山東核桃良種SSR指紋圖譜及分子身份證的構(gòu)建
——基于毛細管電泳分析

梁 燕，韓傳明，周繼磊，孫 超，王翠香，李春明，王 靜，閔旭峰，公慶黨，孟曉燁，楊緒強

（1山東省林業(yè)科學研究院，濟南 250014；2山東省林業(yè)保護和發(fā)展服務(wù)中心，濟南 250014；3海陽市林業(yè)站，山東 海陽 265100；4棗莊市山亭區(qū)自然資源局，山東 棗莊 277500；5濟南市長清區(qū)文昌林業(yè)站，濟南 250300）

0 引言

核桃(Juglans regiaL.)作為中國主要的經(jīng)濟林樹種之一，也是重要的木本油料樹種，具有極高的經(jīng)濟價值，其根、莖、葉、果皆具有很好的醫(yī)療保健功效[1]。核桃營養(yǎng)豐富，在中國被譽為“長壽果”，每100 g核桃中，含脂肪55.26～72.14 g，核桃中的脂肪43.59%～62.50%為亞油酸，2.36%～9.22%為亞麻酸，蛋白質(zhì)為12.43～21.03 g，而且核桃含有豐富的礦物元素和維生素[2-3]。近年來，隨著退耕還林政策的實施，核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛[4]，據(jù)不完全統(tǒng)計，2020年山東省核桃產(chǎn)量達到17.39萬t，面積達到13.64萬hm（2數(shù)據(jù)由山東省經(jīng)濟林管理站統(tǒng)計），隨著產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，核桃品種越來越多，親緣關(guān)系較近及苗期的核桃各品種之間表型性狀差異較小，核桃在品種培育和推廣中出現(xiàn)“同名異物”和“同物異名”的情況，這樣不利于核桃良種的推廣[5]。

指紋圖譜是指能夠反映生物個體間差異的電泳圖譜，由于它具有類似人類指紋的高度個體特異性和穩(wěn)定可靠性，故被稱為“指紋圖譜”，運用DNA指紋圖譜能進行品種的真實性和純度鑒定，確定品種的親緣關(guān)系，以及用于新品種登記和品種知識產(chǎn)權(quán)保護等[6]。SSR分子標記具有標記數(shù)量豐富，具有廣泛分布于各條各染色體上的等位變異；共顯性標記，呈孟德爾遺傳；技術(shù)重復性好，易于操作，結(jié)果可靠的特點[7]。SSR技術(shù)現(xiàn)今成熟應(yīng)用于核桃遺傳多樣性分析、雜交育種中親緣關(guān)系分析、實生選育中的分子圖譜建立、品種鑒定等方面[8-9]。熒光標記SSR毛細管電泳檢測法可以得到目標DNA片段的準確大小，穩(wěn)定、準確、高效[10]，基于此，實驗采用熒光標記SSR毛細管電泳檢測法構(gòu)建核桃指紋圖譜。

近年來，針對核桃品種遺傳多樣性的研究較多，但區(qū)域性核桃品種特別是主栽品種指紋圖譜的構(gòu)建較少，品種身份證的建立更是鮮見報道，而農(nóng)業(yè)中小麥、甜菜、大豆、油菜等分子身份證的構(gòu)建已經(jīng)較為成熟[10-13]，鑒于此，本文參照小麥等指紋身份證的構(gòu)建方法對山東省17個核桃品種指紋圖譜與分子身份證的構(gòu)建進行探討，為解決生產(chǎn)中種源信息混亂、品種難以鑒別等問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2019年4月從山東省林業(yè)科學研究院核桃種質(zhì)資源圃采集17個山東省主要栽植的核桃品種（表1）外圍嫩葉，硅膠干燥，帶回實驗室備用。

表1 核桃品種名稱及特征

續(xù)表1

1.2 DNA提取及SSR-PCR擴增

DNA采取改良的CATB法提取，并在紫外分光光度計下檢測DNA質(zhì)量，-20℃保存。從已報道的文獻[14-16]中選擇40對黑核桃和核桃中開發(fā)的引物進行預試驗，熒光引物由山東華博基因工程有限公司合成，篩選出15對多態(tài)性較高的引物試驗（表2）。SSR-PCR反應(yīng)體系為 20 μL，其中 2 ×TaqPCR Mix 10 μL，F(xiàn)orward Primer 1.2 μL，Reverse primer 1.2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 5.6 μL；SSR-PCR擴增程序為94℃預變性3 min，94℃變性30 s，53℃退火，72℃延伸，34個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存待電泳檢測。PCR擴增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離拍照。

表2 15對SSR引物信息及樣品區(qū)分情況

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Gene Marker 2.2.0進行峰圖的獲取和數(shù)據(jù)處理，可確定目標樣品SSR擴增片段的精確長度。利用NTSYS-pc2.1進行遺傳相似系數(shù)的計算和UPGMA聚類分析，繪制親緣關(guān)系聚類圖，利用EXCEL2013進行數(shù)據(jù)分析。參考秦瑞英等[10]構(gòu)建小麥品種身份證的方法構(gòu)建核桃品種身份證（分為3個部分），每對引物擴增出的不同片段長度按照出峰個數(shù)由少到多，相同個數(shù)按照片段由小到大，依次標注為1、2、3……9、A、B、C……，按標記所在染色體的順序排列，構(gòu)建指紋特征碼。

