抗栓膠囊中9 種重金屬有害元素的含量測(cè)定及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估*

薛 平，陳雨蕉，胡金云，李 莉

常州市食品藥品纖維質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，常州213000

抗栓膠囊具有活血化瘀、抗栓通脈之功效；多用于血栓閉塞性脈管炎瘀血阻絡(luò)證。其由當(dāng)歸尾、水蛭、土鱉蟲(chóng)、丹參、烏梢蛇、麝香、馬錢(qián)子、骨碎補(bǔ)、僵蠶、蜈蚣、延胡索、蟾酥等19 味藥材制成，對(duì)腦血栓、心肌梗塞、血栓性靜脈炎等有較好的輔助治療效果[1]。

目前抗栓膠囊質(zhì)量控制研究主要集中于丹參酮ⅡA等成分的含量測(cè)定，針對(duì)土鱉蟲(chóng)進(jìn)行的黃曲霉毒素限量安全控制，其他方面的質(zhì)量控制研究較少[2]。目前中藥外源性有害物質(zhì)的安全性監(jiān)控是中藥質(zhì)量控制重點(diǎn)之一，外源性有害物質(zhì)主要包括重金屬及有害元素、農(nóng)藥殘留和真菌毒素等[3]。作為生粉直接入藥的抗栓膠囊，可能存在一定程度的重金屬及有害元素安全風(fēng)險(xiǎn)。本研究采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定抗栓膠囊中9 種重金屬有害元素V、Cr、Co、Ni、Cu、As、Cd、Hg、Pb 的含量[3，4]，考察不同生產(chǎn)企業(yè)的抗栓膠囊中重金屬有害元素概況，為該藥的質(zhì)量控制和安全性評(píng)價(jià)提供參考。

1 材 料

1.1 儀器

電感耦合等離子質(zhì)譜儀（ICP Q，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）；微波消解儀（CEM mars 5 express 美國(guó)培安有限公司）；XP105DU 萬(wàn)分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥與樣品

9 種單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液：釩（V，批號(hào)20041435）、鈷（Co，批號(hào)20041435），鎳（Ni，批號(hào)20041435）、砷（As，批號(hào)20050635）、鎘（Cd，批 號(hào)20050635）、汞（Hg，批號(hào)20050635）、鉛（Pb，批號(hào)20050635），濃度均為100 μg·mL-1，銅（Cu，批號(hào)20082535，濃度1000 μg·mL-1），均購(gòu)自于鋼研納克檢測(cè)技術(shù)股份公司；鉻（Cr，批號(hào)B2006161，濃度為100 μg·mL-1）購(gòu)自于壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

內(nèi)標(biāo)元素：鈧（Sc，批號(hào)19090235，濃度100 μg·mL-1），鍺（Ge，批號(hào)20092745，濃度1000 μg·mL-1），銦（In，批號(hào)19092985，濃度100 μg·mL-1），鉍（Bi，批號(hào)20032635，濃度100 μg·mL-1）均購(gòu)于鋼研納克檢測(cè)技術(shù)股份公司。

金單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（Au，批號(hào)20071635，濃度100 μg·mL-1）購(gòu)自于鋼研納克檢測(cè)技術(shù)股份公司；65%硝酸為優(yōu)級(jí)純；水為去離子水。

抗栓膠囊樣品涵蓋全國(guó)20 個(gè)省級(jí)行政區(qū)，共涉及9 家生產(chǎn)企業(yè)（編號(hào)A-I），共29 批次樣品。

2 方法[5，6]

2.1 ICP-MS 儀器測(cè)定方法

射頻功率：1550 W；蠕動(dòng)泵：40 r·min-1；冷卻氣流量：14 L·min-1；載氣補(bǔ)償氣流速：0.8 L·min-1；霧化氣流量：0.9021 L·min-1；霧化室溫度：2.7 ℃；碰撞氣體：氦；碰撞氣流速：4.98 mL·min-1；采樣深度：5.00 mm；延遲時(shí)間30 s；積分時(shí)間5.8 s，掃描次數(shù)：15 次。

