糞便鈣衛(wèi)蛋白在兒童炎癥性腸病中的臨床意義

趙 鶯，徐 錦

（國家兒童醫(yī)學(xué)中心 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院臨床檢驗中心，上海 201102）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一種特殊的慢性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病及一些非特異性的病毒性或細(xì)菌性腸道炎癥[1]。IBD發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，環(huán)境、遺傳、免疫介導(dǎo)和腸道微生物等因素在其發(fā)生、發(fā)展過程中均發(fā)揮著重要作用。目前，兒童IBD的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，臨床多采用消化道內(nèi)鏡結(jié)合組織病理學(xué)檢查來診斷和判斷IBD的活動性和治療效果，患兒依從性差，且過程繁瑣，因而有部分患兒家長拒絕接受這種檢查，導(dǎo)致患兒確診困難[2-4]。因此，臨床亟需無創(chuàng)且敏感的IBD檢測指標(biāo)。鈣衛(wèi)蛋白是一種鈣鋅結(jié)合蛋白，主要來源于中性粒細(xì)胞，具有直接的抗菌作用和先天免疫反應(yīng)的作用，同時也是中性粒細(xì)胞的趨化因子[1，4]。在炎癥反應(yīng)過程中，鈣衛(wèi)蛋白會從破裂死亡的中性粒細(xì)胞中被釋放，并隨糞便排出體外，其在糞便中的含量與轉(zhuǎn)運到腸道的中性粒細(xì)胞數(shù)量成正比[2]。糞便中的鈣衛(wèi)蛋白含量約是血漿中的6倍，且在糞便中分布均勻，不受采樣位置的影響，體內(nèi)、體外均能保持穩(wěn)定，因此糞便鈣衛(wèi)蛋白有成為胃腸道炎癥標(biāo)志物的潛力[5]。本研究旨在探討糞便鈣衛(wèi)蛋白含量在不同類型IBD中的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2020年12月—2021年6月復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院IBD患兒125例（IBD組），其中男78例、女47例，年齡1～15歲，包括克羅恩病發(fā)作期33例、急性腸炎31例、潰瘍性結(jié)腸炎41例、腹型過敏性紫癜20例。另選取同期復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院克羅恩病緩解期患兒19例，其中男14例、女5例，年齡1～15歲?？肆_恩病及潰瘍性結(jié)腸炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《兒童炎癥性腸病診斷和治療專家共識》[6]，腹型過敏性紫癜的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《兒童過敏性紫癜循證診治建議》[7]。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡≤15歲，無除腸道炎癥外的其他急、慢性炎癥，無自身免疫性疾病。以同期復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院健康體檢兒童33名為正常對照組，其中男26名、女7名，年齡1～14歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：體格檢查正常，影像學(xué)檢查及實驗室檢查結(jié)果均正常。2個組之間年齡和性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 方法

收集所有對象的糞便樣本。水樣便用采便器吸管（北京美康基因科學(xué)股份有限公司）吸取50 μL，加入糞便處理液（北京美康基因科學(xué)股份有限公司）中混勻；非液狀糞便用一次性糞便樣本采集器（北京美康基因科學(xué)股份有限公司）定量采集10 mg糞便，將采便器的采便棒插入糞便至刻度線，輕輕旋轉(zhuǎn)采便棒蘸取糞便，然后插入糞便處理液混勻。

采用Q240量子點熒光免疫分析儀（南京美寧康誠生物科技有限公司）及配套試劑（雙抗體夾心法）檢測鈣衛(wèi)蛋白，最低檢測限為30 μg/g，線性范圍為30～1 200 μg/g?；驹恚涸诖姿崂w維素膜的檢測線處包被鼠抗人鈣衛(wèi)蛋白檢測抗體，在質(zhì)控線處包被羊抗鼠IgG多克隆抗體，在熒光墊的固定量子點上標(biāo)記鼠抗人鈣衛(wèi)蛋白捕獲抗體。檢測時，樣本中的鈣衛(wèi)蛋白可與熒光墊量子點上的捕獲抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，并在層析作用下沿膜移動，經(jīng)過檢測線時與檢測抗體發(fā)生結(jié)合而發(fā)光，游離的捕獲抗體在質(zhì)控線處與IgG多克隆抗體發(fā)生結(jié)合而發(fā)光。檢測線處的熒光強(qiáng)度可反映糞便鈣衛(wèi)蛋白含量，通過已擬定的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以由熒光檢測值計算出糞便鈣衛(wèi)蛋白的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。呈非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Wilcoxon檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價糞便鈣衛(wèi)蛋白鑒別克羅恩病發(fā)作期與緩解期的效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IBD組與正常對照組糞便鈣衛(wèi)蛋白含量比較

IBD組糞便鈣衛(wèi)蛋白含量顯著高于正常對照組（P<0.000 1）。不同類型的IBD患兒糞便鈣衛(wèi)蛋白含量均高于正常對照者（P<0.000 1），而不同類型的IBD患兒之間糞便鈣衛(wèi)蛋白含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 IBD組與正常對照組糞便鈣衛(wèi)蛋白含量比較

2.2 克羅恩病發(fā)作期患兒與緩解期患兒糞便鈣衛(wèi)蛋白含量比較

克羅恩病發(fā)作期患兒糞便鈣衛(wèi)蛋白含量為137.40（71.13～455.20）μg/g，顯著高于緩解期患兒[31.44（30.31～44.00）μg/g]（P<0.000 1）。

