哈茨木霉菌對砂糖橘苗木的促生作用及差異代謝物的分析

楊寶敏, 姜家琳, 楊月華, 李雙如, 姜 玲

(華中農(nóng)業(yè)大學園藝林學學院/園藝植物生物學教育部重點實驗室,湖北 武漢 430070)

木霉菌(Trichodermaspp.)是一種存在于土壤中的植物病原菌生物防治菌，能夠改善植物根系微環(huán)境并在根系定殖而輔助根系吸收營養(yǎng)，并且產(chǎn)生的多種抗生次級代謝產(chǎn)物對植物真菌、細菌、病毒等病原微生物有抑制作用，可以誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired resistance, SAR)[1-4]。木霉菌還能夠通過競爭根系營養(yǎng)和空間、重寄生等抑制或殺滅病原菌[5-6]。哈茨木霉菌(T.harzianum)是木霉屬中應用最廣的菌株，能促進植株生長和抑制病原菌侵染，其生防效果已在不少農(nóng)作物中得到驗證。哈茨木霉菌能提高黃瓜根系活力，促進根系發(fā)育和光合作用，從而促進黃瓜植株生長[7]；哈茨木霉菌、叢枝菌根真菌和熒光假單胞桿菌協(xié)同處理可以抑制豌豆根腐病并促進豌豆生長和增產(chǎn)[8]；使用哈茨木霉菌拌土或灌根能促進大白菜生長，抑制根腫病[9]；哈茨木霉菌配施商品有機肥并減施純氮11%，能有效促進玉米生長發(fā)育和光合作用，并能提高土壤速效養(yǎng)分含量和有機質(zhì)含量，增強土壤肥力[10]；采用哈茨木霉菌LTR-2拌種劑對小麥拌種處理，能夠降低根際土壤中鏈格孢屬、赤霉屬等病原真菌比例，降低病害發(fā)生的幾率[11]；哈茨木霉菌LTR-2活體孢子可濕性粉劑(木霉菌肥效劑)拌種處理冬小麥，能顯著提高出苗數(shù)，增產(chǎn)4.83%[12]。

代謝組學是對在特定生理時期內(nèi)某一生物或細胞所有低分子量代謝產(chǎn)物同時進行定性和定量分析的一門新學科。細胞代謝活動是植物生命活動的基礎，細胞內(nèi)代謝物質(zhì)水平與細胞內(nèi)生命活動息息相關，通過代謝物分析可以闡明植物對外源性物質(zhì)刺激所做出的所有代謝應答[13-15]。Vinale et al[16]發(fā)現(xiàn)哈茨木霉菌次生代謝產(chǎn)物中的蒽酮類物質(zhì)6PP(6-n-pentyl-6H-pyran-2-one)不僅可以抑制病原菌生長，還能促進番茄、油菜的生長。

柑橘是重要的大宗水果之一，苗木質(zhì)量直接影響柑橘產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。王男麒等[17]報道了哈茨木霉菌對柑橘果實采后防腐保鮮的作用。目前尚未見哈茨木霉菌對柑橘苗木質(zhì)量影響的相關報道。本研究通過對砂糖橘苗木進行哈茨木霉菌灌根處理，了解哈茨木霉菌對其生長的影響，并比較了哈茨木霉菌引起的砂糖橘苗木代謝物的變化，以期為哈茨木霉菌在柑橘苗木繁育中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 哈茨木霉菌灌根處理