2 結(jié)果與分析

2.1 17個核桃品種遺傳相似系數(shù)及聚類分析

由表3中分析可知，17個核桃品種間Nei’s遺傳距離0.181～0.720，變幅為0.539，遺傳相似系數(shù)為0.267～0.867，變幅0.6，遺傳基礎(chǔ)較廣；其中‘日麗’與其他各品種的遺傳距離為0.402～0.720，遺傳相似系數(shù)為0.333～0.667，二者結(jié)果一致‘，日麗’與其他品種遺傳距離均較大，血緣關(guān)系較遠，在雜交育種中可利用；‘青林’與‘豐輝’品種間遺傳相似系數(shù)最小，‘元豐’與‘岱豐’品種間遺傳相似系數(shù)最大。

表3 17個核桃品種間Nei’s遺傳距離（左下角）與相似系數(shù)（右上角）

續(xù)表2

基于17個核桃品種的遺傳相似系數(shù)聚類（圖1），在遺傳相似系數(shù)0.5處，17個核桃品種聚為2大類，除‘奧林’、‘岱香’其余15個品種聚為Ⅰ類，但聚類結(jié)果并未按照早實、晚實聚類。類群Ⅰ中‘日麗’、‘青林’為山東核桃實生后代聚在一起，與‘魯錦’、‘魯果2號’血緣相近，‘豐輝’的實生后代‘豐碩’、‘岱豐’先與‘元豐’、‘元林’聚在一起后再與‘豐輝’聚類，‘元林’是‘元豐’的后代，‘元豐’與‘岱豐’品種間遺傳相似系數(shù)達到0.867，‘魯果5號’、‘魯核1號’為早實核桃實生后代，血緣關(guān)系相近的聚在一起，說明基于SSR分子標記的聚類結(jié)果可信度較高；分析發(fā)現(xiàn)Ⅰ群中‘青林’、‘野香’、‘魯核1號’為速生、果材兼用核桃[1]，其余品種基本樹體高大[1,17-19]，‘野香’為野核桃與核桃雜交，這里與核桃組的14個品種聚在一起，與核桃組血緣關(guān)系更近。Ⅱ群‘岱香’品種為‘遼寧1號’ב香玲’雜交育成，表現(xiàn)出矮化緊湊性狀，對‘岱香’這方面性狀可進行開發(fā)，‘奧林’為山東核桃實生選育，傳統(tǒng)分類中‘奧林’為晚實，‘岱香’為早實核桃[19-21]，兩個品種聚在一起，相關(guān)血緣關(guān)系較近。

圖1 17個核桃品種遺傳相似系數(shù)UPGMA聚類圖

2.2 指紋圖譜構(gòu)建與編碼

毛細管電泳峰圖如圖2。15對引物鑒別能力（表2）HF15＞HF14＞HF3=HF9＞HF12＞HF4＞HF8＞HF1＞HF2 ＞HF7＞HF6＞HF5＞HF11＞HF10，HF15將 17個核桃品種分為10組，可單獨鑒別品種6個(H02、H05、H06、H07、H09、H11)，HF14也可將17個核桃品種分為10組，單獨鑒別品種4個(H01、H05、H06、H13、H18)，鑒別能力較差的引物為HF10與HF11，將17個核桃品種分為3個組。

圖2 引物HF15不同核桃品種擴增產(chǎn)物峰圖

林木特征指紋圖譜的構(gòu)建講究利用盡量少的引物組合鑒別盡量多的品種，達到程序簡單而又經(jīng)濟的目的[5]，品種鑒別能力較好的引物有 HF3、HF9、HF12、HF14、HF15，5對核心引物PIC為0.621～0.756，均大于0.5，多態(tài)性很好，且HF9+HF15，HF3+HF9+HF14均可將17個核桃品種完全區(qū)分開，兩組引物可相互印證，因而將這5對SSR引物選作核心引物構(gòu)建17個核桃品種的特征指紋圖譜（表4）。并以此為基礎(chǔ)編制17個品種的特征指紋碼。

表4 17個核桃品種特征指紋圖譜

2.3 品種分子身份證構(gòu)建

品種身份證由3部分構(gòu)成，第1部分為商品碼，包括品種類別、品種審定區(qū)域、時間；第2部分指紋碼；第3部分為補充碼（T-轉(zhuǎn)基因、S-分子育種、M-誘變育種、N-常規(guī)育種）[10]。以‘日麗’為例，其19位分子身份證號碼為020201370201133332N，果樹(02)-堅果類(02)-核桃(01)-初次審定省份（山東370）-初次審定時間(2011)-特征指紋碼(33332)-常規(guī)育種(N)。

