白及組培苗高效繁育技術(shù)研究*

吳巧芬，夏 科，趙志國，馬曉雅，仇 碩,**

(1.廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所，廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點實驗室，廣西桂林 541006；2.桂林理工大學旅游與風景園林學院，廣西桂林 541006)

白及(Bletillastriata)是蘭科白及屬(Bletilla)多年生草本植物，花紫紅色或粉紅色，又名白芨或紫花三叉白芨，別名白根、地螺絲、羊角七等[1]，生于海拔100-3 200 m的常綠闊葉林下、櫟樹林或針葉林下、路邊草叢或巖石縫中，具有很高的藥用價值和觀賞價值[1]。藥品“白及”即來源于白及的干燥塊莖，其性微寒，味苦、甘，具有收斂止血、補肺、消腫生肌之功效，外治創(chuàng)傷出血、燙傷和療瘡，內(nèi)治吐血、肺病、咳血、慢性胃潰瘍以及腫瘤等[2-6]?，F(xiàn)代醫(yī)學證明，白及還具有較強的抗氧化和抗衰老作用[7]，可消炎、止癢、消退色斑、消除痤瘡、防止粗糙、抗凍防裂[2]，還可作糊料，制作高級香煙的煙蒂以及釀酒等[8]。此外，白及葉態(tài)優(yōu)美、花型獨特、花大色艷，也可用來布置花壇和室內(nèi)觀賞等。

隨著白及應(yīng)用越來越廣，市場供不應(yīng)求，種苗的繁育及栽培技術(shù)尤為關(guān)鍵，而利用無菌播種技術(shù)快繁種苗，對于規(guī)?；N植白及具有重要意義。目前生產(chǎn)中主要通過“無菌播種-原球莖及叢生芽誘導(dǎo)-叢生芽生根及結(jié)鱗莖-移栽馴化”的技術(shù)體系進行快繁種苗[9,10]。然而，在叢生苗壯苗及結(jié)鱗莖過程中，經(jīng)常需要4-5個月的培養(yǎng)，周期太長，且成本過高[11-13]。通過優(yōu)化白及組培快繁體系來縮短培養(yǎng)時間、提高種苗質(zhì)量，有利于白及規(guī)?；a(chǎn)。油菜素內(nèi)酯(BR)具有高活性、廣譜、無毒等特點，常被用于植物組培或栽培研究，能有效提高藥用植物產(chǎn)量和品質(zhì)，而且無殘留[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)，適當濃度的BR可以促進貝母和香蕉試管苗鱗莖的生長發(fā)育[17,18]；外源噴施BR可以同時提高栽培半夏、甘草等中藥材的產(chǎn)量和藥用成分的質(zhì)量[16,19]；噴施一定濃度的BR也能夠促進白及幼苗假鱗莖快速生長發(fā)育[20]，然而外源BR對白及組織快繁及移栽馴化的影響目前還未見相關(guān)報道。因此，本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，以白及蒴果為外植體，通過研究不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基和不同生長調(diào)節(jié)劑對白及叢生芽誘導(dǎo)、叢生芽生根及結(jié)鱗莖影響，以及不同移栽基質(zhì)對白及組培苗移栽馴化成活率的影響，并結(jié)合噴施BR，對馴化苗進行一年兩季栽培管理，觀察和統(tǒng)計白及組培苗生長情況，建立白及組培苗高效繁育與栽培技術(shù)體系，為白及規(guī)?；耘嗵峁├碚撝?。

1 材料與方法

1.1 材料

供試白及蒴果于2017年10-11月采自廣西植物研究所白及種質(zhì)圃中，為自然授粉結(jié)實的成熟未開裂蒴果。

1.2 方法

1.2.1 白及蒴果消毒

白及蒴果采回后，先用洗潔精清洗表面，再用自來水沖洗至少30 min，然后于超凈臺用75%酒精浸泡1 min，用無菌水沖洗1次，用0.1% HgCl2或5%NaClO浸泡15-30 min，最后用無菌水沖洗至少5次，備用。

1.2.2 無菌播種、原球莖及叢生芽誘導(dǎo)

