廣西杉木炭疽病病原鑒定及生物學(xué)特性測(cè)定

廖旺姣 鄒東霞 羅輯 吳耀軍 黃華艷

摘要：【目的】明確廣西杉木炭疽病的病原種類(lèi)及生物學(xué)特性，為杉木抗病育種及杉木炭疽病的防治技術(shù)研究提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā坎杉瘡V西河池、百色、桂林、柳州、賀州和南寧市杉木種子園及林地炭疽病樣品，采用常規(guī)組織和單孢分離法獲得杉木炭疽病病原菌菌株，通過(guò)形態(tài)特征結(jié)合病原菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、幾丁質(zhì)合成酶（CHS1）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GPDH）、微管蛋白（TUB2）和肌動(dòng)蛋白（ACT）多基因分子系統(tǒng)學(xué)分析，對(duì)獲得的炭疽病菌菌株進(jìn)行鑒定;采用平板培養(yǎng)法測(cè)定病原菌生物學(xué)特性?！窘Y(jié)果】從杉木炭疽病樣品中共分離獲得60株炭疽菌屬真菌，均具有致病性，但致病力存在差異。通過(guò)形態(tài)學(xué)結(jié)合病原菌多位點(diǎn)基因系統(tǒng)發(fā)育分析，確定廣西杉木炭疽病病原菌種類(lèi)為核果炭疽菌（Colletotrichum fructicola）和山茶炭疽菌（C. camelliae）。生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果顯示，C. fructicola和C. camelliae菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢最適溫度分別為28和25 ℃;光照對(duì)C. fructicola菌絲生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，但有利于C. camealliae菌絲生長(zhