丙泊酚對孕鼠妊娠晚期睡眠剝奪后子代大鼠海馬區(qū)JAK2/STAT3 信號通路及神經(jīng)炎癥的影響

徐思源 呂靖 魏瓊 金青青 肖靜 李清

人類每日需要睡眠,睡眠不足會影響人類健康,降低機(jī)體免疫力,增加患病風(fēng)險(xiǎn)。尤其對于妊娠期女性,睡眠剝奪的發(fā)生率大大增高［1］。隨之而來的是睡眠剝奪對其造成的多種不良影響,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),妊娠期間MSD 不僅可增加孕婦自身高血壓、糖尿病、產(chǎn)后抑郁、早產(chǎn)等患病風(fēng)險(xiǎn),還可對子代造成多種不良影響［2,3］。有研究指出孕鼠MSD 會引發(fā)子代海馬區(qū)神經(jīng)炎癥及損傷子代認(rèn)知功能［4］。但具體機(jī)制尚不明確,因此有必要進(jìn)一步探究其相關(guān)機(jī)制。JAK2/STAT3 通路的激活與炎癥密切相關(guān)。其參與多種炎癥過程且與腦損傷有關(guān)。丙泊酚作為臨床上廣泛應(yīng)用的靜脈麻醉藥物,不僅有鎮(zhèn)靜作用,還有抗炎、抗氧化等非麻醉作用［5,6］。因此本篇文章通過建立孕鼠MSD 模型,探討丙泊酚對孕鼠MSD 后子代大鼠海馬區(qū)及神經(jīng)炎癥的影響及與JAK2/STAT3 通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究獲得了湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物護(hù)理與使用委員會的批準(zhǔn)。本研究選用孕18 d SD 大鼠,所有孕鼠均來自湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,丙泊酚注射液購自中國阿斯利康制藥有限公司、JAK2 抗體、p-JAK2 抗體、STAT3 抗體、p-STAT3 抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司,GAPDH 抗體購自美國Proteintech Group 公司,ELISA 試劑盒購自欣博盛公司,裂解液、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(5X)購自中國碧云天公司,蛋白酶、磷酸酶抑制劑購自瑞士Roche 公司、SDS-PAGE 凝膠快速配制試劑盒購自中國Servicebio 公司,電泳裝置、凝膠成像分析系統(tǒng)、酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad 公司,組織勻漿機(jī)購自江蘇友聯(lián)儀器研究所,低溫高速離心機(jī)購自德國Eppendorf,水迷宮購自上海欣軟信息科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備及藥物處理 將12 只孕18 d SD 大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為：對照組(Con 組)、睡眠剝奪組(MSD 組)、睡眠剝奪+丙泊酚組(MSD+Pro組),每組4 只。本實(shí)驗(yàn)采用水平臺睡眠剝奪法對孕鼠睡眠剝奪。水平臺設(shè)備為自制水平臺睡眠剝奪箱,箱內(nèi)放置4 個(gè)平臺,孕鼠可于平臺間自由活動(dòng),每個(gè)平臺直徑為6.5 cm,使用時(shí)剝奪箱內(nèi)注入清水至距平臺1 cm 處,保證箱內(nèi)水溫于25℃,孕鼠可自由獲得水和食物。從MSD 組及MSD+Pro 組分別隨機(jī)選取1 只孕鼠進(jìn)行為期72 h 的睡眠剝奪,睡眠剝奪后將孕鼠放回原籠中飼養(yǎng)待產(chǎn),待其產(chǎn)出子代7 d 后行相應(yīng)處理。向MSD+Pro 組新生7 d SD 大鼠腹腔內(nèi)注射20 mg/kg 丙泊酚［7］,注射完成后使其仰臥于動(dòng)物電熱毯上,動(dòng)態(tài)監(jiān)測大鼠血氧飽和度,密切觀察其呼吸頻率及皮膚顏色確保無缺氧情況發(fā)生,待其翻正反射恢復(fù)后第2 日清晨,依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法每組選取5 只新生大鼠,喂養(yǎng)至第31 天,行水迷宮實(shí)驗(yàn)。其余新生大鼠安樂死后取海馬組織行其他檢測。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡定量分析 各組分別于冰上迅速取出3 只安樂死大鼠大腦并剝離取出海馬組織。海馬組織稱重后加裂解液經(jīng)研磨機(jī)研磨后靜置、離心。取上清,加入對應(yīng)上樣緩沖液,在100℃下煮沸10 min,得到蛋白樣本進(jìn)行電泳。通過電泳裝置將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF 膜)上。室溫下用5%脫脂牛奶將膜封閉1.5 h。封閉后,將膜與目標(biāo)一抗置于4℃冰箱孵育過夜。第二日晨使用TBST 緩沖液清洗3 次膜后用山羊抗兔或山羊抗鼠二抗在室溫下孵育1.5 h,再次使用TBST 緩沖液洗膜3 遍后應(yīng)用Western blot 凝膠成像分析系統(tǒng)對膜進(jìn)行拍照和分析。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 各組分別于冰上迅速取出5 只安樂死大鼠大腦病剝離出海馬組織,用預(yù)冷的PBS 緩沖液沖洗海馬組織并用濾紙吸干表面水分,稱重后放入勻漿機(jī)中。每100 毫克海馬組織用1 ml 預(yù)冷的PBS 勻漿。5000 r/min 低溫離心10 min,取上清液。按照試劑盒說明書,測定海馬組織中促炎性細(xì)胞因子的含量。