以枳砧嫁接的砂糖橘苗木為試材，種植于高25 cm、直徑23 cm塑料盆中，基質(zhì)的泥炭、蛭石和菜園土各占1/3，水、肥管理條件一致。哈茨木霉菌由山東綠隴生物科技有限公司生產(chǎn),有效活菌數(shù)>0.1×109個·g-1。本研究設A、B兩個處理，即將哈茨木霉菌粉狀菌劑溶于1.5 L水，對每株苗木進行灌根處理,以探究不同質(zhì)量濃度哈茨木霉菌水溶液對砂糖橘苗木生長的影響。A處理為：1.33 g·L-1灌根8次+2.00 g·L-1灌根7次；B處理為：3.33 g·L-1灌根8次+4.00 g·L-1灌根7次。即從2020年9月4日起，每隔6 d對每株苗木灌根1次，A、B處理哈茨木霉菌水溶液質(zhì)量濃度分別為：1.33、3.33 g·L-1，共灌根8次；由于前期8次劑量小，為了增大哈茨木霉菌處理后苗木的反應，從2021年3月5日起的第9～第15次灌根，A、B處理哈茨木霉菌水溶液濃度分別提高為：2.00、4.00 g·L-1；對照(CK)澆灌等量的清水。處理組和CK各種植6盆砂糖橘苗。

1.2 礦物元素測定

當哈茨木霉菌水溶液灌根8次時，處理組和CK表型差異已比較明顯，采集砂糖橘苗葉樣，參考周高峰[18]方法測定葉片礦物元素含量。葉片用去離子水清洗后，放入110 ℃烘箱中殺青30 min，然后將葉片磨成粉狀。稱取0.100 0 g葉片粉末，在馬弗爐中550 ℃下灰化處理5 h，降至室溫后加入3 mL HCl、1 mL HNO3，用水定容至10 mL。提取30 min，過濾，將濾液稀釋3倍，利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES，安捷倫公司)檢測大量元素(P、K、Ca、Mg、S)和微量元素(Fe、Mn、Cu、Zn、Na、Al)共計11種礦物元素含量。將砂糖橘苗葉樣在90 ℃下烘干，過100目篩網(wǎng)，采用元素分析儀(Elementar公司)檢測全氮含量。

1.3 苗木形態(tài)和生理指標測定

當哈茨木霉菌水溶液灌根15次時，比較A、B處理和CK的株高、干徑、葉面積和根系。在離盆中土面10 cm處測量干徑；葉面積/cm2=成熟葉片平均葉面積×葉片數(shù)；葉綠素含量測定參考王學奎[19]的方法并稍做修改，同時檢測葉片的葉綠素相對含量(SPAD值)。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 22.0軟件進行單因素同質(zhì)性分析及差異顯著性分析。

1.4 非靶向代謝物檢測

1.4.1 葉片中代謝物提取 在哈茨木霉菌水溶液第8次灌根24 h后，采集部位和成熟度相對一致的葉片，設置6個生物學重復。(1)稱取100 mg葉片放入液氮中研磨成粉，將研磨后的葉片組織全部轉(zhuǎn)移于1.5 mL離心管中，加入500 μL體積分數(shù)為80%甲醇水溶液，渦旋震蕩后冰浴靜置5 min。(2)12 000 r·min-1、4 ℃下離心20 min后，吸取250 μL上清液于1.5 mL離心管中，加入127.4 μL質(zhì)譜級水將上清液稀釋至甲醇含量為53%。(3)再次在12 000 r·min-1、4 ℃下離心20 min，收集上清液，樣品用LC-MS進行分析，并從每個試驗樣本中選取等體積樣本混勻作為QC樣本。(4)色譜儀Vanquish UHPLC(Thermo Fisher)上設置色譜柱為Hypesil gold column(C18)，柱溫40 ℃，流速0.2 mL·min-1。正模式：流動相A是0.1%甲酸，流動相B是甲醇；負模式：流動相A是5 mmol·L-1醋酸銨(pH=9.0)，流動相B是甲醇。(5)色譜梯度洗脫程序為：A相98%，B相2%，0～1.5 min；B相100%，12～14 min；A相98%，B相2%，14.1～17 min。(6)將質(zhì)譜儀QExactiveTM HF-X的質(zhì)譜掃描范圍設定在100～1 500 m·z-1[20]。

