（空白）]/[A（對(duì)照組）-A（空白）]×100%。

1.8 細(xì)胞線粒體功能相關(guān)基因檢測(cè)

嚴(yán)格按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求，采用RT-qPCR對(duì)細(xì)胞線粒體功能相關(guān)基因UCP1、DNM1L進(jìn)行驗(yàn)證。引物序列見(jiàn)表3。

表3 細(xì)胞線粒體功能相關(guān)基因及引物

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad prism 8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 M.smeg argR的敲除及驗(yàn)證

利用Crispr技術(shù)成功將第34和第35個(gè)氨基酸突變?yōu)榻K止密碼子UAA，獲得argR敲除菌株。argR敲除菌株內(nèi)部2個(gè)連續(xù)的密碼子被突變?yōu)?個(gè)終止密碼子，但仍能夠轉(zhuǎn)錄，因在RNA水平無(wú)法檢測(cè)，故根據(jù)文獻(xiàn)[12]的標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)序結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求即可判定敲除成功。分枝桿菌中位于argC起始位點(diǎn)的ARG box受轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ArgR的抑制。野生型M.smeg中，因?yàn)閍rgR的表達(dá)，相關(guān)效應(yīng)基因argB、argC、argD和argF表達(dá)受到抑制。為了從調(diào)控功能角度進(jìn)一步驗(yàn)證ΔargR菌株中的argR表達(dá)缺陷，我們針對(duì)ARG box的效應(yīng)基因設(shè)計(jì)RT-qPCR引物，檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖1（argD由于表達(dá)量較低，無(wú)法檢測(cè)，圖中未展示）。argR表達(dá)缺陷的ΔargR菌株中，ARG box中效應(yīng)基因的表達(dá)抑制作用被解除，argB、argC、argJ和argF轉(zhuǎn)錄水平均明顯上調(diào)表達(dá)，從遺傳調(diào)控功能角度驗(yàn)證突變株構(gòu)建成功。

圖1 Arg從頭合成通路組成基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證結(jié)果

2.2 細(xì)菌體外生長(zhǎng)

細(xì)菌生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2（a）；在僅以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中，ΔargR的生長(zhǎng)情況優(yōu)于野生型，見(jiàn)圖2（b）；在以甘油和葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中，ΔargR的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)被中和，與WT趨于一致，見(jiàn)圖2（c）。

圖2 含有不同營(yíng)養(yǎng)成分的7H9中M.smeg生長(zhǎng)情況

2.3 細(xì)菌脂類(lèi)代謝相關(guān)基因檢測(cè)

RT-qPCR結(jié)果顯示，脂類(lèi)分解代謝相關(guān)基因（fadD21、fadD2、fadD9和fadA5）均顯著下調(diào)。脂滴形成相關(guān)基因MSMEG_2695（MTB編號(hào)為Rv2744c）顯著下調(diào)，分枝菌酸合成上調(diào)。見(jiàn)圖3。

圖3 細(xì)菌脂類(lèi)代謝相關(guān)基因表達(dá)變化

2.4 細(xì)菌入胞率及細(xì)胞活力

ΔargR入胞率高于WT，ΔargR侵染使得細(xì)胞活力顯著下降，在2 h時(shí)即有顯著差異。見(jiàn)圖4。

圖4 ΔargR入胞率及細(xì)胞活力

2.5 細(xì)胞線粒體功能相關(guān)基因表達(dá)變化

RT-qPCR結(jié)果顯示，細(xì)胞線粒體功能相關(guān)基因UCP1和DNM1L表達(dá)量均顯著下調(diào)。見(jiàn)圖5。

圖5 細(xì)胞線粒體功能相關(guān)基因表達(dá)變化

3 討論

結(jié)核病難診斷、難治療、預(yù)后差，耐藥結(jié)核更是給結(jié)核病的防治帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。結(jié)核菌具有隨宿主不斷進(jìn)化的獨(dú)特免疫逃逸機(jī)制。精氨酸在病原與宿主生理及代謝中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其對(duì)于分枝桿菌毒力及致病性的影響值得關(guān)注。