表5 17個核桃品種分子身份證與二維碼

續(xù)表5

3 討論與結(jié)論

17個核桃品種間Nei’s遺傳距離0.181～0.720，變幅為0.539，遺傳相似系數(shù)為0.267～0.867，變幅0.6，二者變幅均較大，說明供試材料的遺傳基礎(chǔ)較寬[5]；17個核桃品種基于SSR分子標記聚類結(jié)果，品種并未按照早實與晚實核桃分類，在分子和基因?qū)用婵蛇M一步研究探討影響核桃結(jié)果時間的因素，尋找與其相關(guān)聯(lián)的標記引物；傳統(tǒng)分類將核桃分為3組20多個種[7]，而組間雜交出的品種歸屬討論較少，DNA標記在分子層面將傳統(tǒng)分類難以解決的問題細化解決，為植物分類提供更好的證據(jù)。核桃組內(nèi)分類傳統(tǒng)往往按照堅果性狀分類，對樹體等性狀考慮較少，隨著育種方向的多樣化，分類也將更為科學，SSR分子標記聚類結(jié)果為育種與選種提供更加科學的選擇參考‘，岱香’品種為‘遼寧1號’ב香玲’雜交育成[20]，表現(xiàn)的矮化性狀在生產(chǎn)實踐具有參考意義‘，奧林’與其親緣關(guān)系較近，是山東核桃實生后代，兩個品種聚在一起‘，香玲’為‘上宋6號’ב阿克蘇9號’雜交育成[17]，兩個品種的來源可進一步研究；自19世紀60年代，山東引進新疆核桃[1]，從品種的來源分析，山東區(qū)域核桃與新疆核桃、北方核桃進行了廣泛的基因交流，聚類中地理來源問題較為復雜，分析中發(fā)現(xiàn)山東主栽核桃品種與南方核桃基因交流較少，也為以后育種提供了方向。

構(gòu)建品種的特征指紋圖譜和分子身份證是解決市場和育種中品種混亂，良種推廣混亂的有效方法。地域性核桃良種指紋圖譜構(gòu)建較少，史麗會等[22]篩選出15個微衛(wèi)星位點表現(xiàn)出較好的品種鑒別能力，為川早系列核桃品種的鑒定提供了基礎(chǔ)，周于波等[5,23]利用SSR分子標記構(gòu)建了11個四川核桃良種和11個川西南泡核桃良種的指紋圖譜，陳凌娜[24]用4對SSR引物構(gòu)建了35個核桃主栽品種的指紋圖譜，山東地區(qū)核桃良種的指紋圖譜未見報道，實驗采用的陳少瑜和高玉娜[14-16]等文獻中的15對引物在山東省核桃品種鑒定中表現(xiàn)良好，篩選出5對高鑒別能力SSR引物，并構(gòu)建了17個核桃品種的指紋圖譜，為山東地區(qū)核桃良種的鑒別提供了技術(shù)基礎(chǔ)，5對核桃引物與周于波[5,23]和陳凌娜[24]的研究的核心引物不同，他們也未進一步就核桃指紋圖譜的商業(yè)應(yīng)用進一步探討，這也為下一步研究提供方向。

李國田等[4]利用ISSR分子標記方法，從28條引物中篩選出10條引物構(gòu)建了16個核桃品種的分子身份證，遺傳距離為0.20～0.87，結(jié)果與本研究基本一致；而本研究采用SSR熒光標記與毛細管檢測相結(jié)合的方法，確定出不同樣品SSR擴增片段的精確長度，在技術(shù)手段上更進一步，且篩選出的5對核心引物精簡了分子身份證的構(gòu)建方法，符合最少引物區(qū)分最多品種的原則，5對核心引物PIC均值0.697，理論上可區(qū)分最大品種數(shù)1.05×106[25-26]，滿足生產(chǎn)中的需求。本研究在品種身份證構(gòu)建中加入了品種商品性信息，并生成了品種的二維碼，但還不能完全滿足實際需要，可將具體生產(chǎn)時間、地點、物流信息加入到電子碼中，在品種外包裝中標識，實現(xiàn)品種信息的全追溯。由于材料為山東省栽種的核桃良種，材料范圍較窄，對核桃新品種，特別是現(xiàn)在種間雜交的新品種，以及其他省份的良種分子身份證應(yīng)用未進行研究，現(xiàn)在商品流通范圍廣，研究下一步將擴大范圍，在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上，探討研究應(yīng)用更廣的SSR引物和全國范圍核桃分子身份證構(gòu)建的可能性。

綜上所述，本研究中采用15對SSR引物分析山東省主栽的17個良種的遺傳背景，發(fā)現(xiàn)其遺傳相似系數(shù)為0.267～0.867，變幅0.6，17個良種具有豐富的遺傳多樣性；篩選出5對核心引物構(gòu)建17個良種的特征指紋圖譜和分子身份證，5對核心引物可分為2組相互印證，進一步探討了將分子標記運用到山東核桃良種的鑒定和商品信息追溯的方法，創(chuàng)新生成了品種分子二維碼。SSR分子標記基于毛細管電泳手段精確且技術(shù)成熟，方法簡便可行，本研究可為全國范圍內(nèi)核桃良種的鑒定與分子身份證的構(gòu)建提供參考。