1.4.2 偏最小二乘法判別分析質(zhì)量評估 運用偏最小二乘回歸建立代謝物表達量與樣品類別之間的關系模型，對樣品類別進行預測。經(jīng)7次循環(huán)交互驗證，當樣本生物學重復數(shù)(n)≤3時，為k次循環(huán)交互驗證，則k=2n，得到模型評價參數(shù)(R2,Q2)。如果R2和Q2越接近1，表明模型越穩(wěn)定、可靠。

1.4.3 代謝物的鑒定 將數(shù)據(jù)文件導入CD軟件中，進行保留時間、質(zhì)荷比等參數(shù)的篩選，然后對不同樣品根據(jù)保留時間偏差0.2 min和質(zhì)量偏差5 mg·L-1進行峰對齊，對峰面積進行定量，再整合目標離子。通過分子離子峰和碎片離子進行分子式的預測，并與mzCloud(https://www.mzcloud.org/)、mzVault和Masslist數(shù)據(jù)庫進行比對，用空白樣本去除背景離子，并對定量結(jié)果進行歸一化，最后得到定量結(jié)果，對陽離子和陰離子結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈茨木霉菌對砂糖橘苗木生長的影響

哈茨木霉菌水溶液灌根15次后，各處理砂糖橘苗木形態(tài)見圖1。對比圖1中a與b、c與d、e與f可知，哈茨木霉菌處理過的砂糖橘苗木較未處理前，新根數(shù)量多且葉片繁茂，生長旺盛。從圖1中g、h、i可知，灌根處理15次后，A處理砂糖橘苗木的新根量多于CK，也多于B處理。

A.A處理灌根前;b.A處理灌根15次；c.B處理灌根前;d.B處理灌根15次；e.未澆灌清水的CK;f.澆灌15次清水的CK；g、h、i分別為灌根15次后A處理、B處理和CK的放大根系。

哈茨木霉菌水溶液灌根15次后，各處理砂糖橘苗木的形態(tài)指標對比見表1。由表1可知，A處理苗木葉面積顯著大于B處理和CK(圖1 b、1d、1f)；B處理苗木的干徑增長值顯著高于CK；A處理和B處理根系繁茂，根冠截面積均顯著高于CK；B處理的葉綠素a含量顯著高于CK；A處理和B 處理的葉綠素b含量均顯著高于CK；A處理的SPAD值顯著高于CK。

表1 哈茨木霉菌灌根后砂糖橘苗木的形態(tài)比較1)Table 1 Morphological comparison of citrus nursery plants irrigated with T.harziana

2.2 哈茨木霉菌對砂糖橘苗木葉片礦物元素含量的影響

礦物元素測定(圖2)表明，A處理葉片的P、Ca、Mg、Fe、Zn含量均顯著高于CK(P<0.05)；B處理葉片的P、Ca、Mg、Zn含量均顯著高于CK(P<0.05)；但哈茨木霉菌處理和CK的全氮含量差異不顯著。

圖2 哈茨木霉菌處理對砂糖橘苗木葉片礦物元素含量的影響Figure 2 Effect of T.harziensis on mineral nutrients contents of citrus leaves

2.3 差異代謝物的篩選

2.3.1 差異代謝物的偏最小二乘法判別分析 采用偏最小二乘法(partial least squares discrimination analysis, PLS-DA)建立了代謝物表達量與樣品類別之間的關系模型(圖3)，以分析非靶向代謝組數(shù)據(jù)。R2Y表示模型的解釋率，Q2Y用于評價PLS-DA模型的預測能力。當R2Y>Q2Y時，表示建立的模型良好。由圖3可知，A處理與CK、B處理與CK、A處理與B處理陽離子和陰離子分析均滿足上述條件，3個組均建立了良好的模型。

A.LA vs CK (陰離子);b.LA vs CK(陽離子);c.LB vs CK(陰離子);d.LB vs CK(陽離子);e.LB vs LA(陰離子);f.LB vs LA(陽離子)。

