廣西家蠶“兩廣二號”血液型膿病傳染因子及其偏相關分析

唐亮，唐名艷，潘志新，蔣滿貴，趙燁蕓，余武昌，李標，虞崇江，董桂清*

（1.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術推廣站，南寧市 530007；2.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學研究院，南寧市 530007）

廣西是全國蠶桑產業(yè)大?。▍^(qū)），在承接“東桑西移”的產業(yè)轉移中，逐漸形成了以小蠶共育及多批次連續(xù)養(yǎng)蠶為特點的廣西高密度養(yǎng)蠶模式，為蠶繭產量提升提供了有力保障，使廣西成為了全國乃至世界重要的桑蠶繭絲生產基地。但廣西高溫多濕氣候以及連續(xù)養(yǎng)蠶的飼養(yǎng)模式，更易多發(fā)生物病原繁殖與感染從而引發(fā)病害。據(jù)不完全統(tǒng)計，廣西蠶桑生產中由發(fā)生蠶病造成的蠶繭損失15%～20%。

家蠶血液型膿病又稱家蠶核型多角體?。˙ombyx moriNuclearpolyhedrosis Virus NPV，簡稱BmNPV），是危害家蠶最嚴重的一種病毒病，僅2008—2018 年廣西家蠶膿病年均發(fā)生率為11.35%，使之成為廣西最為嚴重的傳染性蠶病之一［1-2］，每年損失蠶繭達數(shù)萬噸。其病毒是一種有包涵體的DNA 病毒［3］，對蠶座血液型膿病次生感染進行調查情況，有助于解析家蠶病毒病傳播的關鍵要素，服務蠶桑產業(yè)蠶病防控?；诩倚Q血液型膿病對蠶桑產業(yè)的巨大危害，精準防控該病成為國內外學者研究的熱點和難點。王霞等［4］通過對廣西不同蠶區(qū)來源的15 株BmNPV毒株進行測定，其對家蠶品種兩廣二號的LC50多角體濃度2.1×106～4.2×106個/mL，屬于抗性較高水平，但毒株間差異不顯著。在前期蠶病普查研究中發(fā)現(xiàn)，廣西河池地區(qū)血液型膿病的發(fā)病率與季節(jié)、蠶區(qū)有緊密的相關性，如夏季的6—8 月血液型膿病顯著高于其他月份；氣溫高和降雨多的蠶區(qū)血液型膿病年均發(fā)生率高，如貴港蠶區(qū)夏季發(fā)病率為18.15%，危害嚴重［2］。

偏相關分析是指當兩個變量同時與第三個變量相關時，將第三個變量的影響剔除，只分析另外兩個變量之間相關程度的過程，判定指標是相關系數(shù)的R值，是目前使用較多的一種分析工具。影響家蠶血液型膿病的因子較多，對傳染因子進行偏相關分析可以實現(xiàn)精準防控該病，抓住主要影響因子。韋秉興等［5］2008 年報道將5%BmNPV 的兩廣二號病蠶混入不同飼養(yǎng)密度的5齡蠶群體，觀察膿病二次感染的發(fā)生率。結果顯示，909 頭/m2的飼養(yǎng)密度膿病發(fā)病率高達68.40%，但其試驗設計中，傳染因子種類設置較少，在蠶座傳染試驗設計上，混育群體數(shù)量較少，數(shù)據(jù)處理采用回歸統(tǒng)計分析，未進行偏相關分析。而在絲繭育養(yǎng)蠶過程中，養(yǎng)蠶群體較大，傳染影響因子較多，氣候、飼育密度、混育病蠶數(shù)等對發(fā)病率可能有較大影響。

血液型膿病的高發(fā)生率通常被認為是病蠶在蠶座中發(fā)生了二次感染導致（也稱次生傳染），但低齡蠶期感染病原形成的次生傳染規(guī)律及防控措施有效性等鮮有報道。小蠶共育是廣西蠶桑生產中常見的飼育形式，將蠶兒共育至3齡餉食后售賣，3齡第二口葉轉由農戶飼養(yǎng)。如共育的小蠶存在血液型膿病感染，那么膿病感染率對大蠶飼養(yǎng)產生何種影響尚未可知。基于以上問題，本研究對不同氣候條件、飼養(yǎng)密度、病蠶比例、藥物處理等血液型膿病傳染因子進行調查分析，為防控家蠶血液型膿病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

