離子色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)方葡萄糖酸鈣口服溶液中葡萄糖酸根和乳酸根含量

孫 桐，吳 旭，王 悅

江蘇省淮安市食品藥品檢驗(yàn)所，淮安223300

復(fù)方葡萄糖酸鈣口服溶液主要成分為葡萄糖酸鈣和乳酸鈣。本品為鈣的補(bǔ)充劑，具有促進(jìn)骨骼及牙齒的鈣化形成，維持神經(jīng)與肌肉的正常興奮性和降低毛細(xì)血管通透性等作用。人體缺鈣時(shí)，會(huì)出現(xiàn)腿軟、抽筋的情況，發(fā)生乏力、煩躁、注意力不集中，容易疲倦等癥狀。葡萄糖酸鈣的飽和溶液每10 mL含鈣元素89 mg，乳酸鈣飽和溶液每10 mL 含鈣元素100 mg，而復(fù)方鈣的組合，復(fù)方鈣源之間有相互增溶、助溶作用，從而提高了單位劑量中鈣元素的含量，復(fù)方葡萄糖酸鈣口服溶液每10 mL 含鈣元素可達(dá)到110 mg。目前，在現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]中，復(fù)方葡萄糖酸鈣的含量都是以鈣計(jì)，通過(guò)EDTA 絡(luò)合滴定法測(cè)定鈣鹽的含量，這些鈣鹽可以是葡萄糖酸鈣、乳酸鈣，還可能是其他易溶的鈣鹽，如氯化鈣、碳酸氫鈣、硝酸鈣、磷酸二氫鈣、氯酸鈣等，標(biāo)準(zhǔn)中僅以鈣的含量作為限度指標(biāo)，其專(zhuān)屬性不強(qiáng)，即使在檢驗(yàn)中鈣離子含量測(cè)定符合規(guī)定，人們也無(wú)從得知生產(chǎn)企業(yè)是否會(huì)用其他鈣鹽去替換葡萄糖酸鈣或乳酸鈣，則無(wú)法測(cè)定葡萄糖酸根和乳酸根的具體含量，就無(wú)法對(duì)生產(chǎn)企業(yè)原輔料的投放進(jìn)行有效質(zhì)量控制，不能對(duì)藥品質(zhì)量起到嚴(yán)格的監(jiān)管作用。

現(xiàn)有多篇文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鈣鋅的含量測(cè)定方法，有原子吸收法[2]、ICP-OES法[3]、ICP-MS 法[4]，這些分析方法都還是測(cè)定鈣、鋅等陽(yáng)離子。也有文獻(xiàn)報(bào)道了葡萄糖酸鈣和乳酸的高效液相色譜法[5]，由于葡萄糖酸鈣在C18柱上不宜保留，對(duì)流動(dòng)相、色譜柱等實(shí)驗(yàn)條件也相對(duì)要求嚴(yán)苛。而離子色譜法具有快速、靈敏、選擇性好和同時(shí)測(cè)定多組分的優(yōu)點(diǎn)；特別是陰離子方面，同時(shí)測(cè)定多種陰離子的快速、準(zhǔn)確而靈敏的分析手段首選離子色譜法[6-8]。葡萄糖酸鈣和乳酸鈣在堿性的條件下，葡萄糖酸根和乳酸根以陰離子的形態(tài)存在，通過(guò)陰離子交換柱的分離后，經(jīng)由檢測(cè)器的信號(hào)轉(zhuǎn)換形成各陰離子的色譜圖，可以準(zhǔn)確地進(jìn)行定量分析。鑒于離子色譜在有機(jī)陰離子和無(wú)機(jī)陰離子檢測(cè)領(lǐng)域的廣泛運(yùn)用[9，10]，本研究旨在建立離子色譜法對(duì)復(fù)方葡萄糖酸鈣口服溶液中葡萄糖酸根和乳酸根進(jìn)行分離并定量，同時(shí)對(duì)方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證，為提高復(fù)方葡萄糖酸鈣口服溶液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了新的參考。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Dionex ICS 5000+離子色譜儀（美國(guó)Thermo）、Dionex EGC ⅢKOH 淋洗液發(fā)生器（美國(guó)Thermo）、XP205 電子天平（瑞士Mettler）。

