克白合劑HPLC 指紋圖譜及有害殘留物檢測*

童菊華，黃巧玲，王 迅，吳經(jīng)耀，徐 強

1 浙江省中藥研究所有限公司，杭州 310023;2 杭州市第三人民醫(yī)院 藥劑科，杭州310009

克白合劑是杭州市第三人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，為臨床治療白癜風多年的經(jīng)驗方，由補骨脂、菟絲子、白芷等組成，對于氣滯血瘀、肝腎陰虛型白癜風具有確切的療效[1]。目前該制劑的執(zhí)行標準為《浙江省醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范（2005 年版）》，包括性狀、何首烏與枸杞子薄層鑒別、相對密度、pH 值、合劑項下等常規(guī)的定性檢驗項目，缺少定量控制指標以及制劑整體質(zhì)量的一致性評價技術(shù)。

克白合劑為16 味中藥組成的大復(fù)方，所含的化學成分十分復(fù)雜，僅用指標成分的含量測定控制其質(zhì)量，難以評價制劑生產(chǎn)過程中的整體質(zhì)量情況[2]。而中藥指紋圖譜技術(shù)是評價中藥優(yōu)劣、鑒別真?zhèn)魏痛_保其一致性和穩(wěn)定性的有效方法。

現(xiàn)代分析技術(shù)的飛速發(fā)展，中藥指紋圖譜技術(shù)在研究中藥有效成分、控制中藥質(zhì)量以及鑒別方面也越來越成熟，可促進中藥走向現(xiàn)代化[3]。因此，在增加了補骨脂素與異補骨脂素含量測定指標的基礎(chǔ)上[4，5]進一步對克白合劑指紋圖譜進行了研究，并對其外源性有害物質(zhì)進行了控制研究[6，7]，為復(fù)方制劑的全面質(zhì)量控制探索一條可行之路，為其臨床用藥的安全性與有效性提供質(zhì)量保障。

1 儀器與藥品、試劑

Agilent 1100 高效液相色譜系統(tǒng)，Agilent 6980N 氣相色譜儀（均美國安捷倫公司）；Mars 6 微波消解儀（美國CEM 公司）；AA-7000 原子吸收分光光度計（日本島津公司）；高壓蒸汽滅菌器（上海施都凱公司）；生化培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱（均上海精宏實驗設(shè)備公司）；ME204-E 電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；KQ-500VDE 型三頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（海亞榮生化儀器廠）。

補骨脂素對照品、異補骨脂素對照品（補骨脂素批號：110739-201617，純度，99.7%；異補骨脂素批號：110738-201715，純度，99.5%；均中國食品藥品檢定研究院）；金絲桃苷對照品（批號111521-201708，純度95.1%），特女貞苷對照品（批號11926-201605，純度93.3%），均中國食品藥品檢定院。

甲醇、乙腈為色譜純；甲醇為分析純，其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 克白合劑對照指紋圖譜方法的建立

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：ZORBAX SB C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm，Agilent Technologies）；流動相：乙腈為流動相A，0.2%磷酸溶液（v∶v）為流動相B，按表1 進行梯度洗脫；柱溫：30 ℃；檢測波長：246 nm；流速：1 mL·min-1。

理論板數(shù)按補骨脂素峰計算應(yīng)不低于3000；補骨脂素峰和異補骨脂素峰分離度均應(yīng)＞1.5。

2.1.2 對照品溶液配制 取補骨脂素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含0.15 mg 的溶液，即得。

另取異補骨脂素對照品、金絲桃苷對照品、特女貞苷對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每毫升各含金絲桃苷0.2 mg、特女貞苷0.25 mg、異補骨脂素0.1 mg 的溶液，即得，用于指紋圖譜中各色譜峰化學成分的確認。

2.1.3 供試品溶液制備 精密量取克白合劑10 mL，加入流動相稀釋，定容至25 mL 量瓶中，搖勻，離心，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 專屬性試驗 按照“2.1.1”項下的色譜條件，精密吸取混合對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，得到相應(yīng)的色譜圖。

區(qū)間左線施工完成后，左側(cè)0#承臺的1號、2號角點X向位移最大約為0.82 mm，3號、4號角點X向位移最大約為0.78 mm。右側(cè)1#承臺的1號、2號角點X向位移最大約為0.54 mm，3號、4號角點X向位移最大約為0.50 mm。

