基于生物信息學方法篩選擴張型心肌病相關(guān)基因并分析潛在藥物

施展，張步春

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一種表現(xiàn)為左室或雙室室腔增大并伴有舒張或收縮功能障礙的心肌病，是引發(fā)心力衰竭、心律失常和猝死的常見心肌病[1]。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)多個編碼肌節(jié)蛋白、細胞骨架、核膜、肌膜、離子通道和細胞間連接分子的相關(guān)基因參與了DCM的發(fā)病機制[2]。編碼肌聯(lián)蛋白(TTN)的基因突變被認為是DCM的最常見原因。此外，LMNA基因(核纖層蛋白)、FLNC(絲蛋白C)、Des(結(jié)蛋白)、PLN(磷蛋白)、SCN5A等位基因突變已被確認為DCM的惡性原因[2]。但DCM患者的個體化風險預測和治療仍然具有挑戰(zhàn)性，根據(jù)當前指南建議的最佳藥物治療構(gòu)成了DCM治療的基礎(chǔ)，然而，目前對DCM心衰的治療與一般的心衰治療沒有什么不同，疾病修飾藥物對DCM離子和結(jié)構(gòu)改變的影響還沒有得到很好的描述[1,3]。因此，得益于分子生物學及統(tǒng)計學的發(fā)展，本研究將運用生物信息學手段基于GEO數(shù)據(jù)庫著重于DCM的差異表達基因及由此探討可能的治療方案。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)材料收集 從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載了基于GPL570平臺的2個基因芯片數(shù)據(jù)集(GSE17800和GSE19303)，其中GSE17800數(shù)據(jù)集包括接受免疫吸附后行IA/IgG治療之前的DCM活檢標本40例和用于對照的活檢標本8例；GSE19303包括接受IA/IgG治療之前和之后6個月收集的33對DCM患者樣本和8例用于對照的活檢標本。為了得到的結(jié)果更具有參考價值，本研究的標準僅納入未經(jīng)IA/IgG治療的DCM患者心肌樣本和正常心臟的心肌樣本，共得到來源于GSE17800數(shù)據(jù)集的接受IA/IgG治療之前的DCM患者標本40例和正常心臟標本8例，以及來源于GSE19303數(shù)據(jù)集的接受IA/IgG治療之前DCM患者標本33例及正常心臟標本8例。

1.2 數(shù)據(jù)的處理與基因篩選 對上述2個數(shù)據(jù)集運用R語言分別進行主成分分析(PCA)，對比組別間的分布情況，并設(shè)置|Log2FC|>1，adj.P<0.05作為篩選條件分析各數(shù)據(jù)集并確定DEGs。得到的2張基因芯片中共同DEGs會包括上下調(diào)不一致的基因，如果直接將2張芯片得到的共同DEGs混在一起進行分析，可能會混入假陽性結(jié)果，且相對于正常樣本表達上調(diào)的基因顯然更具有意義，因此我們只分析共同差異基因中表達上調(diào)的基因。運用R語言對上述2個數(shù)據(jù)集獲得的DEGs分別繪制熱圖，并對2個數(shù)據(jù)集篩選得到的差異表達上調(diào)基因運用韋恩圖(Venn Diagramm)取交集，獲得與DCM相關(guān)的候選差異基因。

1.3 共同DEGs的GO、KEGG及GSEA富集分析 提取上述共同的上調(diào)DEGs，運用R語言進行GO功能分析和KEGG通路分析，設(shè)置P<0.1和adj.P<0.2為篩選條件，篩查差異基因的主要富集功能和通路,并據(jù)此進行了可視化，并對2張芯片分別進行了GESA富集分析探究DCM的主要信號通路。

1.4 共同的DEGs的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析(PPI) 運用STRING在線數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)對上述共同DEGs進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析(PPI)，并運用Cytoscape軟件對其進行分析，運用MCODE插件篩選出重要基因。