測(cè)定時(shí)選取的同位素為51V、52Cr、60Ni、63Cu、75As、114Cd、202Hg、208Pb，其中51V、52Cr 以45Sc 作為內(nèi)標(biāo)，60Ni、63Cu、75As 以72Ge 作為內(nèi)標(biāo)，114Cd 以115In 作為內(nèi)標(biāo)，202Hg、208Pb 以209Bi 作為內(nèi)標(biāo)，通過(guò)蠕動(dòng)泵在線加入內(nèi)標(biāo)溶液，測(cè)定時(shí)儀器的內(nèi)標(biāo)管始終插入內(nèi)標(biāo)溶液中，樣品管按要求放入相應(yīng)的溶液中進(jìn)行測(cè)定，取3 次讀數(shù)的平均值計(jì)算。在儀器的數(shù)據(jù)分析軟件中，將內(nèi)標(biāo)法設(shè)置為在線內(nèi)標(biāo)實(shí)時(shí)校正，即數(shù)據(jù)采集點(diǎn)的信號(hào)以實(shí)時(shí)內(nèi)標(biāo)點(diǎn)的信號(hào)進(jìn)行校正。各個(gè)元素以內(nèi)標(biāo)校正的信號(hào)值（cps）為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的質(zhì)量濃度（ng·mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按儀器數(shù)據(jù)分析軟件的要求，設(shè)置相關(guān)參數(shù)，得到各元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線、供試品溶液中各元素的濃度。根據(jù)各元素的濃度值計(jì)算樣品中待測(cè)元素的含量。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對(duì)照品貯備液 分別精密量取V、Cr、Co、Ni、Cu、As、Cd、Hg、Pb 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋制成每1 mL 分別含V、Cr、Ni、Co均為5 μg 的溶液；每1 mL 分別含Cu、As、Cd、Hg、Pb 為100、100、1、1、100 μg 的溶液，即得。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 分別精密吸取Sc、In、Bi 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋制成每1 mL 含Sc、In、Bi 各50 ng，含Ge 100 ng 的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.3 供試品溶液 取抗栓膠囊樣品內(nèi)容物約0.3g，精密稱定，置于耐壓耐高溫微波消解罐中，加硝酸5mL，放置過(guò)夜，密閉、消解。消解程序?yàn)樵?～5min，由初始溫度升溫到120 ℃，維持2 min；在7～13 min，由120 ℃升溫到160 ℃，維持3 min；在16～20 min，由160 ℃升溫到180 ℃，維持25 min。消解完全后，消解液冷卻至60 ℃以下，取出，放冷，將消解液轉(zhuǎn)入50 mL 聚四氟乙烯量瓶中，用少量水洗滌消解罐3次，洗液合并于聚四氟乙烯量瓶中，加入金單元素溶液（1 μg·mL-1）200 μL，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。除不加樣品內(nèi)容物外，同法制備空白溶液，在同樣的分析條件下進(jìn)行空白試驗(yàn)。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對(duì)照品貯備液適量，用2%硝酸溶液稀釋制成每1 mL 含V、Co、Cr、Ni 為0、0.1、1、2.5、10、20、50 ng，含Cd、Hg 為0、0.02、0.2、0.5、2、4、10 ng，含As 為0、0.6、6、15、60、120、300 ng，含Cu 為0、1、10、25、100、200、500 ng，含Pb 為0、1、10、25、100、200、500、1000 ng的系列濃度混合對(duì)照溶液。

按“2.1”項(xiàng)下的測(cè)定條件，依次將儀器的樣品管插入各個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液中進(jìn)行測(cè)定（濃度依次遞增），各個(gè)元素以內(nèi)標(biāo)校正的信號(hào)值（cps）為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的質(zhì)量濃度（ng·mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制各元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程與線性范圍見(jiàn)表1。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取線性關(guān)系中標(biāo)準(zhǔn)曲線第5個(gè)濃度點(diǎn)的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下檢測(cè)條件測(cè)定，測(cè)得溶液中各元素的濃度，重復(fù)測(cè)定6 次。根據(jù)測(cè)得的濃度值計(jì)算8 種元素的RSD 值，均＜5%，表明儀器精密度良好，見(jiàn)表1。

表1 9 種元素的線性、精密度、重復(fù)性和檢測(cè)限（表中元素分類來(lái)源于ICH Q3D）

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品0.3 g（編號(hào)A），按上述“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份并分析，測(cè)得供試品溶液中各元素的濃度，計(jì)算得到各元素的含量。根據(jù)各元素的含量計(jì)算RSD，8 種元素的RSD 值均＜6%，表明本方法重復(fù)性良好，見(jiàn)表1。

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批次樣品（編號(hào)A）0.3 g，精密稱取，置于聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.1 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，平行制備6 份，按“2.1”項(xiàng)下檢測(cè)條件測(cè)定供試品溶液中各元素的濃度，計(jì)算各元素的含量，扣除樣品（編號(hào)A）中元素本底的含量，分別計(jì)算各元素的回收率、平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%），結(jié)果見(jiàn)表2。表明本試驗(yàn)準(zhǔn)確度良好。