供試品指紋圖譜中，在與對照品色譜圖相對應(yīng)的保留時間處有色譜峰出現(xiàn)。見圖1、圖2。

圖1 混合對照品高效液相色譜圖

圖2 克白合劑供試品溶液指紋圖譜（批號180627）

2.1.5 指紋圖譜相似度評價方法 將色譜圖數(shù)據(jù)以AIA（即*.cdf）的格式文件導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2.0 版進行評價，以S1 為參照圖譜（批號180627），采用中位數(shù)法，時間窗寬度為0.1，進行全譜峰匹配，系統(tǒng)根據(jù)10 批次樣品色譜圖的共有模式生成克白合劑對照指紋圖譜R，計算指紋圖譜的相似度。

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度試驗 取克白合劑樣品適量（批號180627），按照“2.1.3”項下的方法制備供試品溶液，重復(fù)進樣6 次。以18 號色譜峰為參照，經(jīng)計算得到各共有峰的相對保留時間的RSD 均＜0.32%，各相對峰面積的RSD 均＜2.78%，表明儀器精密度良好。

2.2.2 重復(fù)性試驗 取克白合劑樣品適量（批號180627），按照“2.1.3”項下的方法，平行制備6 份供試品溶液，分別進樣測定。以18 號色譜峰為參照，經(jīng)計算得到各共有峰的相對保留時間的RSD 均＜0.37%，各相對峰面積的RSD 均＜2.84%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液適量（批號180627），室溫放置，分別于0、3、6、9、12、24 h 進樣。以18 號色譜峰為參照，經(jīng)計算得到各共有峰的相對保留時間的RSD 均＜1.12%，各相對峰面積的RSD均＜2.91%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 指紋圖譜檢測及共有峰歸屬

將10 批克白合劑樣品按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1.5”項下相似度評價方法，生成對照指紋圖譜R，見圖3，計算相似度。各批次樣品的指紋圖譜全譜圖與對照圖譜R 相比，相似度結(jié)果見表2。結(jié)果10 批克白合劑的指紋圖譜相似度均＞0.9，整體相似性較好，說明克白合劑的制備工藝穩(wěn)定，整體質(zhì)量差異不大。

圖3 克白合劑對照指紋圖譜

根據(jù)共有峰的歸屬，在不同批次的克白合劑指紋圖譜中，女貞子、丹參、補骨脂、白芷、黃芪、獨活對共有峰的貢獻較大；蜈蚣、地黃、刺蒺藜、黨參、枸杞子及地龍的特征峰未能體現(xiàn)，可能與合劑中水溶性成分較多，而極性小的的成分在制備過程中轉(zhuǎn)移率較低有關(guān)。

3 克白合劑微生物限度內(nèi)源性及外源性有害殘留物質(zhì)的安全性研究限量檢查

3.1 微生物限度

取不同批次的克白合劑樣品10 批，按《中國藥典》2020 年版四部通則1105～1107 檢查，結(jié)果見表2。表明10 批克白合劑的微生物限度測定結(jié)果符合現(xiàn)執(zhí)行標準。

表2 克白合劑微生物限度測定結(jié)果

3.2 重金屬及有害元素測定

取不同批次的克白合劑樣品10 批，按《中國藥典》2020 年版四部通則2321 原子吸收分光光度法對鉛、鎘、砷、汞、銅進行測定，結(jié)果見表3。

表3 克白合劑重金屬及有害元素測定結(jié)果

10 批次克白合劑的重金屬及有害元素含量較低，均符合2020 年版《中國藥典》規(guī)定中相關(guān)的限度執(zhí)行標準。

3.3 有機氯類農(nóng)藥殘留量測定

3.3.1 方法 按照《中國藥典》2020 年版四部通則2341 第一法測定9 種有機氯類農(nóng)藥殘留量。

3.3.1.1 對照品溶液的的制備 分別精密吸取六六六（α-BHC，β-BHC，γ-BHC，δ-BHC）、滴滴涕（PP'-DDE，PP'-DDD，OP'-DDT，PP'-DDT）及五氯硝基苯（PCNB）1mL，分別置于10mL 量瓶中，加石油醚稀釋至刻度，搖勻，制得每毫升各含5000、5000、10000μg 的對照品儲備液。精密量取上述各對照品儲備液1mL，置25mL 量瓶中，用石油醚（60～90℃）稀釋至刻度，搖勻，制得混合對照品儲備液。再精密量取上述混合對照品儲備液，用石油醚（60～90℃）制成每毫升分別約含0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 μg 的混合對照品溶液。