1.2.4 Morris 水迷宮 Morris 水迷宮是一項(xiàng)檢測實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空間學(xué)習(xí)和記憶能力實(shí)驗(yàn)。共有4 個(gè)象限：N,S,E,W。分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行4 d,提前1 d 對大鼠進(jìn)行訓(xùn)練,在訓(xùn)練過程中,動(dòng)物們被引導(dǎo)到一個(gè)隱藏的平臺,在測試階段記錄大鼠1～4 d 尋找隱藏平臺的時(shí)間?？臻g探索實(shí)驗(yàn)在測試的第5 天進(jìn)行,此時(shí)將平臺移除,將新生大鼠放于水中,使其不受干擾地游泳,記錄新生大鼠在目標(biāo)象限內(nèi)停留的時(shí)間和穿越平臺的次數(shù)。

1.3 觀察指標(biāo) 比較各組子代大鼠Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果,包括各組搜索平臺時(shí)間、穿越平臺次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比。比較各組子代安樂死大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白的相對表達(dá)情況及海馬組織中促炎性細(xì)胞因子含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗(yàn),P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組子代大鼠Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較MSD 組子代大鼠于第3 天、第4 天搜索平臺時(shí)間明顯長于Con 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；MSD+Pro組子代大鼠于第3 天、第4 天搜索平臺時(shí)間明顯短于MSD 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組子代大鼠搜索平臺時(shí)間比較(,s)

表1 各組子代大鼠搜索平臺時(shí)間比較(,s)

注：與Con 組比較,aP＜0.05；與MSD 組比較,bP＜0.05

MSD 組子代大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比和穿越平臺次數(shù)均顯著低于Con 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；MSD+Pro 組子代大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比和穿越平臺次數(shù)均顯著高于MSD 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 各組子代大鼠穿越平臺次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比比較()

表2 各組子代大鼠穿越平臺次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比比較()

注：與Con 組比較,aP＜0.05；與MSD 組比較,bP＜0.05

2.2 各組子代安樂死大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白的相對表達(dá)情況比較 MSD 組子代安樂死大鼠p-JAK2、p-STAT3 相對表達(dá)水平明顯高于Con組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MSD+Pro 組子代安樂死大鼠p-JAK2、p-STAT3 相對表達(dá)水平明顯低于MSD 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1,表3。

表3 各組子代安樂死大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白的相對表達(dá)水平()

表3 各組子代安樂死大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白的相對表達(dá)水平()

注：與Con 組比較,aP＜0.05；與MSD 組比較,bP＜0.05

2.3 各組子代安樂死大鼠海馬組織中炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表達(dá)水平比較 MSD 組子代安樂死大鼠炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表達(dá)水平均明顯高于Con組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MSD+Pro 組子代安樂死大鼠炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表達(dá)水平均明顯低于MSD 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表4。

表4 各組子代安樂死大鼠海馬組織中炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表達(dá)水平比較(,pg/ml)

表4 各組子代安樂死大鼠海馬組織中炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表達(dá)水平比較(,pg/ml)

