miR-19b在人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞鈣化中的作用

楊 濛，丁 輝

（西北大學(xué)附屬醫(yī)院 西安市第三醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西 西安 710018）

鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病是與老年人心血管疾病密切相關(guān)的一種退行性疾病[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，主動(dòng)脈瓣膜鈣化是類似成骨樣分化的主動(dòng)過程，涉及多個(gè)成骨相關(guān)因子的表達(dá)調(diào)節(jié)[2]。主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞是主動(dòng)脈瓣中的主要細(xì)胞之一，在維持瓣膜正常生理功能方面有重要作用[3]。在疾病的刺激下，主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞可能發(fā)生功能受損，從而導(dǎo)致主動(dòng)脈瓣膜病變的發(fā)生[4]。主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞樣細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化是主動(dòng)脈瓣鈣化病理改變的基礎(chǔ)之一[4]。miRNA參與了人體的多種生理和病理過程，如細(xì)胞增殖、凋亡和分化[5]。有研究結(jié)果顯示，miR-19b的低表達(dá)與心血管疾病患者的死亡率密切相關(guān)[6]。但miR-19b在主動(dòng)脈瓣鈣化疾病中的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。為此，本研究擬探討miR-19b在主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞鈣化中的作用及具體機(jī)制，為臨床主動(dòng)脈瓣鈣化疾病的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

infinite M200 PRO多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司），StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國ABI公司），AgaroPower電泳儀（韓國BIONEER公司）。

人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞（human valve interstitial cell，hVIC）購自美國DV公司。胎牛血清、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、地塞米松、抗維生素C和β-甘油磷酸均購自美國Sigma公司。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrigen公司。Von Kossa染色試劑盒及SMAD4抗體均購自美國Abcam公司。RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser）和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)試劑盒均購自日本TaKaRa公司。miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)并合成轉(zhuǎn)錄受體相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2（Runt-related gene 2，RUNX2）基因、骨鈣素（osteocalcin，OC）基因、SMAD1基因、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）基因和SMAD4基因的引物序列，見表1。以β-actin或U6為內(nèi)參。miR-19b模擬物、miR-19b空白對照（miRNC）及SMAD4過表達(dá)質(zhì)粒設(shè)計(jì)及合成由漢尹生物科技（上海）有限公司完成。一抗[SMAD4抗體（貨號：ab40759）、抗3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（貨號：ab9485）]及二抗（貨號：ab6759）均購自英國Abcam公司。聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自美國Millipore公司。

表1 引物序列

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

將經(jīng)鈣化誘導(dǎo)的hVIC細(xì)胞作為鈣化模型組，以未做處理的hVIC細(xì)胞作為對照組。根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同，將hVIC細(xì)胞分為miR-19b空白對照組，miR-19b過表達(dá)組、SMAD4過表達(dá)組、miR-19b和SMAD4同時(shí)過表達(dá)（miR-19b+SMAD4過表達(dá)）組。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

對照組hVIC細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。鈣化模型組hVIC細(xì)胞用含0.1%胎牛血清、50 ng/mL BMP-2、100 nmol/L地塞米松、50 μg/mL抗維生素C和5 mmol/L β-甘油磷酸的DMEM培養(yǎng)，每隔2天更換1次培養(yǎng)基[7-8]。所有細(xì)胞均在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將hVIC細(xì)胞以3×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種至6孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度為80%時(shí)，使用30 pmol miR-19b模擬物或2.5 μg SMAD4過表達(dá)質(zhì)粒，根據(jù)Lipofectamine 2000試劑盒說明書轉(zhuǎn)染hVIC細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.5 Von Kossa染色

去除對照組和鈣化模型組hVIC細(xì)胞的培養(yǎng)基后，用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）沖洗3次；用4%多聚甲醛固定10 min，隨后使用蒸餾水洗滌3次；將hVIC細(xì)胞浸入新配置的5%硝酸銀溶液中，紫外燈照射60 min后使用5%硫代硫酸鈉還原2 min；用95%乙醇逐級各脫水2次，在CX23型光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）下用低倍鏡觀察，記錄各組hVIC細(xì)胞中鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)目。

1.6 熒光定量PCR

常規(guī)提取各組hVIC細(xì)胞內(nèi)的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）（mRNA采用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，miRNA采用miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒）。采用熒光定量PCR定量檢測RUNX2 mRNA、OC mRNA、SMAD1 mRNA、OPN mRNA、SMAD4 mRNA和miR-19b的表達(dá)量。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算RUNX2 mRNA、OC mRNA、SMAD1 mRNA、OPN mRNA、SMAD4 mRNA及miR-19b的表達(dá)量。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