3.3.1.2 供試品溶液的的制備 精密量取克白合劑10 mL，置100 mL 具塞錐形瓶中，加水10 mL 浸泡過夜，精密加丙酮40mL，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用丙酮補足減失的重量，再加氯化鈉6 g、二氯甲烷30 mL，稱定重量，超聲處理15 min，稱定重量，用二氯甲烷補足減失的重量，靜置（使分層），將有機相迅速移入裝有適量無水氯化鈉的100mL 具塞錐形瓶中，放置4 h。精密量取35 mL，于40 ℃水浴上減壓濃縮至近干，加少量石油醚（60～90 ℃），如前反復(fù)操作至二氯甲烷及丙酮除凈，用石油醚（60～90 ℃）溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL 具塞刻度離心管中，加石油醚（60～90 ℃）精密稀釋至5 mL。小心加入硫酸1 mL，振搖1 min，3000 r·min-1離心10 min。吸取上清液即為供試品溶液。

3.3.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

3.3.2.1 專屬性試驗 按照 《中國藥典》2020 年版四部通則2341 第一法“9 種有機氯類農(nóng)藥殘留量測定法”項下色譜條件，精密吸取供試品溶液2 μL、對照品溶液1 μL，注入氣相色譜儀，得到相應(yīng)的氣相色譜圖。見圖4、圖5。

圖4 9 種有機氯農(nóng)藥對照品氣相色譜圖

圖5 樣品氣相色譜圖

3.3.2.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“3.3.1.1”項下各混合對照品溶液，每一濃度標樣進樣1μL，記錄色譜圖。以進樣量（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，計算得回歸方程如下：α-BHC（Y=245.8845X+2.1741，r=0.9999）；β-BHC（Y=90.4858X+170.4813，r=0.9996）；γ-BHC（Y=214.8878X+193.7824，r=0.9999）；δ-BHC（Y=143.188 2X+169.618 7，r=0.999 9）；PP'-DDE（Y=210.730 6X-34.786 2，r=1.000 0）；PP'-DDD（Y=136.801 0X+105.891 3，r=0.999 9）；OP'-DDT（Y=123.398 1X-69.741 8，r=0.999 9）；PP'-DDT（Y=131.900 3X-228.276 0，r=0.999 9）；α-PCNB（Y=190.888 2X+803.363 2，r=0.998 8）。

3.3.2.3 檢測限 取低濃度混合對照品溶液，逐級稀釋，進樣測定，以S/N=3 時注入儀器的各對照品溶液的量確定檢測限。檢測限結(jié)果如下：α-BHC 為0.12μg·L-1，β-BHC 為0.21μg·L-1，γ-BHC 為0.12μg·L-1，δ-BHC 為0.13 μg·L-1；PP'-DDE 為0.13 μg·L-1，PP'-DDD 為0.23 μg·L-1，OP'-DDT 為0.98 μg·L-1，PP'-DDT 為1.30 μg·L-1；PCNB（五氯 硝基苯）為0.07 μg·L-1。

3.3.3 樣品測定 分別精密吸取對照品溶液1 μL、供試品溶液2 μL，注入氣相色譜儀，按對照品比較外標法計算供試品中9 種有機氯類農(nóng)藥殘留量。結(jié)果見表4。

表4 克白合劑9 種有機氯類農(nóng)藥殘留量測定結(jié)果

4 結(jié)論

4.1 指紋圖譜色譜條件的選擇

查閱有關(guān)復(fù)方制劑指紋圖譜的研究文獻[8]，對克白合劑指紋圖譜進行了研究。本課題經(jīng)過一系列的色譜條件研究，發(fā)現(xiàn)流動相中的有機相比例達到55%后，圖譜中基本無色譜峰出現(xiàn)，故現(xiàn)確定的色譜條件能對主要色譜峰達到較好分離，且便于進行制劑－藥材的譜峰歸屬分析，能較大限度地反映其特征。

4.2 色譜峰歸屬性分析

在不同批次的克白合劑指紋圖譜中，女貞子、丹參、補骨脂、白芷、黃芪、獨活對共有峰的貢獻較大；蜈蚣、地黃、刺蒺藜、黨參、枸杞子及地龍的特征峰未能體現(xiàn)，這可能與制備過程中各成分轉(zhuǎn)移率不同有關(guān)。研究建立的指紋圖譜鑒別方法簡便、重復(fù)性好，能達到控制批間質(zhì)量一致性的目的，并為克白合劑的綜合質(zhì)量評價提供了科學依據(jù)。

4.3 微生物、重金屬有害元素及農(nóng)藥殘留量的限量測定

在對制劑中有效性成分進行質(zhì)量控制的同時，關(guān)注影響制劑使用安全的外源性有害成分研究。對克白合劑中的微生物、重金屬及有害元素、農(nóng)藥殘留量進行測定，其中對重金屬及有害元素進行了檢測限的確定，均符合藥典要求，可保證克白合劑在臨床長期使用中更為安全。