注：與Con 組比較,aP＜0.05；與MSD 組比較,bP＜0.05

3 討論

與妊娠早期女性相比,妊娠晚期女性睡眠質(zhì)量更差、睡眠時(shí)間更短［8］。基于此,MSD 對子代的影響,已成為備受關(guān)注的問題。研究指出產(chǎn)前應(yīng)激可損傷子代認(rèn)知功能,影響子代身體發(fā)育［9］。因此本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建妊娠晚期孕鼠睡眠剝奪(MSD)模型進(jìn)一步研究MSD 對子代的影響。本次研究結(jié)果顯示：MSD 組子代大鼠于第3 天、第4 天搜索平臺時(shí)間明顯長于Con 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MSD 組子代大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比和穿越平臺次數(shù)均顯著低于Con組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MSD 組子代安樂死大鼠炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表達(dá)水平均明顯高于Con 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說明MSD 可損傷子代大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力及導(dǎo)致子代大鼠海馬區(qū)神經(jīng)炎癥。

丙泊酚是一種廣泛應(yīng)用于成人及小兒麻醉的靜脈麻醉藥物。丙泊酚有多種麻醉優(yōu)勢如起效快、蘇醒迅速等,它也具有多種非麻醉作用,其中包括抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等［5,10］。研究指出丙泊酚可以減輕大鼠睡眠剝引起的學(xué)習(xí)記憶能力的降低及海馬區(qū)神經(jīng)炎癥［11］。研究證明丙泊酚可減少異氟醚麻醉所致胚胎及子代小鼠海馬區(qū)炎性細(xì)胞因子IL-6 的釋放及改善其認(rèn)知功能損傷［12］。但目前尚缺少丙泊酚與MSD 后子代大鼠的影響的相關(guān)研究。本次研究結(jié)果顯示：MSD+Pro 組子代大鼠于第3 天、第4 天搜索平臺時(shí)間明顯短于MSD 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MSD+Pro 組子代大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比和穿越平臺次數(shù)均顯著高于MSD 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MSD+Pro 組子代安樂死大鼠炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表達(dá)水平均明顯低于MSD組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說明丙泊酚可減少M(fèi)SD 后子代大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力的損傷及減少子代大鼠海馬區(qū)神經(jīng)炎癥,從而起到腦保護(hù)的作用。然而其相關(guān)機(jī)制尚不清楚。

JAK2/STAT3 信號通路是重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,是介導(dǎo)多種免疫反應(yīng)及炎性介質(zhì)傳遞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［13］。JAK2/STAT3 通路的激活可影響多種促炎性細(xì)胞因子的表達(dá),如TNF-α、IL-6［14］。促炎性細(xì)胞因子IL-6 也可引發(fā)JAK/STAT3 通路的激活,致使T細(xì)胞分化從而激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放更多促炎性細(xì)胞因子［15,16］。研究指出缺血性腦卒中后,位于小膠質(zhì)細(xì)胞的STAT3 過度激活會加重小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和神經(jīng)炎癥,且抑制JAK2/STAT3 通路的激活可減輕腦缺血損傷和神經(jīng)炎癥［14,17］。本研究結(jié)果顯示：MSD 組p-JAK2、p-STAT3 相對表達(dá)水平明顯高于Con 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MSD+Pro 組子代安樂死大鼠p-JAK2、p-STAT3 相對表達(dá)水平明顯低于MSD 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說明JAK2/STAT3 通路激活可介導(dǎo)MSD 后子代大鼠海馬區(qū)神經(jīng)炎癥,且丙泊酚可抑制妊娠晚期孕鼠睡眠剝奪后所致子代大鼠海馬區(qū)JAK2/STAT3 信號通路的激活及神經(jīng)炎癥的發(fā)生從而起到腦保護(hù)作用。

綜上所述,丙泊酚可抑制妊娠晚期孕鼠睡眠剝奪后所致子代大鼠海馬區(qū)JAK2/STAT3 信號通路的激活及神經(jīng)炎癥的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)研究了丙泊酚對孕鼠睡眠剝奪后對子代的影響及其可能相關(guān)機(jī)制?？蔀榕R床上睡眠剝奪后新生子代麻醉提供一定參考,然而丙泊酚與MSD 后子代神經(jīng)炎癥機(jī)制復(fù)雜,其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。