測試病原來源于廣西河池蠶區(qū)，從發(fā)病膿蠶中分離制備多角體病毒，4.0 ℃保存?zhèn)溆?。供試家蠶品種為兩廣二號。混入病原蠶的制備方法：分別在混入病蠶前84 h、96 h、108 h 在桑葉上涂抹濃度為5×108個/mL 病毒多角體并連續(xù)添食，在同期兩廣二號正常蠶起蠶第二口葉時，挑選出有典型膿病癥狀的病蠶（比如在蠶座中表現(xiàn)狂躁、體色乳白、高節(jié)、亂爬的蠶），用馬克筆標記，作為測試混入源病蠶。Tris、NaCl、EDTA、SDS、TritonX 等試劑為滬試，家蠶核型多角體（RAA）快速檢測試劑盒由廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術推廣站及南寧眾測有限公司聯(lián)合研發(fā)。

1.2 不同飼養(yǎng)氣候環(huán)境混入不同比例病蠶條件下家蠶血液型膿病蠶座內次生傳染率測定

在實驗室模擬廣西蠶區(qū)春、夏、秋季的溫濕度氣候環(huán)境，設置春季（25℃和85%RH）、夏季（33℃和90%RH）、秋季（30℃和80%RH）3 個處理，設空白對照組，每個處理100頭（供試健康蠶+混入病蠶=100），每個處理3 個重復。在三齡起蠶第二口葉各個處理分別混入3%、5%、10%等不同比例的病蠶，混入病蠶30 min后正常喂葉，然后按飼養(yǎng)標準飼養(yǎng)至上蔟，調查蠶期病死蠶、上蔟后第5 d（化蛹后2 d）死籠率情況。病死蠶核定采用常規(guī)鏡檢復核和重組酶介導鏈（RAA 法）復核相結合的方式，精準確定血液型膿病次生傳染病蠶數(shù)量。

1.3 不同飼養(yǎng)密度環(huán)境混入不同比例病蠶條件下蠶座內家蠶血液型膿病次生傳染率測定

在實驗室模擬低密度、標準密度、高密度3 個不同飼養(yǎng)密度，在標準密度基礎上降低33.3%為低密度，在標準密度基礎上提高33.3%即為高密度。根據(jù)地方標準推薦密度作為標準密度，3～5齡3個齡期飼養(yǎng)密度分別定為8 000 頭/m2、3 500 頭/m2、750 頭/m2，在各齡起蠶第二口葉后設定為各齡間密度轉換節(jié)點。

設低密度、標準密度、高密度3個處理，設空白對照組。在三齡起蠶第二口葉各個處理分別混入3%、5%、10%等不同比例的病蠶，按照設定密度條件飼養(yǎng)至上蔟，試驗設計和調查方法參照1.2執(zhí)行。

1.4 不同齡期混入不同比例病蠶條件下蠶座內群體家蠶血液型膿病次生傳染發(fā)病率測定

設3 齡混入病蠶、4 齡混入病蠶、5 齡混入病蠶3個處理，設空白對照組。3 齡期起蠶第二口按3%、5%、10%比例的混入病蠶。試驗設計、飼養(yǎng)和調查方法參照1.2執(zhí)行。

1.5 混入不同比例病蠶條件下用不同藥物處理對家蠶血液型膿病蠶座內次生傳染率測定

在實驗室模擬的秋季環(huán)境及標準密度條件下，設置新鮮石灰粉、“蠶康1 號”、風化石灰粉3 個藥物處理及陽性和空白對照組。每個處理100頭（供試健康蠶+混入病蠶=100），每個處理3個重復。在三齡起蠶第二口葉各個處理區(qū)分別混入3%、5%、10%等不同比例的病蠶，分別用新鮮石灰粉、蠶康1號、風化石灰粉等3種藥物進行蠶體蠶座消毒，每天喂蠶前分別進行蠶體蠶座消毒1次直至上蔟，陽性對照混入病蠶后不用藥物處理。飼養(yǎng)和調查方法參照1.2執(zhí)行。

新鮮石灰粉制備：塊狀生石灰與水混合質量比約為1.0∶0.8，放置自然冷卻后，將石灰粉過篩密封備用。

自然風化石灰制備：將生石灰暴露于在空氣中，待形成松散的白色粉末，收集備用。

1.6 家蠶核型多角體病毒（BmNPV）感染復核

1.6.1 BmNPV鏡檢復核 將血液型膿病典型癥狀死蠶，加入等質量的蒸餾水，用小型勻漿器勻漿，吸取少量勻漿液至載玻片上，用2倍檢測液體積的50%乙醇處理1 min，制成樣品，16×40 倍光學顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)病毒多角體，則記錄為病毒再感染蠶體。否則采用RAA 快速檢測試劑盒（杭州眾測生物科技有限公司）進行檢查復核。

