lncRNA LINC00528通過調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

江帆 劉寧 翟鑫 管頻 董霄

糖尿病性心肌病是由糖尿病患者引起的一種并發(fā)癥，且能夠引發(fā)心力衰竭、心律失常和休克，嚴(yán)重時可導(dǎo)致猝死，也是糖尿病患者死亡率較高的原因之一[1,2]。糖尿病性心肌病的發(fā)病機(jī)制受多種因素的制約和影響，心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)糖尿病性心肌病的主要因素[3,4]。因此，尋找糖尿病性心肌病的治療和診斷具有重要作用。長鏈非編碼RNA是一類超過200個核苷酸的非編碼RNA，不能夠參與編碼蛋白的合成，與心血管性疾病的發(fā)展密切相關(guān)[5]。Liu等[6]研究結(jié)果顯示，LINC00528在心肌梗死模型細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，LINC00528通過調(diào)控miR-143-3p/COX-2軸抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但是對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的研究機(jī)制尚不明確。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/血紅素加氧酶1(HO-1)信號通路是細(xì)胞氧化應(yīng)激的經(jīng)典通路[7]，有研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素能夠通過激活A(yù)MPK/Nrf2/HO-1信號通路減緩糖尿病小鼠的心肌細(xì)胞的凋亡、炎性反應(yīng)和氧化損傷[8]。本研究通過高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，探討LINC00528是否能夠通過調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路影響高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 H9C2心肌細(xì)胞購買于南京凱基生物；胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基購買于美國Gibco公司；葡萄糖購買于美國Sigma公司；si-NC、si-LINC00528、pcDNA、Nrf2和引物購買于上海吉瑪公司；Lipofectamine 2000試劑盒購買于美國Invitrogen公司；Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購買于北京于天根生化公司；MTT試劑盒、凋亡試劑盒購買于上海碧云天生物；Bcl-2抗體、Bax抗體、Nrf2抗體、HO-1抗體、NQO1抗體和GAPDH抗體購買于美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購買于北京中杉金橋公司；MDA試劑盒和SOD試劑盒購買于南京建成生物。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 取出冷凍的H9C2心肌細(xì)胞快速解凍后，在含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基內(nèi)孵育，置于37℃、5% CO2密閉恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。H9C2心肌細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。收集2～3代較為穩(wěn)定的H9C2心肌細(xì)接種至96孔板內(nèi)(1×105個/ml)，將細(xì)胞分組，分比為：Con組：細(xì)胞正常培養(yǎng)，加入5.5 mmol/L葡萄糖處理細(xì)胞；HG組：加入30 mmol/L葡萄糖處理細(xì)胞，HG+si-NC組：轉(zhuǎn)染si-NC后進(jìn)行高糖處理細(xì)胞；HG+si-LINC00528組：轉(zhuǎn)染si-LINC00528后進(jìn)行高糖處理細(xì)胞；HG+si-LINC0052+pcDNA組：共轉(zhuǎn)染si-LINC0052和pcDNA后進(jìn)行高糖處理細(xì)胞；HG+si-LINC00528+Nrf2組：共轉(zhuǎn)染si-LINC00528和Nrf2后進(jìn)行高糖處理細(xì)胞。細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染時按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 qRT-PCR檢測LINC00528的表達(dá) 收集Con組、HG組、HG+si-NC組、HG+si-LINC00528組的H9C2心肌細(xì)，按照Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA后，在紫外分光度計進(jìn)行檢測定量RNA濃度和純度。將RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA模板，在熒光定量PCR試劑盒說明書下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。LINC00528正向引物為：5’-AGCGTCCTTGAGGAGTCCAGTTC-3’，反向引物為：5’-CAAGCACAGTCACGTTCTGAGGTC-3’；GAPDH正向引物為：5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3’，反向引物為：5’-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3’。以GAPDH作為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法計算LINC00528的表達(dá)。

1.4 MTT檢測細(xì)胞活力 收集H9C2心肌細(xì)胞，取100 μl細(xì)胞懸液鋪在96孔板內(nèi)，密度為1×103個/孔，在密閉恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，在每孔加入20 μl的MTT試劑，然后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，并加入150 μl的DMSO試劑，帶結(jié)晶充分溶解后，在酶標(biāo)儀490 nm處檢測細(xì)胞吸光度，計算細(xì)胞活力。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組H9C2心肌細(xì)胞，48 h加入預(yù)冷的緩沖液清洗2次，加入binding buffer用于制備細(xì)胞懸液，取100 μl的細(xì)胞懸液、及5 μl Annexin V-FITC和PI試劑混勻，然后在暗處室溫下反應(yīng)15 min，置于流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞的凋亡率。

1.6 Western blot檢測Bcl-2、Bax和Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集各組H9C2心肌細(xì)胞，加入RIPA裂解液后提取各組細(xì)胞的總蛋白，檢測定量各組總蛋白濃度和純度。在每孔上樣至SDS-PAGE凝膠孔內(nèi)處理分離，迅速轉(zhuǎn)移在PVDF膜上，并封閉培養(yǎng)2 h，加入Bcl-2、Bax、Nrf2、HO-1、NQO1和GAPDH稀釋的抗體，4℃過夜孵育，加入稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育2 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑，在暗處進(jìn)行曝光，在凝膠成像系統(tǒng)下掃描蛋白條帶，以GAPDH為內(nèi)參，計算分析目的蛋白的表達(dá)。