通過StarBase數(shù)據(jù)庫（https：//starbase.sysu.edu.cn）在線預(yù)測miR-19b的下游靶基因。采用PCR擴(kuò)增SMAD4 mRNA 3'-非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR），插入psiCHECK2載體，構(gòu)建野生型（wide-type，WT）質(zhì)粒，以WT質(zhì)粒為模板，通過點(diǎn)突變的方式構(gòu)建突變型（mutanttype，Mut）質(zhì)粒。將hVIC細(xì)胞以3×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種至96孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度為80%時(shí)，轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-19b-mimics、psiCHECK2-SMAD4-WT或psiCHECK2-SMAD4-Mut，轉(zhuǎn)染后48 h在各孔中加入100 μL裂解液并離心。收集各孔上清液后，加入40 μL螢火蟲熒光素酶底物，輕晃搖勻后上機(jī)檢測熒光強(qiáng)度。再向各孔中加入40 μL海腎熒光素酶底物，輕晃搖勻后測量各孔的熒光素酶活性。

1.8 免疫印跡法

采用RIPA裂解液分離hVIC細(xì)胞內(nèi)的總蛋白。將蛋白質(zhì)混合物95 ℃加熱10 min。將20 μL加熱后的蛋白質(zhì)混合物加入聚丙烯酰胺凝膠平板中，電泳分離蛋白質(zhì)。將電泳后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在4 ℃條件下與SMAD4一抗封閉過夜，采用三羥甲基氨基甲烷-吐溫緩沖液（tris-hydroxymethyl aminomethane-Tween，TBST）洗滌3次后加入二抗，在室溫下孵育1 h。使用ECL試劑盒（美國ThermoFisher Scientific公司）進(jìn)行顯影后拍照，使用Image J軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）分析條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用GrapahPad 8.2軟件作圖。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人主動(dòng)脈間質(zhì)細(xì)胞體外鈣化模型構(gòu)建

鈣化模型組hVIC細(xì)胞密度增加，互相重疊生長，并表現(xiàn)出明顯的聚集樣生長趨勢。Von Kossa染色結(jié)果顯示，鈣化模型組hVIC細(xì)胞外基質(zhì)中鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)目明顯多于對照組。熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，鈣化模型組hVIC細(xì)胞內(nèi)成骨相關(guān)因子RUNX2 mRNA、OC mRNA、SMAD1 mRNA和OPN mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照組（P<0.05）。見圖1。

圖1 hVIC細(xì)胞體外鈣化模型

2.2 miR-19b對hVIC細(xì)胞鈣化的作用

鈣化模型組miR-19b表達(dá)量（0.46±0.06）顯著低于對照組（1.00±0.10）（t=8.020，P<0.01），miR-19b過表達(dá)組（2.46±0.21）顯著高于對照組（t=10.870，P<0.001）。

miR-19b過表達(dá)組hVIC細(xì)胞內(nèi)成骨相關(guān)因子RUNX2 mRNA、OC mRNA、SMAD1 mRNA及OPN mRNA表達(dá)量顯著低于鈣化模型組（P<0.05、P<0.01、P<0.01、P<0.01）。見表2。

表2 miR-19b過表達(dá)組與鈣化模型組成骨相關(guān)因子表達(dá)的比較

2.3 miR-19b下游靶基因的預(yù)測結(jié)果

StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示，SMAD4與miR-19b的3'-UTR端存在部分結(jié)合序列，見圖2。

圖2 miR-19b與SMAD4的結(jié)合序列

miR-19b過表達(dá)組SMAD4蛋白的表達(dá)量（0.42±0.04）和野生型SMAD4熒光素酶活性（0.53±0.05）均顯著低于miR-NC組（1.00±0.14和1.00±0.11）（t值分別為6.900、6.737，P<0.01）；而miR-19b過表達(dá)組突變型SMAD4熒光素酶活性（0.97±0.06）與miRNC組（1.00±0.07）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。

圖3 miR-19b過表達(dá)組與miR-NC組SMAD4蛋白相對表達(dá)量及SMAD4熒光素酶活性比較

2.4 miR-19b/SMAD4分子軸在人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞鈣化中的作用

鈣化模型組、SMAD4過表達(dá)組SMAD4 mRNA相對表達(dá)量分別為1.46±0.09、3.15±0.17，均顯著高于對照組（1.00±0.10）（t值分別為5.922、18.881，P<0.001），miR-19b+SMAD4過表達(dá)組SMAD4 mRNA水平與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