1.6.2 BmNPV 的RAA 快速檢測復核 將未見血液型膿病典型癥狀死蠶，取病死蠶勻漿（方法同1.6.1），加入檢測液3 倍體積的裂解液（100 mM Tris-HCl pH 8.0，10 mM EDTA pH 8.0，2.0 M NaCl，0.1 M Na2CO3，1%SDS，0.1 mg/mL RnaseA），振蕩混勻，常溫孵育5～8 min 釋放DNA，吸取上清液待用，作為RAA核酸檢測的DNA樣本。

按照家蠶血液型膿病核酸測試劑盒（RAA 熒光法）使用說明進行測試。每次測試分別用目標基因DNA質粒和蒸餾水設置陽性對照與陰性對照。

1.7 數(shù)據(jù)矯正與分析

對測定所得數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 的“單因素ANOVA 檢驗”進行顯著性分析，“偏相關”進行因子相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同氣候環(huán)境混入不同比例病蠶蠶座內次生傳染發(fā)病情況分析

在不同溫濕度（模擬不同季節(jié)）飼養(yǎng)環(huán)境混入不同比例病蠶，蠶期及蛹期第5天血液型膿病發(fā)生結果（圖1）?；烊?%的病蠶，蠶期發(fā)病率為春季22.68%＜秋季29.55%＜夏季40.20%，差異達到極顯著水平；蛹期血液型膿病發(fā)病率也呈春季（25℃和85%）10.65%＜秋季（30℃和80%）13.75%＜夏季18.90%趨勢，發(fā)病率隨溫濕度升高而增大，其中夏季與春季、秋季的差異均達到顯著水平?；烊?%、10%的病蠶發(fā)病率也呈現(xiàn)同樣趨勢。預示著在蠶群體中已有個體被感染情況下，高溫多濕環(huán)境是誘導和加快蠶座內次生傳染發(fā)病的重要因子，與實際生產中6—8月家蠶血液型膿病率高相吻合。

從圖1 還可看出，秋季混入3%、5%、10%不同比例病蠶時，蠶期蠶座內次生發(fā)病率分別為29.55%、45.96%、63.33%，差異達顯著水平；蛹期發(fā)病率也分別達13.75%、19.65%、19.63%。春季、夏季混入不同比例病蠶發(fā)病率也有類似趨勢，表明家蠶血液型膿病呈現(xiàn)很強的蠶座內群體次生傳染力，混入感染病蠶個體比例越高，蠶期及蛹期次生傳染發(fā)病越嚴重。因此，家蠶血液膿病防控應重視減少源頭病原的感染與防控。

圖1 不同氣候環(huán)境混入不同比例的蠶座內血液型膿病次生傳染率

2.2 不同飼養(yǎng)密度混入不同比例病蠶蠶座內群體次生傳染發(fā)病情況分析

家蠶不同飼養(yǎng)密度混入不同比例病蠶，蠶期及蛹期第5 天血液型膿病發(fā)生結果見（圖2）?；烊?%的病蠶，蠶期發(fā)病率呈現(xiàn)低密度25.09%＜標準密度29.21%＜高密度35.40%趨勢，高密度與標準密度、低密度差異達到顯著水平；標準密度發(fā)病率雖然高于低密度，但未達到顯著水平。蛹期發(fā)病率也呈低密度9.28%＜標準密度12.37%＜高密度15.12%趨勢，發(fā)病率隨密度升高而增加，但差異不顯著?；烊?%、10%病蠶發(fā)病率也呈現(xiàn)類似趨勢。該結果表明家蠶血液型膿病蠶座內群體次生傳染發(fā)病與蠶座密度有密切關系，蠶座密度越大，次生傳染發(fā)病率越高，推測原因是因為蠶頭密度過高，家蠶食下病毒污染葉的機會較大，還有蠶胸、腹足勾爪相互抓傷，增加病毒創(chuàng)傷感染的機率，同時蠶頭密度過高增加健康蠶與病蠶接觸的概率，增加傳染風險。