2.3 糞便鈣衛(wèi)蛋白鑒別克羅恩病發(fā)作期與緩解期的效能

ROC曲線分析結(jié)果顯示，糞便鈣衛(wèi)蛋白鑒別克羅恩病發(fā)作期與緩解期的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.933 8，最佳臨界值為59.91 μg/g，敏感性為89.47%，特異性為82.86%。見圖1。

圖1 糞便鈣衛(wèi)蛋白鑒別克羅恩病發(fā)作期與緩解期的ROC曲線

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，全球兒童IBD的發(fā)病率呈逐漸上升、發(fā)病年齡呈逐漸減小的趨勢[8]。與成人IBD相比，兒童IBD具有更高的疾病活動性，病程也更為復(fù)雜?？肆_恩病和潰瘍性結(jié)腸炎均屬于IBD，都是慢性復(fù)發(fā)性疾病。IBD的典型癥狀為體質(zhì)量減輕、腹痛和血性腹瀉，但在臨床上，許多患兒會出現(xiàn)孤立性生長不良、貧血或其他腸外表現(xiàn)等非典型癥狀，極易漏診[9]。兒童IBD從發(fā)病到診斷的平均時間為11個月，確診周期長，極易導(dǎo)致病情延誤[10]。目前，臨床一般采用消化道內(nèi)鏡聯(lián)合組織病理學(xué)檢查來診斷IBD，其特點是準(zhǔn)確率較高，但屬于有創(chuàng)操作，且存在出血、腸穿孔等風(fēng)險，因此不易被患兒家長接受。IBD常用的輔助診斷指標(biāo)包括紅細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白、血細(xì)胞比容、白細(xì)胞計數(shù)、C反應(yīng)蛋白和紅細(xì)胞沉降率。另外，對懷疑為克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎的患兒還會進(jìn)行抗Cbir1抗體等檢測。但以上這些指標(biāo)都不是IBD的特異性指標(biāo)，均存在特異性或敏感性不足的問題，如自身免疫性疾病會導(dǎo)致紅細(xì)胞沉降率升高，細(xì)菌性感染會導(dǎo)致白細(xì)胞計數(shù)增多。另外，相對于其他輔助檢查指標(biāo)，糞便鈣衛(wèi)蛋白的優(yōu)勢在于無創(chuàng)（無需采血）、樣本獲取簡單，且檢測快速（5 min）、操作簡便。

有研究結(jié)果顯示，IBD患兒病變黏膜中的中性粒細(xì)胞能夠分泌大量的鈣衛(wèi)蛋白，使其血漿濃度明顯升高[11]。本研究結(jié)果顯示，IBD組糞便鈣衛(wèi)蛋白含量顯著高于正常對照組（P<0.000 1），且不同類型的IBD患兒糞便鈣衛(wèi)蛋白含量均高于正常對照者（P<0.000 1），而不同類型的IBD患兒之間糞便鈣衛(wèi)蛋白含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。提示鈣衛(wèi)蛋白與腸道炎癥密切相關(guān)，但無法區(qū)分IBD的類型。本研究結(jié)果還顯示，克羅恩病發(fā)作期患兒糞便鈣衛(wèi)蛋白含量顯著高于緩解期患兒（P<0.000 1），糞便鈣衛(wèi)蛋白鑒別克羅恩病發(fā)作期與緩解期的AUC為0.933 8，敏感性為89.47%，特異性為82.86%。提示糞便鈣衛(wèi)蛋白在鑒別克羅恩病發(fā)作期與緩解期中有重要價值。

鈣衛(wèi)蛋白是一種主要來源于中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的蛋白質(zhì)，在炎癥反應(yīng)中，當(dāng)細(xì)胞破裂或死亡時可被釋放到腸道中，具有較強(qiáng)的抗熱性和抗蛋白酶活性，不會被細(xì)菌和溶菌酶分解，體外留存時間長，穩(wěn)定性強(qiáng)[12-13]，其表達(dá)具有組織或細(xì)胞特異性，可作為急性炎癥細(xì)胞活化的標(biāo)志物[14]。由于靈敏度高，檢測方便，糞便鈣衛(wèi)蛋白可作為臨床常用的腸道炎癥反應(yīng)標(biāo)志物[15]。有炎癥活動的腸黏膜中的鈣衛(wèi)蛋白會脫落下來，進(jìn)入腸腔與腸內(nèi)容物接觸，并最終擴(kuò)散到糞便當(dāng)中[16]。由于糞便中鈣衛(wèi)蛋白的來源主要是腸道黏膜層，其含量與消化道內(nèi)鏡觀察到的炎癥情況相關(guān)，通過檢測糞便樣本中的鈣衛(wèi)蛋白可以明確腸道是否有炎癥發(fā)生[17]。因此，糞便鈣衛(wèi)蛋白或可作為IBD的篩查指標(biāo)，以確認(rèn)是否需要進(jìn)行進(jìn)一步的消化道內(nèi)鏡檢查。

綜上所述，糞便鈣衛(wèi)蛋白可作為IBD的輔助診斷指標(biāo)和克羅恩病發(fā)作期與緩解期的鑒別指標(biāo)。另外，糞便鈣衛(wèi)蛋白或可作為IBD的篩查指標(biāo)，幫助臨床評估是否需進(jìn)行進(jìn)一步的消化道內(nèi)鏡檢查。