1.2 藥品與試劑

葡萄糖酸鈣對(duì)照品（批號(hào)：100082-201803，按C12H22O14Ca·H2O 計(jì)含量100%）；五水合乳酸鈣對(duì)照品（批號(hào)：101179-201902，按C6H10CaO6計(jì)含量74.0%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；水為超純水。

復(fù)方葡萄糖酸鈣口服溶液5 批（哈藥集團(tuán)三精制藥3 批，批號(hào)：21012712、21021633、21 012523；南京特豐制藥2 批，批號(hào)：20201232、20200812）；規(guī)格均為每支10 mL 劑型，每10 mL 含葡萄糖酸鈣（C12H22O14Ca·H2O）0.5 g、乳酸鈣（C6H10CaO6·5H2O）0.5 g，以鈣元素計(jì)每10 mL 含110 mg。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

檢測(cè)器：電導(dǎo)檢測(cè)器；色譜柱：Dionex IonPacTMAS19 RFICTM（4 mm×250 mm）；保護(hù)柱：Dionex Ion-PacTMAG19 RFICTM（4 mm 50 mm）；抑制器：Dionex AERS 500（4 mm），抑制電流70 mA；淋洗液：KOH溶液，梯度洗脫（程序：0～40 min，0.8 mmol·L-1；40～53 min，35 mmol·L-1；53～60 min，0.8 mmol·L-1）；柱溫：30 ℃；檢測(cè)池溫度：35 ℃；流速1 mL·min-1；進(jìn)樣體積：20 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對(duì)照品貯備液 精密稱取葡萄糖酸鈣對(duì)照品和乳酸鈣對(duì)照品適量，加水制成含葡萄糖酸根100.90 μg·mL-1和乳酸根72.43 μg·mL-1的混合對(duì)照品貯備液。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液 精密量取混合對(duì)照品貯備液適量，用水依次稀釋成含葡萄糖酸根1.009、2.018、5.045、10.090、25.225 μg·mL-1和乳酸根0.724、1.449、3.621、7.243、18.108 μg·mL-1系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.3 供試品溶液 精密量取復(fù)方葡萄糖酸鈣口服溶液1 mL，置50 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取該溶液1 mL，置100 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

2.2.4 空白溶液 取空白溶劑，制備空白溶液。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 色譜系統(tǒng)適用性要求 稱取葡萄糖酸鈣對(duì)照品和乳酸鈣對(duì)照品適量，加水制成葡萄糖酸根、乳酸根的單一對(duì)照品溶液，取混合對(duì)照品溶液（葡萄糖酸根5.045 μg·mL-1，乳酸根3.621 μg·mL-1）和單一對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，葡萄糖酸根的保留時(shí)間為33.42 min，理論塔板數(shù)＞9100，拖尾因子1.07；乳酸根的保留時(shí)間為36.35 min，理論塔板數(shù)＞11000，拖尾因子0.98。葡萄糖酸根和乳酸根分離度為2.3（若保證兩者分離度不＜1.5，葡萄糖酸根和乳酸根的理論塔板數(shù)應(yīng)分別＞6500 和8000），在進(jìn)樣40 min 后切換成高濃度淋洗液，其他強(qiáng)保留組分完全洗脫下來(lái)。

圖1 （A）混合對(duì)照品溶液、（B）乳酸根對(duì)照品溶液、（C）葡萄糖酸根對(duì)照品溶液的色譜圖

2.3.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取空白溶液、混合對(duì)照品溶液（葡萄糖酸根5.045 μg·mL-1，乳酸根3.621 μg·mL-1）、供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，見(jiàn)圖2。表明空白溶液和復(fù)方葡萄糖酸鈣口服液中其他成分對(duì)葡萄糖酸根、乳酸根無(wú)干擾。

圖2 （A）空白溶液、（B）供試品溶液、（C）混合對(duì)照品溶液色譜圖

2.3.3 線性關(guān)系考察 取混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以對(duì)照品的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、濃度X（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，葡萄糖酸根線性方程為：Y=0.008+0.159X，r=0.999 4，線性范圍1.009～25.225 μg·mL-1；乳酸根線性方程為：Y=0.160+0.438X，r=0.999 7，線性范圍0.724～18.108 μg·mL-1。

2.3.4 定量限 取“2.2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，用水逐級(jí)稀釋?zhuān)♂尩狡咸烟撬岣腿樗岣膬x器信噪比（S/N）約為10 的時(shí)候，溶液濃度作為定量限，結(jié)果顯示，葡萄糖酸根的定量限為0.25 μg·mL-1；乳酸根的定量限為0.11 μg·mL-1。

2.3.5 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 精密量取混合對(duì)照品溶液（葡萄糖酸根5.045 μg·mL-1，乳酸根3.621 μg·mL-1），按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，計(jì)算峰面積的RSD（n=6），結(jié)果顯示，葡萄糖酸根、乳酸根峰面積的RSD 分別為0.81%、0.52%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)21012712 樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法配制供試品溶液6 份，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，計(jì)算復(fù)方葡萄糖酸鈣口服溶液中葡萄糖酸根和乳酸根含量。結(jié)果顯示，葡萄糖酸根、乳酸根的含量分別為44.63、31.66 mg·mL-1，RSD（n=6）分別為0.93%、0.71%，表明重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)21012712 樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，室溫避光放置，在0、2、4、8、12 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算峰面積的RSD（n=5）。結(jié)果顯示，葡萄糖酸根、乳酸根峰面積的RSD 分別為2.67%、1.51%，表明供試品12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量（批號(hào)21012712）樣品1 mL，置100 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，取上述溶液1 mL，共9 份，分別置50 mL 量瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品貯備液（葡萄糖酸根100.90 μg·mL-1和乳酸根72.43 μg·mL-1）4.0、5.0、6.0 mL，各3 份，最后加水稀釋至刻度，搖勻，配制成低、中、高3 種不同濃度的供試品溶液各3 份，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，計(jì)算加樣回收率，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率結(jié)果（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取5 個(gè)批次樣品各2 份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，計(jì)算復(fù)方葡萄糖酸鈣口服溶液中葡萄糖酸根和乳酸根含量。通過(guò)復(fù)方葡萄糖酸鈣口服溶液配方含葡萄糖酸鈣（C12H22O14Ca·H2O）和乳酸鈣（C6H10CaO6·5H2O）的量，折算出葡萄糖酸根和乳酸根的理論含量范圍，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 復(fù)方葡萄糖酸鈣口服溶液測(cè)定結(jié)果（n=2）

3 討論

葡萄糖酸根和乳酸根均為弱保留成分，保留時(shí)間接近，需要在低濃度淋洗液下分離，而樣品中含有的強(qiáng)保留成分如硝酸根、磷酸根、硫酸根需要很長(zhǎng)時(shí)間才能洗脫下來(lái)。采用淋洗液的梯度洗脫即能保證分離效果，同樣兼顧分離效率。陰離子分離常用淋洗液的體系有2 種：氫氧根體系和碳酸鹽體系。碳酸鹽體系[11]包括碳酸鈉或碳酸氫鈉，抑制產(chǎn)物為碳酸，容易形成二氧化碳，導(dǎo)致基線漂移，同時(shí)碳酸鹽系統(tǒng)不能進(jìn)行梯度洗脫。最終選定KOH 系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，在低濃度條件下，當(dāng)葡萄糖酸根和乳酸根完全分離后，切換到高濃度體系，保證在短時(shí)間內(nèi)將強(qiáng)保留成分完全洗脫下來(lái)。