1.5 差異基因-藥物相互作用分析 將上述得到的差異基因輸入DGIdb(https://dgidb.genome.wustl.edu/)在線數(shù)據(jù)庫挖掘潛在靶向治療藥物，并將得到的差異基因與GeenCards(https://www.genecards.org/)在線數(shù)據(jù)庫中DCM相關(guān)基因取交集，得到相關(guān)基因。

2 結(jié)果

2.1 DCM相關(guān)的差異基因的篩選 經(jīng)過篩選，我們得到來源于GSE17800數(shù)據(jù)集的接受IA/IgG治療之前的DCM患者標本40例和正常心臟標本8例，來源于GSE19303數(shù)據(jù)集的接受IA/IgG治療之前DCM患者標本33例及正常心臟標本8例。采用R語言進行主成分分析(PCA),通過PCA圖觀測樣本分組間聚類情況。見圖1A、1B。2組數(shù)據(jù)集出現(xiàn)了高度一致的聚類結(jié)果。通過R語言我們分別篩選出了2組數(shù)據(jù)集的差異基因。

1A GSE17800主成分分析圖 1B GSE19303主成分分析圖

上述結(jié)果包括有關(guān)DCM的上調(diào)基因，經(jīng)過篩選，我們從GSE17800數(shù)據(jù)集中得到表達上調(diào)的DEGs68個，GSE19303數(shù)據(jù)集中得到表達上調(diào)的表達基因65個，將這些根據(jù)篩選條件得到的有意義的結(jié)果用熱圖進行展示，由此可以看出各組樣本的差異基因表達較為一致。見圖2A、2B。繪制韋恩圖得到2個數(shù)據(jù)集的共同差異表達上調(diào)基因，得到 60個與DCM相關(guān)的共同差異表達上調(diào)基因。見圖2C。

2A GSE17800熱圖 2B GSE19303熱圖 2C 表達差異上調(diào)基因韋恩圖

2.2 DCM的功能聚類-GSEA分析 為了進一步探索DCM相關(guān)的信號通路，我們分別對GSE17800和GSE19303進行了GSEA富集分析，根據(jù)FDR<0.05 和adj.P<0.05篩選出與DCM相關(guān)的通路，從數(shù)據(jù)集GSE17800得到了相關(guān)信號通路42條，從數(shù)據(jù)集GSE19303得到了相關(guān)信號通路12條，僅選擇P值最小的5條通路并據(jù)此繪制了山巒圖。見圖3。從圖3中可以看出，GSE17800數(shù)據(jù)集表明DCM主要與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、早期雌激素反應、肌發(fā)生、紫外線反應、血管生成等有關(guān)。GSE19303數(shù)據(jù)集表明DCM主要與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、凝血、干擾素α應答、氧化磷酸化、肌發(fā)生等有關(guān)。由此我們可以看出上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、肌發(fā)生等可能與DCM有著密切的關(guān)聯(lián)。

3A GSE17800山巒圖 3B GSE19303山巒圖

2.3 共同DEGs的GO與KEGG富集分析 對篩選得到的60個共同DEGs進行GO富集分析，得到生物學過程(BP)共有39條，細胞組分(CC)共有5條，分子功能(MF)共有2條，結(jié)果顯示：差異蛋白在生物學過程方面主要與藥物反應、神經(jīng)遞質(zhì)運輸正反饋調(diào)節(jié)過程、藥物轉(zhuǎn)運、cGMP-PKG信號通路有關(guān)；細胞組成主要分布于胞外囊泡、突觸囊泡、胞外囊泡膜和突觸囊泡膜；分子功能主要與精氨酸N甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性相關(guān)。見圖4。對上述差異基因進行KEGG富集分析，共得到4條通路，分析結(jié)果顯示：DCM與血管平滑肌收縮、產(chǎn)熱、朊病毒、 cGMP-PKG信號通路有關(guān)。見圖5。