SMAD4過表達(dá)組RUNX2 mRNA、OC mRNA、SMAD1 mRNA和OPN mRNA的相對表達(dá)量顯著高于鈣化模型組和miR-19b+SMAD4過表達(dá)組（P<0.05），而鈣化模型組與miR-19b+SMAD4過表達(dá)組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

表3 各組成骨相關(guān)因子表達(dá)的比較

3 討論

目前，除了傳統(tǒng)的手術(shù)治療外，尚無其他方法可阻止主動(dòng)脈瓣鈣化的發(fā)生、發(fā)展。有研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)、主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、凋亡、血管形成和礦物質(zhì)沉積等多種病理改變在主動(dòng)脈瓣鈣化疾病中發(fā)揮重要作用[9]。

成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RUNX2、SMAD1是多種成骨細(xì)胞和骨組織標(biāo)志物，其水平升高提示主動(dòng)脈瓣鈣化[10]。有研究結(jié)果顯示，主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化是主動(dòng)脈瓣鈣化疾病的發(fā)病原因之一[11]。本研究通過體外培養(yǎng)主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)其發(fā)生鈣化，在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞聚集生長，采用Von Kossa染色后發(fā)現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量增多，同時(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RUNX2、OC、SMAD1及Osteoponin水平增高，提示鈣化模型成功建立。

miRNA是一類具有重要生物學(xué)功能的內(nèi)源性非編碼小RNA。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-137可調(diào)節(jié)主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的成骨活性[12-13]。有研究結(jié)果顯示，在小鼠主動(dòng)脈鈣化模型中，miR-204表達(dá)降低，RUNX2表達(dá)升高，提示miR-204是主動(dòng)脈鈣化疾病的潛在治療靶標(biāo)[14]；miR-638在主動(dòng)脈瓣鈣化組織中表達(dá)增加，且具有調(diào)節(jié)主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞鈣化的作用[15]。miR-19b是近年來發(fā)現(xiàn)與心臟疾病密切相關(guān)的miRNA之一[16-17]，但其在主動(dòng)脈瓣鈣化疾病中的作用鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，鈣化模型組miR-19b表達(dá)量明顯降低，過表達(dá)miR-19b可誘導(dǎo)鈣化模型細(xì)胞降低RUNX2 mRNA、OC mRNA、SMAD1 mRNA和OPN mRNA的表達(dá)，提示miR-19b表達(dá)的異常缺失可能是導(dǎo)致主動(dòng)脈瓣鈣化疾病的因素之一。有學(xué)者在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-19b過表達(dá)可誘導(dǎo)RUNX2表達(dá)增加，促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化[18]。然而，本研究在主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-19b可抑制RUNX2表達(dá)，這與既往在其他細(xì)胞系中的發(fā)現(xiàn)[18]相反，提示miR-19b具有細(xì)胞表達(dá)特異性及功能的差異。此外，既往支持miR-19b調(diào)控OC、SMAD1和OPN基因表達(dá)的研究尚少，因此miR-19b的調(diào)控作用仍需進(jìn)一步研究。

有研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2/SMAD信號通路與間質(zhì)細(xì)胞的成骨分化密切相關(guān)，SMAD4是其中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白[19]。SMAD4蛋白可以與磷酸化的SMAD1、SMAD5或SMAD8結(jié)合形成復(fù)合物，增加下游鈣化基因的表達(dá)。HUANG等[20]的研究結(jié)果顯示，SMAD4是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)SMAD4可使間質(zhì)細(xì)胞模型成骨相關(guān)因子RUNX2 mRNA、OC mRNA、SMAD1 mRNA和OPN mRNA相對表達(dá)量明顯升高，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果證實(shí)SMAD4是miR-19b的下游靶基因。JIANG等[21]通過基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測及熒光素酶報(bào)告基因分析，在結(jié)腸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-19b可靶向SMAD4并抑制其表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。這明確了miR-19b與SMAD4的靶向作用，而過表達(dá)miR-19b可抑制SMAD4的表達(dá)。因此，當(dāng)hVIC同時(shí)過表達(dá)miR-19b和SMAD4時(shí)，過表達(dá)miR-19b逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)SMAD4對鈣化模型細(xì)胞內(nèi)成骨相關(guān)因子表達(dá)的上調(diào)。

綜上所述，miR-19b是hVIC鈣化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可通過調(diào)節(jié)SMAD4蛋白的表達(dá)影響主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞鈣化，提示miR-19b和SMAD4有可能成為治療主動(dòng)脈瓣鈣化疾病的潛在靶標(biāo)。