用解剖刀切開消毒后的蒴果果皮，取出種子接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。設(shè)置不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基：固體1/2 MS、液體1/2 MS、固體MS、液體MS，每組基礎(chǔ)培養(yǎng)基均添加6-芐基腺嘌呤(6-BA) 1.0 mg/L、萘乙酸(NAA) 0.1 mg/L。在以上試驗效果最佳的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L，設(shè)置不同濃度的BR (0 mg/L、0.01 mg/L、0.02 mg/L)。上述培養(yǎng)基均加蔗糖20 g/L，pH值調(diào)至5.8，每個處理30瓶，每瓶30-35株，每個處理重復(fù)3次。播種后置于(25±2)℃培養(yǎng)室暗培養(yǎng)，待種子萌動變綠后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)至誘導(dǎo)出原球莖，然后繼續(xù)光照培養(yǎng)至誘導(dǎo)長出2-3片葉子、高1.5-2.5 cm的叢生芽。光照培養(yǎng)條件：溫度(25±2)℃，光照強度1 500-2 000 lux，光照時間12 h/d。統(tǒng)計叢生芽的誘導(dǎo)時間及生長狀態(tài)。

1.2.3 叢生芽生根及結(jié)鱗莖培養(yǎng)

將叢生芽轉(zhuǎn)接到生根及結(jié)鱗莖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為MS+激動素(KT) 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，設(shè)置不同濃度的6-BA (0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L)，篩選出最適合白及生根和結(jié)鱗莖的6-BA濃度。將最適合濃度的6-BA加入培養(yǎng)基MS + KT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L中，設(shè)置不同濃度的BR (0 mg/L、0.02 mg/L、0.04 mg/L、0.08 mg/L)。上述培養(yǎng)基均加香蕉100 g/L，蔗糖30 g/L，瓊脂5.0 g/L，活性炭1.0 g/L，pH值調(diào)至5.8，每個處理30瓶，每瓶30-35株，每個處理重復(fù)3次。培養(yǎng)條件：溫度(25±2)℃，光照強度1 500-2 000 lux，光照時間12 h/d。90-120 d后統(tǒng)計叢生芽的結(jié)鱗莖率、鱗莖直徑、培養(yǎng)時間及生長狀態(tài)。

1.2.4 移栽馴化

2019年3-4月將結(jié)鱗莖試管苗移出培養(yǎng)室，帶瓶煉苗15-30 d，洗凈根部，晾干水分，移栽到基質(zhì)中，基質(zhì)類型：基質(zhì)Ⅰ(泥炭土∶珍珠巖∶蛭石=2∶2∶1)、基質(zhì)Ⅱ(黃壤土∶泥炭土∶蛭石∶珍珠巖=4∶1∶1∶1)、基質(zhì)Ⅲ(樹皮∶椰絲=1∶1)、基質(zhì)Ⅳ(黃壤土)、基質(zhì)Ⅴ(黃壤土∶河沙=1∶1)和基質(zhì)Ⅵ(黃壤土∶椰絲=1∶1)，以上基質(zhì)配比均為體積比，每個處理300株，重復(fù)3次。置于塑料大棚內(nèi)，夏季采用70%遮陽網(wǎng)遮陰。移栽馴化30 d后，統(tǒng)計移栽成活率。

1.2.5 移栽馴化苗一年兩季栽培

從1.2.4節(jié)篩選出移栽成活率最高的基質(zhì)，以2019年3-4月移栽到該基質(zhì)中的組培苗為材料，2019年4-5月開始一年兩季栽培試驗。(1)第一季栽培管理：組培苗移栽30 d后，施1次奧綠緩釋肥；培養(yǎng)90 d后，分別噴施0.02 mg/L、0.04 mg/L及0.08 mg/L的BR，每半個月噴一次，連續(xù)噴2次；9月上旬開始控制淋水次數(shù)，使馴化苗盡早進入休眠狀態(tài)。(2)第二季栽培管理：11月上旬恢復(fù)淋水，施1次奧綠緩釋肥；45 d后，分別噴施0.02 mg/L、0.04 mg/L及0.08 mg/L的BR，每半個月噴一次，連續(xù)噴2次，同時利用紅外線燈保持大棚內(nèi)溫度在15℃以上，補光至12 h以上，光照強度1 500-3 000 lux；次年2月取消補溫補光措施，控制淋水次數(shù)，使馴化苗再次進入休眠狀態(tài)；3月中旬恢復(fù)正常淋水，施1次奧綠緩釋肥；4月下旬-5月出圃下地。以一年一季常規(guī)管理為對照，每個處理300株，重復(fù)3次。統(tǒng)計鱗莖直徑、株高和分蘗數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 白及種子萌發(fā)、原球莖及叢生芽誘導(dǎo)