圖4 GO富集分析 圖5 KEGG富集分析

2.4 共同DEGs的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及模塊分析 對得到的共同DEGs利用在線網(wǎng)站STRING進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并將得到的結(jié)果輸入Cytoscape 軟件進行可視化分析與篩選，得到圖6A，并運用MCODE插件進行聚類分析，得到2個得分較高的富集序列，并得到22個重要節(jié)點。見圖6B、6C。

圖6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 差異基因-藥物相互作用分析 將上述得到的22個差異基因輸入DGIdb數(shù)據(jù)庫，獲得了治療DCM的3種潛在藥物氯噻酮、氨氯地平和奈西利肽。將得到的差異基因與GeenCards在線數(shù)據(jù)庫中DCM相關(guān)基因取交集得到2個相關(guān)基因，即NPPA和NPPB。

3 討論

既往研究[4]認為DCM的發(fā)生和發(fā)展與一系列復雜的調(diào)節(jié)因子和信號通路有關(guān)，這些因素包括高血糖、胰島素抵抗、線粒體功能障礙、內(nèi)皮功能障礙、過度氧化應激/活性氧(ROS)積累、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)升高、炎癥、細胞外基質(zhì)(ECM)沉積、纖維化、細胞內(nèi)鈣處理受損、腎血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活、心臟自主神經(jīng)病變、微血管功能障礙以及心臟代謝異常。然而DCM發(fā)病機制復雜，對其發(fā)病分子機制和特異性信號通路尚缺乏系統(tǒng)深入研究?；谏镄畔W角度來研究疾病的分子機制具有重要意義，有助于設(shè)計藥物的新分子靶點或者為疾病的早期診斷提供特異標志物。

本研究選取了來源于GEO數(shù)據(jù)庫的2塊芯片，GSE17800和GSE19303，以接受IA/IgG治療前的DCM患者心肌樣本為實驗組，正常心臟的心肌樣本為對照組，篩選出上調(diào)的相關(guān)差異基因60個，對篩選得到的相關(guān)差異基因進行了GO及KEGG富集分析，結(jié)果表示DCM的發(fā)生發(fā)展主要與胞內(nèi)鈣處理受損與血管舒張的調(diào)控有關(guān)。為了進一步探究DCM發(fā)生發(fā)展的信號通路，因此我們進行了GESA富集分析，得到的結(jié)果表明DCM的發(fā)生發(fā)展極有可能與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、肌發(fā)生相關(guān)。為了進一步探究DCM的可能的治療方案，將所得到的差異基因進行了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，并導入了Cytoscape軟件進行了相關(guān)分析，得到了關(guān)鍵基因22個。

GO分析表明，DCM的發(fā)生發(fā)展與細胞外囊泡有關(guān)。據(jù)報道[5]，Exoc1是胞外囊泡定位所必需的蛋白質(zhì)，在男性擴張型心肌中顯著升高，這與我們得到的生信分析結(jié)果較為一致，對這一過程的研究可能有助于深入了解DCM的發(fā)病機制。KEGG富集分析結(jié)果表明，DCM的發(fā)生發(fā)展與血管平滑肌的收縮密切，與朊病毒密切相關(guān)。實驗[6]表明，DCM患者心肌收縮能力低，容易發(fā)生血栓栓塞癥。組織病理學改變大多是非特異性的，包括心肌細胞肥大和變性，并伴有不同程度的纖維化。其病原學和致病機制涉及基因突變、病毒性心肌炎和自身免疫性疾病。據(jù)此，關(guān)于改善DCM患者的心肌收縮功能及抑制心室重構(gòu)的研究可能有助于提高DCM的治療。其次，結(jié)果表明cGMP-PKG信號通路在DCM的發(fā)生發(fā)展中也有重要的作用。研究[7]表明，內(nèi)皮細胞在內(nèi)皮型一氧化氮合酶(ENOS)的催化作用下合成一氧化氮，然后激活其胞內(nèi)受體--可溶性鳥苷環(huán)化酶(SGC)，導致第二信使環(huán)鳥苷一磷酸(cGMP)的釋放。cGMP進一步激活cGMP依賴的蛋白激酶(PKG)，調(diào)節(jié)許多生理功能。SGC-cGMP-PKG信號被發(fā)現(xiàn)作為一種常見的心臟保護遞質(zhì)發(fā)揮作用，這一途徑參與了糖尿病條件下收縮和舒張期功能障礙的調(diào)節(jié)[8]。越來越多的證據(jù)[8-10]也支持sGC-cGMP-PKG通路在糖尿病心肌病心臟纖維化重構(gòu)、肥厚、氧化應激和細胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。關(guān)于這一通路是否在DCM的發(fā)生發(fā)展中有著同樣至關(guān)重要的作用有待進一步證實。