2.3.2 差異代謝物篩選結(jié)果 利用陰陽離子分析，篩選出各處理與CK的差異代謝物。其中，陽離子檢測共獲得1 048種代謝物，與CK相比，A處理有8種代謝物上調(diào)和12種代謝物下調(diào)，B處理有32種代謝物上調(diào)和16種代謝物下調(diào)；B處理與A處理相比，有15種代謝物上調(diào)和7種代謝物下調(diào)。陰離子檢測共獲得748種代謝物，與CK相比，A處理有6種代謝物上調(diào)和12種代謝物下調(diào)，B處理有13種代謝物上調(diào)和24種代謝物下調(diào)；B處理與A處理相比，有8種代謝物上調(diào)和8種代謝物下調(diào)(表2)。

表2 差異代謝物篩選結(jié)果Table 2 Metabolite differential screening results

2.4 差異代謝物火山圖

火山圖可直觀表現(xiàn)處理與CK差異代謝物的分布情況?；鹕綀D中每個點代表1個代謝物，顯著上調(diào)、下調(diào)的代謝物分別用紅色圓點、綠色圓點表示，圓點的大小代表VIP值(圖4)。A處理及CK經(jīng)陽離子、陰離子分析后，上調(diào)和下調(diào)的重要代謝物見表3。從表3可見，這些代謝物包含2種氨基酸衍生物和1種氨基酸類化合物、2種羥基酸及其衍生物、2種羧酸及其衍生物、3種脂肪酸、3種類黃酮、3種內(nèi)酯、2種有機含氮化合物、2種孕烯醇酮脂類。此外，還包括糖苷類、腺苷類、有機氧化合物、苯及其衍生物、糖醇類、環(huán)烯醚萜苷、烯胺、脂肪酸衍生物、嘧啶核苷酸、二糖、大環(huán)內(nèi)酯類和類似物、生物素各1種以及6種其他物質(zhì)。

A.LA vs CK (陰離子);b.LA vs CK(陽離子);c.LB vs CK(陰離子);d.LB vs CK(陽離子);e.LB vs LA(陰離子);f.LB vs LA(陽離子)。

表3 哈茨木霉菌A處理與CK的重要差異代謝物Table 3 Important differential metabolites between T.harziana A treatment and control

2.5 差異代謝物KEGG富集閃點圖分析

在LA vs CK_KEGG路徑(陰離子)富集閃點圖中，KEGG注釋到141個背景代謝物，有4條KEGG路徑被富集(P<0.05)，包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解、丙酸鹽代謝、花青素生物合成和甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，它們分別涉及的代謝物是甲基丙二酸、甲基丙二酸、山慈菇花甙和L-O-磷酸絲氨酸(圖5a)。在LA vs CK_KEGG路徑(陽離子)富集閃點圖中，KEGG注釋到146個背景代謝物，有3條KEGG路徑被富集(P<0.05)，包括鞘脂代謝、碳青霉烯生物合成和生物素代謝，它們分別涉及的代謝物是4-羥二氫鞘氨醇、泛硫醇和生物素代謝(圖5b)。在LB vs CK_KEGG路徑(陰離子)富集閃點圖中，KEGG注釋到141個背景代謝物，有3條KEGG路徑被富集(P<0.05)，包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解、丙酸代謝和花青素合成，它們分別涉及的代謝物是甲基丙二酸和山慈菇花甙(圖5c)。在LB vs CK_KEGG路徑(陽離子)富集閃點圖中，KEGG注釋到146個背景代謝物，有2條KEGG路徑被富集(P<0.05)，包括氨基酸生物合成和甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝。兩條路徑分別涉及的代謝物是高絲氨酸、4-磷酸赤蘚糖、高絲氨酸和蘇氨酸(圖5d)。

A.LA vs CK_KEGG(陰離子)；b.LA vs CK_KEGG(陽離子)；c.LB vs CK_KEGG(陰離子)；d.LB vs CK_KEGG(陽離子)。