1.7 ELISA檢測MDA含量和SOD活性 收集各組H9C2心肌細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min后收集細(xì)上清液，取200 μl按照MDA試劑盒和SOD試劑盒說明書步驟，檢測各組細(xì)胞中MDA含量和SOD活性。

2 結(jié)果

2.1 LINC00528在高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示，與Con組比較，HG組中LINC00528表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 LINC00528在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的表達(dá)

2.2 抑制LINC00528對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力和凋亡的影響 與Con組比較，HG組LINC00528表達(dá)、細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，細(xì)胞活力、Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與HG+si-NC組比較，HG+si-LINC00528組LINC00528表達(dá)、細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，細(xì)胞活力、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 抑制LINC00528對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力和凋亡的影響；A 細(xì)胞凋亡率；B 凋亡相關(guān)蛋白

表2 抑制LINC00528對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力和凋亡的影響

2.3 抑制LINC00528對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與Con組比較，HG組的MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)；HG+si-NC組比較，HG+si-LINC00528組MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 抑制LINC00528對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

2.4 LINC00528通過調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路蛋白的表達(dá) 與Con組比較，HG組的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與HG+si-NC組比較，HG+si-LINC00528組的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖2，表4。

表4 LINC00528通過調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路蛋白的表達(dá)

圖2 LINC00528通過調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路蛋白的表達(dá)

2.5 LINC00528通過調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力、凋亡和氧化應(yīng)激的影響 與HG+si-LINC0052+pcDNA組比較，HG+si-LINC00528+Nrf2組的Nrf2蛋白表達(dá)、細(xì)胞活力、Bcl-2蛋白表達(dá)和SOD活性顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)和MDA含量顯著降低(P<0.05)。見表5，圖3。

表5 LINC00528通過調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞活力、凋亡和氧化應(yīng)激的影響

圖3 LINC00528通過調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響；A 細(xì)胞凋亡率；B 凋亡相關(guān)蛋白

3 討論

糖尿病性心肌病是糖尿病并發(fā)癥之一，近年糖尿病患者發(fā)病率呈上升趨勢，其中關(guān)于心血管并發(fā)癥最為嚴(yán)重[9]。長期在高糖環(huán)境下能夠引起心肌細(xì)胞的凋亡、纖維化，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷引起心肌細(xì)胞紊亂、心力衰竭等[10]。因此，本研究結(jié)果顯示，高糖能夠抑制細(xì)胞活力、SOD活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡率、MDA含量，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，表明高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型成功。lncRNA在糖尿病性心肌病內(nèi)異常表達(dá)，與高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激密切相關(guān)，參與糖尿病性心肌病的發(fā)展[11,12]。Yang等[13]研究顯示，KCNQ1OT1在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞和糖尿病小鼠心臟組織中表達(dá)上調(diào)，沉默KCNQ1OT1能夠減緩高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。Wu等[14]研究顯示，MALAT1在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，MALAT1通過靶向miR-141-3p促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。陳婉斐等[15]研究顯示，LUCAT1在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，利用siRNA技術(shù)，發(fā)現(xiàn)抑制LUCAT1通過調(diào)控miR-204-3p能夠減緩高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激。HAGLROS在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，抑制HAGLROS通過上調(diào)miR-20a-5p并激活PI3K/AKT信號通路減緩高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞后LINC00528表達(dá)上調(diào)，抑制LINC00528可以降低LINC00528表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、MDA含量，促進(jìn)細(xì)胞活力、SOD活性，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，說明抑制LINC00528能夠減緩高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

Nrf2/HO-1信號通路是較為重要的內(nèi)源性氧化應(yīng)激通路，與細(xì)胞的抗氧化、抗炎和細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)[17]。Nrf2是抗氧化反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，可以與keap1形成復(fù)合物，當(dāng)體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激時，能夠與抗氧化反應(yīng)原件相結(jié)合，進(jìn)而啟動下游HO-1、NQO1等抗氧化基因的表達(dá)，發(fā)揮其在機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[18,19]。侯劍飛等[20,21]研究顯示，紅芪多糖通過激活ERK/Nrf2/HO-1信號通路減緩大鼠心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。賈強(qiáng)等[22]研究顯示，金雀異黃酮通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號通路減緩糖尿病大鼠的心肌細(xì)胞氧化損傷。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞后Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)下調(diào)，抑制LINC00528可以上調(diào)Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)；說明LINC00528能夠調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路的表達(dá)。在心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)Nrf2，結(jié)果顯示，細(xì)胞活力、SOD活性受到促進(jìn)，并抑制細(xì)胞凋亡率、MDA含量，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，說明LINC00528通過激活Nrf2/HO-1信號通路減緩高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的損傷。

綜上所述，LINC00528在高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，抑制LINC00528能夠減緩高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷，其作用機(jī)制可能與Nrf2/HO-1信號通路有關(guān)。