有研究結(jié)果顯示，MTB的fadD2和fadA5對(duì)環(huán)境脂質(zhì)含量的變化十分敏感，在以葡萄糖為主要碳源和以膽固醇與脂肪酸為主要碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)表達(dá)情況變化顯著，在富脂環(huán)境中因應(yīng)激表達(dá)顯著上調(diào)，并上調(diào)脂肪酸分解代謝[13]。當(dāng)MTB在以丁酸為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，fadD9表達(dá)上調(diào)，以增加對(duì)脂肪酸的分解和利用[14]，突變株的脂類(lèi)分解代謝相關(guān)基因均顯著下調(diào)。此外，MSMEG_2695（MTB編號(hào)為Rv2744c）敲除可以使M.smeg中脂滴數(shù)量增加，且變得大而透亮，MSMEG_2695在突變株中的下調(diào)與細(xì)菌脂類(lèi)分解代謝下調(diào)和文獻(xiàn)[15]結(jié)果一致。

線粒體是真核細(xì)胞維持生命活動(dòng)和代謝調(diào)控的重要細(xì)胞器，能夠?yàn)榻^大多數(shù)細(xì)胞信號(hào)通路提供能量[16]。同時(shí)，線粒體是高度動(dòng)態(tài)變化的細(xì)胞器，可以不斷地重塑其結(jié)構(gòu)，特別是其形成分布在很大程度上是通過(guò)線粒體分裂、融合、運(yùn)動(dòng)和系結(jié)等保守活動(dòng)來(lái)維持的[17]，這一過(guò)程受到多個(gè)通路的調(diào)控，極易受到外在環(huán)境的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，線粒體是控制多種疾病進(jìn)程的關(guān)鍵因子，已經(jīng)成為一些細(xì)菌和病毒病原體控制宿主代謝以達(dá)到在感染過(guò)程中生存、復(fù)制和播散的靶標(biāo)[18]。因此，基于CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力的原理，本研究選擇線粒體功能相關(guān)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平定量分析，定量結(jié)果顯示，線粒體脂肪酸代謝下調(diào)，分裂受到抑制。提示線粒體功能受損是ΔargR導(dǎo)致的細(xì)胞活力下調(diào)的原因之一，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。

綜上所述，分枝桿菌argR的敲除使得細(xì)菌精氨酸合成代謝上調(diào)，細(xì)菌脂質(zhì)儲(chǔ)存能力提高有利于細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)相對(duì)不足的環(huán)境中長(zhǎng)期生存，特別是作為胞內(nèi)菌，這種能力可能有利于分枝桿菌應(yīng)對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)限制壓力；此外，細(xì)菌侵染上皮細(xì)胞A549的能力提高，分枝菌酸合成上調(diào)，而分枝菌酸是分枝桿菌細(xì)胞壁的一個(gè)重要毒力因子，提示其毒力可能增強(qiáng)，更有利于細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的侵染；本研究進(jìn)一步分析了宿主細(xì)胞侵染后的生理現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)ΔargR菌株可以干擾宿主細(xì)胞線粒體功能，抑制其脂類(lèi)代謝活性及線粒體分裂過(guò)程，是細(xì)胞活力下降的原因之一。

精氨酸代謝變化不僅對(duì)分枝桿菌的生理及代謝產(chǎn)生重要影響，還進(jìn)一步影響宿主細(xì)胞的生命活動(dòng)，尤其包含了對(duì)細(xì)胞線粒體功能的干擾，結(jié)合線粒體的關(guān)鍵作用，本研究從病原菌和宿主細(xì)胞角度揭示了分枝桿菌精氨酸代謝對(duì)細(xì)菌毒力的重要影響，對(duì)探究感染過(guò)程中宿主與病原相互作用關(guān)系、尋找藥物靶點(diǎn)有積極意義。