線粒體DNA T16189C變異與妊娠糖尿病的關(guān)系

張小勤，周玉蘭，付竹梅，韓學(xué)學(xué)，展 潔

（1.濰坊市婦幼保健院檢驗(yàn)科，山東 濰坊 261011；2.濰坊市婦幼保健院超聲科，山東 濰坊 261011；3.濰坊市婦幼保健院產(chǎn)科，山東 濰坊 261011）

妊娠糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）可大大增加孕婦和胎兒發(fā)生并發(fā)癥及合并癥的風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。部分在懷孕之前無(wú)胰島素抵抗表現(xiàn)的孕婦隨著孕期糖穩(wěn)態(tài)的不斷受壓，會(huì)發(fā)展成GDM[3]。GDM與2型糖尿病有共同的病理生理基礎(chǔ)，且GDM患者未來(lái)發(fā)展為2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)更高[4-5]。在對(duì)胰島素抵抗、肥胖和2型糖尿病的研究過(guò)程中，mtDNA T16189C變異引起了學(xué)者們的關(guān)注。該變異位點(diǎn)接近線粒體復(fù)制起始點(diǎn)，在維持細(xì)胞拷貝數(shù)和線粒體轉(zhuǎn)錄中起重要作用[6]。此外，線粒體單鏈DNA結(jié)合蛋白與mtDNA 16189C的結(jié)合力低于其與mtDNA 16189T的結(jié)合力。有研究結(jié)果顯示，在亞洲人群中，mtDNA T16189C變異的發(fā)生率與2型糖尿病患者空腹胰島素水平升高、胰島素抵抗和β細(xì)胞功能受損有關(guān)[7]。但這種變異是否能影響GDM的發(fā)病尚不清楚。為此，本研究擬探討mtDNA T16189C變異與GDM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年1—10月濰坊市婦幼保健院定期產(chǎn)檢的GDM孕婦204例（GDM組），年齡（32.09±3.51）歲；正常孕婦220例（對(duì)照組），年齡（31.54±4.57）歲。所有孕婦均為單胎妊娠，孕期為24～28周。GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）空腹血糖≥5.1 mmol/L；（2）口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）1 h血糖≥10.0 mmol/L；（3）OGTT 2 h血糖≥8.5 mmol/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）多胎妊娠；（2）孕前有糖尿病史和其他內(nèi)分泌疾病史；（3）肝、腎功能不全；（4）有高血壓史；（5）近期服用過(guò)影響糖代謝的藥物；（6）有其他家族遺傳史。本研究經(jīng)濰坊市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，所有對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般資料 對(duì)所有對(duì)象進(jìn)行體格檢查，并詢問(wèn)病史，收集臨床資料，包括年齡、孕周、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）及空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、OGTT 1 h血糖、OGTT 2 h血糖、糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）、空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）檢測(cè)結(jié)果。計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）：HOMAIR=FINS×FBG/22.5。

1.2.2 mtDNA 16189變異位點(diǎn)檢測(cè) 采用乙二胺四乙酸抗凝管采集所有對(duì)象禁食8～12 h后的空腹靜脈血2 mL，充分混勻后采用血液基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取全基因組DNA，-20 ℃保存。采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）對(duì)mtDNA D-loop區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，檢測(cè)儀器為PTC-200 PCR儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）。擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系：總體積為30 μL，10×Ex Taq buffer 3 μL、dNTP 2 μL、PrimerF 1 μL，PrimerR 1 μL，Ex Taq 0.2 μL，DNA 2 μL，ddH2O 20.8 μL。反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)熱5 min；96 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循環(huán)30次；72 ℃延長(zhǎng)5 min，4 ℃保存。按96孔純化板（德國(guó)Millipore公司）說(shuō)明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。為了避免線粒體D-Loop區(qū)單測(cè)序結(jié)果受影響，保證測(cè)序的準(zhǔn)確性，本研究使用2對(duì)測(cè)序引物進(jìn)行雙重測(cè)序，測(cè)序引物序列見(jiàn)表1。由深圳華大基因測(cè)序公司完成測(cè)序。使用Chromas軟件（北京天演融智軟件有限公司）對(duì)基因序列進(jìn)行分析，并與人mtDNA文庫(kù)記錄的劍橋參考序列（Cambridge reference sequence，CRS）進(jìn)行比對(duì)，分析查找mtDNA 16189變異位點(diǎn)序列。