從圖2還可看出，低密度（標準密度降低33.3%）混入3%、5%、10%不同比例病蠶時，蠶期蠶座內次生傳染發(fā)病率分別為25.09%、38.60%、54.07%，差異達顯著水平；蛹期發(fā)病率也分別達9.28%、12.98%、14.07%，混入10%病蠶與混入3%病蠶的差異達到顯著水平。標準密度、高密度混入不同比例病蠶其發(fā)病率也呈現(xiàn)類似趨勢。該結果進一步表明家蠶血液型膿病呈現(xiàn)很強的蠶座傳染，混入感染病蠶個體越多，蠶期及蛹期次生傳染發(fā)病越嚴重。

圖2 不同飼養(yǎng)密度混入不同比例病蠶蠶座中血液型膿病次生傳染率

2.3 不同齡期混入不同比例病蠶蠶座內群體次生傳染發(fā)病情況分析

不同齡期混入不同比例病蠶，蠶期及蛹期第5 d血液型膿病發(fā)生結果見圖3?；烊?%的病蠶，蠶期發(fā)病率呈現(xiàn)5 齡（11.00%）＜4 齡（18.90%）＜3 齡29.55%趨勢，差異達到顯著水平；蛹期發(fā)病率5 齡（4.47%）＜4齡（11.00%）＜3齡（13.75%），其中3齡混入與5 齡混入的發(fā)病率差異達到顯著水平?；烊?%、10%的病蠶其發(fā)病率也呈現(xiàn)類似趨勢。預示著家蠶血液型膿病蠶座內群體次生傳染發(fā)病與蠶被感染齡期有密切關系，被感染齡期越小，次生傳染發(fā)病率越高。

從圖3 還可看出，3 齡期混入3%、5%、10%病蠶時，蠶期蠶座內次生發(fā)病率分別為29.55%、45.96%、63.33%，差異達顯著水平；蛹期發(fā)病率也分別達13.75%、16.49%、19.63%，其中混入10%病蠶與混入3%病蠶其發(fā)病率差異達顯著水平。4齡期、5齡期混入不同比例病蠶其發(fā)病率也有類似趨勢。該結果進一步表明家蠶血液型膿病呈現(xiàn)很強的蠶座內群體次生傳染發(fā)病，只要有傳染源存在，就會形成傳播鏈，迅速傳播感染，蠶齡期越小，次生傳染發(fā)病率越高。

圖3 不同齡期混入不同比例病蠶蠶座中血液型膿病累計發(fā)生曲線

2.4 混入不同比例病蠶后不同藥物處理對蠶座內群體次生傳染發(fā)病情況分析

不同藥物處理蠶期及蛹期第5 d 血液型膿病防控效果結果見圖4。在3 齡混入病蠶后，不同藥物處理的防控效果表現(xiàn)為新鮮石灰粉80.24%＞“蠶康1號”67.44%＞自然風化石灰粉41.86%，差異達顯著水平。4齡、5齡混入病蠶后，不同藥物處理也呈現(xiàn)類似趨勢。該結果表明防控藥物介入可降低次生傳染發(fā)病率，但不同藥物防控效果不一樣，如本試驗中新鮮石灰粉和“蠶康1 號”兩種藥物均能顯著降低血液型膿病發(fā)病率。

從圖4 還可看出，新鮮石灰粉防控效果，呈現(xiàn)混入3%病蠶（80.24%）＞混入5%病蠶（51.91%）＞混入10%病蠶（49.12%）的趨勢，差異達到顯著水平?！靶Q康1 號”、風化石灰粉防控效果也呈現(xiàn)類似趨勢。該結果表明隨著蠶群體內被感染病蠶個體增加，形成多點不同時期發(fā)病的多條傳播鏈，如果每天只施用1次的藥物處理，難以有效切斷傳播鏈。因此，在生產上發(fā)現(xiàn)血液型膿病感染發(fā)病后，應注意觀察蠶的發(fā)育情況，及時撿出病死蠶并增加施用藥物次數(shù)，以提升防控效果。

圖4 不同病蠶混入、不同藥物處理的蠶座血液型膿病防控效果曲線

2.5 各影響因子與群體中血液型膿病次生傳染發(fā)病的偏相關分析

利用SPSS 25.0 對各測試因素進行偏相關分析，獲得的數(shù)據(jù)顯示（表1），相關性最高的為“病蠶比例”，為0.603，其次是“混入齡期（時長）”，為0.393，第三是“藥物處理”，為-0.381，之后是“飼養(yǎng)季節(jié)”，為0.232和“飼養(yǎng)密度”，為0.221。即影響家蠶群體血液型膿病次生感染的首要因素是病蠶混入比例，其次是起始感染齡期，第三是藥物處理。其中前兩者顯著正相關，而藥物處理呈顯著負相關。