葡萄糖酸根和乳酸根較難分離，試驗(yàn)中比較了Dionex IonPacTMAS19 RFICTM、Dionex IonPacTMAS16 RFICTM和Dionex IonPacTMAS11 RFICTM3 種陰離子常用柱，這3 種色譜柱都可以檢測(cè)葡萄糖酸根和乳酸根，通過(guò)調(diào)節(jié)淋洗液濃度和流速，使用AS16、AS11 兩種柱子，葡萄糖酸根和乳酸根都無(wú)法分離完全；而使用AS19 柱，分離好，峰型佳。

在相關(guān)文獻(xiàn)[12]中，言及對(duì)照品溶液和供試品溶液需要Na 柱進(jìn)行預(yù)處理，用Na+置換Ca2+，以防在堿性條件下形成氫氧化鈣沉淀，沉積在色譜柱內(nèi)。參考這一做法，對(duì)空白溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液都進(jìn)行Na 柱預(yù)處理，對(duì)照品溶液和供試品溶液的色譜圖中在乳酸根峰后都出現(xiàn)了一個(gè)未知峰，見(jiàn)圖3；而空白溶液中并未出現(xiàn)。配置不同濃度的溶液分析，依然如此，推測(cè)是葡萄糖酸鈣或者乳酸鈣同填料發(fā)生某種反應(yīng)而引入了新的陰離子，對(duì)于這些未知不可控因素在試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)該盡量避免。氫氧化鈣溶解度是隨溫度的升高而下降，當(dāng)溫度為0～70 ℃，氫氧化鈣在水中的溶解度＞1 mg·mL-1，進(jìn)入色譜柱的溶液Ca2+濃度大概只有每毫升幾微克，即便生成少量氫氧化鈣也能溶于水中，即使長(zhǎng)時(shí)間使用會(huì)出現(xiàn)Ca2+沉積，使用低濃度草酸溶液對(duì)色譜柱進(jìn)行沖洗即可解決，最終決定不對(duì)樣品進(jìn)行Na 柱預(yù)處理。

圖3 Na 柱預(yù)處理后對(duì)照品溶液色譜圖

現(xiàn)行的復(fù)方葡萄糖酸鈣口服溶液檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中采用薄層色譜法對(duì)葡萄糖酸鈣和乳酸鈣進(jìn)行了鑒別，結(jié)果也只能證明葡萄糖酸根和乳酸根的存在。本方法能準(zhǔn)確地測(cè)定溶液中葡萄糖酸根和乳酸根的含量，但是由于生產(chǎn)工藝、藥用輔料以及雜質(zhì)等因素的影響，葡萄糖酸根和乳酸根的含量并不能簡(jiǎn)單折算成葡萄糖酸鈣和乳酸鈣的含量，因此現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)鈣的控制是必須的。如果在現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中加入對(duì)葡萄糖酸根和乳酸根含量的控制，再結(jié)合鈣的控制，兩者相輔相成，可以真正對(duì)該藥品原輔料投放等關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)做到實(shí)驗(yàn)質(zhì)量分析和監(jiān)管。

4 小 結(jié)

本試驗(yàn)建立了離子色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)方葡萄糖酸鈣口服溶液中葡萄糖酸根和乳酸根的含量，并進(jìn)行了方法學(xué)的驗(yàn)證，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，干擾小，精準(zhǔn)度高，本方法可滿足該藥物中葡萄糖酸根和乳酸根含量測(cè)定的要求，特別是乳酸、乳酸鈣作為良好的添加劑，已廣泛運(yùn)用于藥品、食品領(lǐng)域，該方法可推廣應(yīng)用于測(cè)定食品、藥品中乳酸根的含量。