3 結(jié)果

3.1 樣品測(cè)定結(jié)果

取9 企業(yè)的抗栓膠囊，按“2.2.3”的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下檢測(cè)條件測(cè)得供試品溶液中各元素濃度，分別計(jì)算樣品中各元素含量。見(jiàn)表3。

表3 29 批樣品中元素的含量測(cè)定結(jié)果（n=2，mg·kg-1）

3.2 測(cè)定結(jié)果分析

3.2.1 指紋圖譜直觀分析 為直觀地反映測(cè)定結(jié)果，繪制了抗栓膠囊有害元素的指紋圖譜[7]。將測(cè)定的元素按原子序號(hào)排列作為橫坐標(biāo)，29 批樣品的測(cè)定結(jié)果為縱坐標(biāo)，繪制有害元素含量分布曲線。由指紋圖譜顯示（見(jiàn)圖1），樣品中有害元素含量存在一定程度的波浪式分布，其中V、Cr、Co、Ni、Cu、Cd、Hg含量相對(duì)較低，不同樣品間As 和Pb 的量存在顯著差異，其余大部分元素量的多寡順序幾乎趨于一致。

圖1 抗栓膠囊有害元素指紋圖譜

3.2.2 熱圖直觀分析 熱圖已廣泛應(yīng)用于數(shù)據(jù)分析，能清晰表現(xiàn)數(shù)據(jù)的疏密、頻數(shù)高低和差異變化，從而彌補(bǔ)上述元素指紋圖譜分析的不足之處[8]。利用Image GP 網(wǎng)頁(yè)制圖工具將29 批樣品的測(cè)定結(jié)果繪制成熱圖（見(jiàn)圖2）。各元素的含量和每個(gè)元素含量的平均值相比，用藍(lán)色向紅色表示，越紅差異程度越大。圖2 結(jié)果表明，29 批樣品中Pb、Cr、Hg、As 4 種元素的含量存在顯著差異性。其中樣品中Pb 差異最為顯著，顏色呈階梯式變化。Pb 含量的高低對(duì)應(yīng)顏色的變化過(guò)程大致可分為4 個(gè)梯度（由低到高）：第一梯度（H＜F2＜F1＜D＜E2＜A＜E1）呈深藍(lán)逐漸變?yōu)樗{(lán)色；第二梯度（B4＜B10＜B2＜B5＜I2＜B11＜I3＜G3＜B6）由藍(lán)色逐漸變?yōu)榫G色；第三梯度（C4＜C1＜B3＜B8＜I1）由綠色逐漸變?yōu)辄S色；第四梯度（G1＜G2＜B7＜C3＜C5＜C2＜B9＜B1）由黃色逐漸變?yōu)榧t色。熱圖中各元素的顏色差異清晰表現(xiàn)了樣品間含量的差異，同時(shí)熱圖中左邊企業(yè)聚類分析和上面9 種元素之間的聚類分析的情況表明，在29 批樣品中，9 種有害元素含量之間無(wú)直接明顯的相關(guān)性，不同企業(yè)、同一企業(yè)不同批次間未出現(xiàn)明顯的聚類現(xiàn)象。

圖2 9 種有害元素含量的熱圖

4 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

4.1 鉛、鎘、砷、汞、銅的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[9，10]

“中藥中外源性有害殘留物安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)指導(dǎo)原則”和《中國(guó)藥典》2020 年版四部9302“中藥有害殘留物限量制定指導(dǎo)原則”描述了重金屬及有害元素最大限量理論值的計(jì)算方法，該值的計(jì)算依據(jù)源自于危害指數(shù)法評(píng)估中藥中重金屬的暴露量。目前該方法常被應(yīng)用在Pb、Cd、As、Hg、Cu 5 種元素的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，其他有害元素由于缺乏公認(rèn)的健康指導(dǎo)值（A），使用頻率較低。

依據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版中相關(guān)規(guī)定，計(jì)算得出該制劑中鉛、鎘、砷、汞、銅的最大限量理論值。

公式1 中L 為最大限量理論值（mg·kg-1）；A 為每日允許攝入量（μg·kg-1·bw），Pb 為1.3 μg·kg-1，Cd 為0.83 μg·kg-1，As 為3.0 μg·kg-1，Hg 為0.57 μg·kg-1，Cu 為500 μg·kg-1；W為人體平均體重（kg），按63 kg 計(jì)；M 為每日人均可服用的最大劑量（kg），抗栓膠囊每日服用量為15～24 粒，每粒約0.3 g，每日最大服用量約為7.2 g（0.007 2 kg）；AT 為平均壽命天數(shù)，一般為365 天/年×70 年；EF 為中藥服用頻率（天/年），EF 為每年90 d；ED 為一生的服用中藥的暴露年限，Ed為20 年；t 為中藥經(jīng)煎煮或提取后，重金屬元素的轉(zhuǎn)移率（%），中成藥t 為100%；10 為安全因子，表示每日由中藥材及其制品中攝取的重金屬量不大于日總暴露量（包括食物和飲用水）的10%。