表1 不同因子與家蠶群體血液型膿病發(fā)病率的偏相關分析

3 討論

本研究通過蠶座中病血液型膿病次生感染情況，探究不同因子對家蠶“兩廣二號”發(fā)病情況的影響，明確該病在蠶座中的傳染規(guī)律。

在不同氣候（模擬不同季節(jié)），混入同一比例的病蠶，蠶座內次生傳染發(fā)病率呈現(xiàn)春季＜秋季＜夏季的趨勢，差異達到極顯著水平，在蠶群體內已有個體被感染情況下，高溫多濕環(huán)境是誘導和加快蠶座內次生傳染發(fā)病的主要因子，在生產上也得到了證實［2，4，6］。

在同一氣候環(huán)境下，蠶座內次生傳染發(fā)病率呈現(xiàn)混入病蠶比例越高發(fā)病率越高的趨勢，差異達顯著水平。表明家蠶血液型膿病呈現(xiàn)很強的蠶座內群體次生傳染力，混入感染病蠶個體比例越高，次生傳染發(fā)病越嚴重，偏相關分析其與發(fā)病率的相關系數(shù)最高，表明控制病蠶數(shù)量應是血液型膿病早期防控中最重要的環(huán)節(jié)。

不同飼養(yǎng)密度飼養(yǎng)條件下，混入同一比例的病蠶，蠶座內次生傳染發(fā)病率呈現(xiàn)低密度＜標準密度＜高密度的趨勢，高密度與標準密度和低密度差異達到顯著水平，但相關系數(shù)在所測影響因子中排名最后。表明家蠶血液型膿病蠶座內群體傳染與蠶座密度有一定關系，過密的蠶座使血液型膿病傳染發(fā)病率更加嚴重，生產上也存在這種趨勢［5，7］。

不同齡期混入病蠶的試驗中，蠶座內次生傳染發(fā)病率呈現(xiàn)出5 齡＜4 齡＜3 齡的趨勢，差異達顯著水平，且偏相關性分析顯示相關系數(shù)僅次于病蠶混育率。表明家蠶群體血液型膿病次生傳染發(fā)病率與被感染齡期有密切關系，齡期越大發(fā)病越少，表明蠶病防控中應重視小蠶期的病原清除與隔離，以降低血液型膿病危害。

不同藥物對病蠶混育率的防控效果有差異，防控效果新鮮石灰粉＞蠶康1號＞自然風化石灰粉，偏相關分析差異達顯著水平，表明防控藥物介入可降低次生傳染發(fā)病率，但不同藥物防控效果不一樣，如本試驗中新鮮石灰粉和蠶康1 號兩種藥物均能顯著降低血液型膿病發(fā)病率［8］。

在相同藥物處理條件下，隨著初始混入病蠶比例增加，防控效果呈現(xiàn)下降的趨勢，偏相關分析差異達到顯著水平，表明隨著蠶群體內被感染病蠶個體比例增加，多點散發(fā)不同時期發(fā)病的多條傳播鏈，如果每天只施用1次藥物，很難完全有效切斷所有傳播鏈，會出現(xiàn)病原“逃逸”現(xiàn)象，增加擴散傳染的風險，所以在藥物防治上，增加施用次數(shù)能夠減輕危害。

4 結論

通過對廣西地區(qū)“兩廣二號”血液型膿病傳染因子進行研究并且首次采用偏相關分析，認為，蠶群體內有病蠶，高溫多濕環(huán)境是誘導和加快蠶座內次生傳染發(fā)病的主要因子；家蠶血液型膿病呈現(xiàn)很強的蠶座內群體次生傳染力，群體中病蠶比例越高，蠶座傳染越嚴重；蠶座密度越高，次生傳染發(fā)病率隨之提升；家蠶群體血液型膿病次生傳染發(fā)病率與被感染齡期有密切關系。偏相關分析結果顯示，病蠶混育率是最主要的影響因子，其次是混育齡期，第三是使用藥物，第四是飼養(yǎng)季節(jié)，最后是飼養(yǎng)密度。每天施用一次藥物仍然會出現(xiàn)病原逃逸的現(xiàn)象，宜增加施藥次數(shù)減輕危害。