3 討論

3.1 哈茨木霉菌處理顯著促進5種礦物元素的吸收

本研究表明,適量的哈茨木霉菌A處理(1.33 g·L-1灌根8次+2.00 g·L-1灌根7次)能顯著促進砂糖橘苗木地上部分和地下部分的生長，使葉面積增大、新根更繁茂，這與前人研究認為哈茨木霉菌具有促生作用相似[7-8]。哈茨木霉菌處理后，砂糖橘葉片礦物元素含量由高到低依次為：Ca>K>Mg>P>S>Na>Al>Fe>Mn>Zn>Cu>Zn，這和前人研究相似[21]。A處理葉片的P、Ca、Mg、Zn和Fe含量顯著提升(P<0.05)，B處理葉片的P、Ca、Mg、Zn含量顯著提升(P<0.05)。B處理哈茨木霉菌的菌劑量比A處理稍高，推測這可能與細菌自身也會消耗和調(diào)節(jié)Fe元素利用有關[22-23]。P元素能促進早期根系的形成和生長，提高植物適應環(huán)境的能力，增強抗病性[24]；Ca元素是細胞壁重要成分，能穩(wěn)定生物膜結(jié)構(gòu)，促進根系生長、增加水分吸收，還參與信息傳遞，激活態(tài)的鈣調(diào)素可以激活多種關鍵酶，使細胞產(chǎn)生與信號相對應的生理反應[25]；Mg不僅是葉綠素的構(gòu)成元素，也是許多酶的活化劑[26]；Zn可以提高植物抗逆性；Fe參與植物體內(nèi)氧化還原反應和電子傳遞，是葉綠素合成所必需的微量元素[27]。由此可見，哈茨木霉菌可能通過促進上述元素的吸收，達到促生和提高抗性的目的。

3.2 哈茨木霉菌處理對幾條重要代謝路徑的加強

在被富集到的KEGG上調(diào)路徑中，哈茨木霉菌處理加強了纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解，促進12～16大環(huán)內(nèi)酯成員的生物合成以及多聚肽骨架的生物合成，為殺菌化合物的合成奠定了基礎[28]。本試驗還發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉菌處理后，丙酸代謝路徑顯著上調(diào)，其中代謝物甲基丙二酸作為底物可用于有機合成，涉及酯化反應，與甲脒反應合成嘧啶甜菜堿類物質(zhì)和合成丙二酸半硫酯(malonic acid half thioesters, MAHT)。哈茨木霉菌處理加強了花青素合成，直接促進山慈菇花甙合成[29]。山慈菇花甙屬于聚酮化合物，是抗生素物質(zhì)的骨架。哈茨木霉菌處理還能促進氨基酸代謝。氨基酸起到氮的平衡作用，氨基酸分解代謝可以轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔蛑荆蜻M入三羧循環(huán)氧化分解成CO2和水，并釋放能量。

哈茨木霉菌處理還促進了鞘脂代謝、碳青霉烯生物合成和生物素代謝。鞘脂是生物膜結(jié)構(gòu)的重要組成成分，鞘脂及其代謝產(chǎn)物參與調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、衰老和細胞程序性死亡等信號轉(zhuǎn)導過程。鞘脂在植物中通過植物神經(jīng)酰胺對纖維細胞伸長具有重要作用[30]。碳青霉烯是β-內(nèi)酰胺抗生素，具有廣譜、耐酶等特點，有利于提高植物的抗病能力[31]。生物素對基因表達的調(diào)控起著重要的作用。

綜上所述，本研究通過非靶向代謝物質(zhì)譜分析，獲得了哈茨木霉菌處理激發(fā)砂糖橘苗木差異代謝物的信息，證明了哈茨木霉菌處理可以促進砂糖橘苗木礦物營養(yǎng)吸收，加強氨基酸代謝與多種重要代謝物的富集，有利于葉面積增大和根系發(fā)達，從而促進了植株生長。同時，重要次生代謝物的積累可能是提高植株免疫力和抗病性的物質(zhì)基礎。