表1 擴(kuò)增引物和測(cè)序引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)?；蝾l率分布比較采用χ2檢驗(yàn)。基因變異對(duì)GDM的影響采用比值比（odds ratio，OR）和95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GDM組與對(duì)照組一般資料比較

GDM組FBG、OGTT 1 h血糖、OGTT 2 h血糖、HbA1c和FINS均高于對(duì)照組（P<0.05），年齡、孕周和BMI 2個(gè)組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

表2 GDM組與對(duì)照組一般資料比較

2.2 mtDNA T16189C變異與GDM的關(guān)系

GDM組有72例（35.29%）攜帶mtDNA T16189C變異位點(diǎn)，對(duì)照組有57例（25.91%）攜帶該變異位點(diǎn)。GDM組mtDNA T16189C變異頻率高于對(duì)照組（χ2=4.40，P<0.05）。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 mtDNA16189位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果

攜帶mtDNA T16189C變異位點(diǎn)是GDM發(fā)生的危險(xiǎn)因素（OR=1.36，95%CI為1.020～1.823）。

2.3 mtDNA T16189C變異與妊娠期胰島素抵抗的關(guān)系

根據(jù)是否攜帶mtDNA T16189C變異將GDM孕婦分為攜帶組和非攜帶組。攜帶組OGTT 1 h血糖、OGTT 2 h血糖、FINS、HOMA-IR水平高于非攜帶組（P<0.05），F(xiàn)BG、HbA1c2個(gè)組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3。

表3 mtDNA T16189C變異攜帶組與非攜帶組各項(xiàng)指標(biāo)比較

3 討論

雖然多數(shù)GDM孕婦產(chǎn)后糖代謝可恢復(fù)正常，但其未來(lái)患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)是正常孕婦的7倍[4]。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為胰島素抵抗是GDM的病理生理基礎(chǔ)，貫穿著GDM發(fā)生、發(fā)展的全過(guò)程[7]。由于線粒體在能量產(chǎn)生和自由基生成中起關(guān)鍵作用，所以線粒體基因組可能對(duì)多種能量代謝相關(guān)疾病的產(chǎn)生和發(fā)展有重要影響[8]。1998年，POULTON等[9]提出mtDNA T16189C變異與胰島素抵抗有關(guān)。隨后的研究結(jié)果顯示，mtDNA T16189C位點(diǎn)變異與胰島素抵抗、BMI、代謝綜合征和心血管疾病有關(guān)[10]。因此，為進(jìn)一步了解mtDNA T16189C變異是否與GDM有關(guān)，本研究對(duì)GDM孕婦的mtDNA T16189C變異情況進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，GDM組mtDNA T16189C變異頻率高于對(duì)照組（P<0.05），攜帶mtDNA T16189C變異是GDM發(fā)生的危險(xiǎn)因素（OR=1.36，95%CI為1.020～1.823）。

妊娠期出現(xiàn)胰島素抵抗是屬于妊娠期的生理代謝變化。本研究結(jié)果顯示，GDM組FINS顯著高于對(duì)照組（P<0.05），提示GDM孕婦與正常孕婦相比存在更嚴(yán)重的胰島素抵抗。另外，mtDNA T16189C變異攜帶組FINS、HOMAIR水平均高于非攜帶組（P<0.05），說(shuō)明攜帶mtDNA T16189C變異的GDM孕婦的胰島素抵抗情況更嚴(yán)重。但關(guān)于mtDNAT16189C變異在GDM發(fā)生中的具體作用尚需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，GDM孕婦mtDNA T16189C變異頻率顯著升高，該位點(diǎn)變異是GDM發(fā)生的危險(xiǎn)因素，攜帶mtDNA T16189C變異的GDM孕婦的胰島素抵抗更嚴(yán)重。雖然mtDNA T16189C變異的致病機(jī)制尚不明確，但其作為GDM發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)基因，攜帶該變異位點(diǎn)的孕婦需加強(qiáng)妊娠期管理，嚴(yán)格控制血糖和體質(zhì)量，預(yù)防GDM的發(fā)生。