白及種子經(jīng)過7-10 d暗培養(yǎng)后逐漸變綠萌發(fā)，再經(jīng)過40-75 d光照培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成原球莖及叢生芽。白及原球莖及叢生芽在不同培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)時間及生長狀態(tài)見表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當6-BA和NAA分別為1.0 mg/L、0.1 mg/L時，固體1/2 MS和MS對原球莖及叢生芽誘導(dǎo)差別不大，但因生長密集而難分開，轉(zhuǎn)接時費時費力且會增加污染概率[圖1：(a)(b)]；液體1/2 MS和MS對白及種子萌發(fā)無明顯差別，但與固體1/2 MS和MS相比更有利于叢生芽的生長發(fā)育，誘導(dǎo)時間縮短10-15 d，且轉(zhuǎn)接方便快捷。當基本培養(yǎng)基為液體1/2 MS，6-BA和NAA分別為1.0 mg/L和0.1 mg/L時，添加0.01 mg/L的BR能更有效促進叢生芽誘導(dǎo)[圖1：(c)(d)]，但當BR增加到0.02 mg/L，叢生芽長勢相對較差，葉色變淡黃。綜合分析可知，白及種子萌發(fā)、原球莖及叢生芽最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+BR 0.01 mg/L+蔗糖20 g/L液體培養(yǎng)基，誘導(dǎo)時間50-60 d，叢生芽生長狀態(tài)好。

表1 培養(yǎng)基類型及激素配比對白及原球莖及叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)

(a) Aseptic sowing 60 d of B.striata on solid 1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+sucrose 20 g/L;(b) Aseptic sowing 75 d of B.striata on solid 1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+sucrose 20 g/L;(c) Aseptic sowing 50 d of B.striata on liquid 1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+BR 0.01 mg/L+sucrose 20 g/L;(d) Aseptic sowing 75 d of B.striata on liquid 1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+BR 0.01 mg/L+sucrose 20 g/L

2.2 生根及結(jié)鱗莖培養(yǎng)基配方的篩選

白及叢生芽在不同培養(yǎng)基中生根及結(jié)鱗莖情況統(tǒng)計見表2。以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，當NAA、KT、BR分別為0.2 mg/L、0.5 mg/L和0 mg/L時，隨著6-BA濃度的增加，結(jié)鱗莖率先升后降，6-BA為1.0 mg/L時，結(jié)鱗莖率最高，為81.5%，叢生苗生長狀態(tài)最好；當6-BA為2.0 mg/L時，結(jié)鱗莖率只有36.5%，直徑也最小，只有3.4 mm，叢生苗長勢較差，瘦弱，但出現(xiàn)很多分蘗，葉色淡黃[圖2：(a)(b)]。當NAA、KT、6-BA分別為0.2 mg/L、0.5 mg/L和1.0 mg/L時，添加0.02-0.08 mg/L BR，叢生苗發(fā)育均更快，培養(yǎng)時間縮短；但隨著BR濃度的升高，結(jié)鱗莖率降低，生長狀態(tài)也逐漸變差[圖2(c)]。綜合分析可知，白及生根和結(jié)鱗莖最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+BR 0.02 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 0.5 mg/L+香蕉100 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5.0 g/L+活性炭1.0 g/L，結(jié)鱗莖率達到95.7%，鱗莖直徑為6.3 mm，培養(yǎng)時間90-110 d，叢生苗生長狀態(tài)最好，苗壯，葉深綠。

表2 白及生根及結(jié)鱗莖培養(yǎng)

(a) MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 0.5 mg/L+banana 100 g/L+sucrose 30 g/L+agar 5.0 g/L+activated carbon 1.0 g/L;(b) MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 0.5 mg/L+banana 100 g/L+sucrose 30 g/L+agar 5.0 g/L+activated carbon 1.0 g/L;(c) MS+6-BA 1.0 mg/L+BR 0.02 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 0.5 mg/L+banana 100 g/L+sucrose 30 g/L+agar 5.0 g/L+activated carbon 1.0 g/L

2.3 移栽基質(zhì)對白及組培苗移栽馴化的影響

白及試管苗移栽到不同基質(zhì)30 d后統(tǒng)計成活率(表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，泥炭土、珍珠巖和蛭石(2∶2∶1)的組合物移栽成活率最高，達到96.33%，移栽馴化情況見圖3(a);其次是樹皮和椰絲(1∶1)的組合物達到95.56%,移栽馴化情況見圖3(b);黃壤土、泥炭土、蛭石和珍珠巖(4∶1∶1∶1)的組合物為92.56%；而單獨的黃壤土成活率很低，僅有35.56%，黃壤土配河沙(1∶1)和黃壤土配椰絲(1∶1)成活率分別達到63.34%和75.56%。