Pb、Cd、As、Hg、Cu 的最大限量理論值（mg·kg-1）分別為16.1、10.3、37.3、7.1、6210。

通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，29 批抗栓膠囊中有19 批Pb 的含量超出最大理論限量值，2 批As 的含量超出最大理論限量值。另外3 種元素的含量均低于各自的最大理論限量值。

由計(jì)算結(jié)果警示抗栓膠囊中Pb、As 含量可能存在一定程度的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)對(duì)相關(guān)元素進(jìn)一步明確風(fēng)險(xiǎn)來(lái)源，探究該品種的健康風(fēng)險(xiǎn)程度。

4.2 釩、鉻、鈷、鎳的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[4]

ICH Q3D 中對(duì)元素健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，規(guī)范嚴(yán)謹(jǐn)，通常將30% PDE 值的定義為控制閾值，具有較好的參考作用。ICH Q3D 中V、Cr、Co、Ni 的每日允許暴露量（PDE，μg·d-1）分別為180、19800、90、5400；抗栓膠囊每日最大服用量約為7.2 g。為方便統(tǒng)計(jì)，將30% PDE 值按每日最大服用量折算到相應(yīng)元素的含量（控制閾值含量）。V、Cr、Co、Ni 的控制閾值含量（mg·kg-1）分別為4.2、458.3、2.1、8.3。

在29 批次樣品中，僅有一批次樣品中V 含量（6.072 mg·kg-1）超過(guò)4.2 mg·kg-1，其余3 種元素含量均低于控制閾值含量。ICH Q3D 計(jì)算模型嚴(yán)格程度極高，常用于化學(xué)藥，未充分考慮中國(guó)人生活、用藥和中成藥的實(shí)際情況，對(duì)中藥的評(píng)估往往過(guò)于嚴(yán)格。綜合考慮，相對(duì)而言，V 含量過(guò)高導(dǎo)致的健康風(fēng)險(xiǎn)概率仍然較低。本試驗(yàn)結(jié)果表明，抗栓膠囊中V、Cr、Co、Ni 等4 種有害元素含量的健康風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低。

5 討論

《中國(guó)藥典》2020 年版關(guān)于重金屬有害元素質(zhì)量控制主要考察Cr、Cu、As、Cd、Hg、Pb；ICH Q3D 一般要求口服制劑考察1 類對(duì)人體有害元素和2 類給藥途徑依賴型的人體有害元素（根據(jù)出現(xiàn)的概率分為2A 和2B 亞類），其中2B 亞類出現(xiàn)概率較低。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，綜合考慮，選取藥典、ICH Q3D 1 類和2A 亞類所有涉及的9 種重金屬有害元素。

預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，取10 ?？顾z囊內(nèi)容物混勻，稱取內(nèi)容物適量，測(cè)定有害元素含量，可能導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果重復(fù)性較差?？紤]到本品處方量大，重金屬及有害元素屬于痕量檢測(cè)，可能會(huì)出現(xiàn)不均勻的情況。合理取樣對(duì)痕量檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)比了取同一批本品內(nèi)容物10、25、50、80 g，發(fā)現(xiàn)取樣50 g 與80 g 試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性良好。故正式測(cè)定時(shí)以四分法取樣，每份內(nèi)容物取樣量不＜50 g。

6 小 結(jié)

重金屬及有害元素是中藥外源性有害物質(zhì)量控制的重點(diǎn)之一。以風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型科學(xué)識(shí)別風(fēng)險(xiǎn)是目前進(jìn)行中藥質(zhì)量健康評(píng)價(jià)的主要方法。本研究考察了29 批抗栓膠囊中9 種重金屬有害元素大致概況，發(fā)現(xiàn)樣品中Pb 含量差異顯著，部分樣品Pb 含量較高，As 有2 批含量異常，這提示可能與企業(yè)所用原料有關(guān)，也可能與生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)過(guò)程中清場(chǎng)不徹底造成了交叉污染有關(guān)。對(duì)抗栓膠囊鉛、砷含量較高的真正原因，有待進(jìn)一步研究，以保證用藥安全。