在GESA富集分析中，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、肌發(fā)生與DCM的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)聯(lián)。我們已知特發(fā)性DCM是一種病因不明的原發(fā)心肌疾病，以心肌細胞丟失和成纖維細胞增多為特征，是心力衰竭的重要原因。間充質(zhì)干細胞(MSCs)是多能的成體干細胞，存在于骨髓微環(huán)境中，在體內(nèi)，MSCs直接注射到梗死心臟被證明可以誘導心肌再生和改善心功能，植入通過產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)誘導大鼠后肢缺血模型的治療性血管生成[6]。因此MSCs移植可能有助于DCM的治療。

將得到的差異基因與GeenCards在線數(shù)據(jù)庫中DCM相關(guān)基因取交集得到2個相關(guān)基因，即NPPA和NPPB。根據(jù)文獻[11]報道，合并心力衰竭的DCM患者會產(chǎn)生低水平的心臟選擇性絲氨酸蛋白酶(corin)，而鈉尿肽前體的裂解和活性形式的生成中有絲氨酸蛋白酶的參與，因此 corin 和鈉尿肽家族的成員作為臨床上心力竭的常用的心臟損傷標志物，可以用來提示DCM失代償期的發(fā)生及心力衰竭癥狀的嚴重程度[11]，與我們得到的生物信息預測結(jié)果相一致。全基因組關(guān)聯(lián)研究證實NPPA是血壓發(fā)育的一個致病因素，心鈉肽(ANP)是由NPPA編碼的一種血管擴張激素，可促進鹽的排泄，而在人類中，ANP水平被認為是鹽敏感性的指標[12]。因此，嚴格限制鈉鹽的攝入量及控制高血壓有可能成為預防DCM發(fā)生發(fā)展的一個重要方法。同時研究[13]發(fā)現(xiàn)，注射用重組人腦利鈉肽治療DCM合并心力衰竭患者可有效降低患者的血清腦利尿鈉肽(BNP)、BNP前體(NT-proBNP)、 血管緊張素II(AngⅡ)等指標，改善心室重構(gòu)。

我們將得到的DEGs輸入DGIdb數(shù)據(jù)庫，獲得了治療DCM的3種潛在藥物，氯噻酮、氨氯地平和奈西利肽作為治療DCM的可能藥物，據(jù)報道[14]，氨氯地平可預防心室受快速刺激時的擴大及舒張期出現(xiàn)限制型充盈的發(fā)生。DCM患者采用倍他樂克聯(lián)合地高辛治療效果顯著，可有效改善患者左心室功能，因此塞氯酮及奈西利肽對左心功能的改善可能有利于DCM的治療[15]。由于上述結(jié)果僅立足于我們生信分析得到的結(jié)果，具體療效應當在臨床藥物試驗中得到進一步驗證。

綜上所述，基于生物信息學方法我們得到了與DCM可能相關(guān)的基因,并將上述候選基因輸入在線藥物驗證數(shù)據(jù)庫，得到了可能的治療藥物氯噻酮、氨氯地平和奈西利肽，為臨床預后的判斷及治療提供有意義的研究線索及方向。有關(guān)DCM的治療是一個個性化的治療方案，應進一步進行臨床試驗進行深入探究。