(a) SubstrateⅠ(Peat soil∶Perlite∶Vermiculite=2∶2∶1);(b) Substrate Ⅲ(Bark∶Shredded coconut=1∶1)

表3 白及組培苗移栽馴化結(jié)果

2.4 移栽馴化苗一年兩季培育

白及移栽馴化苗的培育方式及生長狀況見表4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3-4月移栽到基質(zhì)Ⅰ的組培苗，在大棚內(nèi)經(jīng)一年一季(對照)常規(guī)培育管理，一個發(fā)育周期后，馴化苗鱗莖直徑可以達到1.15 cm，株高11.6 cm，植株整體長勢相對較弱，直接定植到大田中，恢復(fù)生長比較慢；而經(jīng)過一年兩季的栽培管理，即12個月左右完成兩次休眠和發(fā)芽，相比于一年一季栽培管理，馴化苗鱗莖明顯變大、株高變高，分蘗數(shù)也變多，植株整體長勢也相對較好。噴施BR 0.02 mg/L處理效果最好，鱗莖直徑達到1.64 cm，株高達到19.6 cm，分蘗1.66個。

表4 白及移栽馴化苗培育方式及生長狀況

3 討論

白及具有較高的藥用和觀賞價值，建立組培苗高效繁育體系對其產(chǎn)業(yè)規(guī)?；陵P(guān)重要。常規(guī)固體培養(yǎng)基進行白及無菌播種時，培養(yǎng)環(huán)節(jié)多、周期長、成本高[9-11]，而采用液體培養(yǎng)基進行無菌播種，具有外植體與營養(yǎng)物充分接觸與吸收等優(yōu)勢[21]，已被應(yīng)用于白及無菌播種。張宇思等[22]研究顯示液體培養(yǎng)基中白及原球莖誘導(dǎo)更快、質(zhì)量更好。本研究對白及無菌播種技術(shù)進行優(yōu)化，構(gòu)建了“白及無菌播種、原球莖及叢生芽誘導(dǎo)-白及生根及結(jié)鱗莖”兩步快繁體系。研究結(jié)果顯示，白及叢生芽在液體培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)時間比在固體培養(yǎng)基中縮短10-15 d，該結(jié)果與張宇思等[22]、王楷等[23]的研究結(jié)果一致。油菜素內(nèi)酯可促進植物細胞的伸長與分裂、提高光合作用，能誘導(dǎo)愈傷組織形成與分化，促進試管苗的生長發(fā)育[24,25]。本研究在培養(yǎng)基中添加油菜素內(nèi)酯，促進了叢生芽的發(fā)育，整個過程僅需140-170 d即可獲得優(yōu)質(zhì)組培苗，其繼代成活率達到100%。添加油菜素內(nèi)酯能有效提高白及種苗快繁的效率。

白及組培苗的移栽馴化是白及組培快繁階段和大田生產(chǎn)階段的過渡時期，而馴化苗質(zhì)量影響大田移栽成活率[26,27]。一年兩季栽培管理可縮短植物生長年限，提高農(nóng)作物產(chǎn)量[28,29]。本研究通過控制外界條件使白及組培苗12個月內(nèi)完成兩次休眠和發(fā)芽，即完成一年兩季栽培管理，該管理措施下的白及生物量顯著高于一年一季栽培，其中噴施0.02 mg/L油菜素內(nèi)酯的白及組培苗質(zhì)量最優(yōu)，其鱗莖直徑、株高和分蘗數(shù)分別是一年一季栽培管理組培苗的1.43倍，1.69倍和1.66倍。因此，本研究白及組培苗一年兩季栽培管理不僅縮短了白及育苗周期，還提高了種苗質(zhì)量。

4 結(jié)論

白及種子萌發(fā)、原球莖及叢生芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基配方為1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+BR 0.01 mg/L+蔗糖20 g/L；叢生芽生根及結(jié)鱗莖培養(yǎng)最適培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.0 mg/L+BR 0.02 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 0.5 mg/L+香蕉100 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5.0 g/L+活性炭1.0 g/L。叢生苗于春季3-4月移栽，最適宜的移栽基質(zhì)為泥炭土、珍珠巖和蛭石(2∶2∶1，V∶V∶V)的組合物，移栽成活率96.33%。在4-5月上旬至10月下旬以及11月上旬至次年4-5月對白及馴化苗實行一年兩季的栽培管理并結(jié)合噴施0.02 mg/L的BR能明顯提高種苗質(zhì)量。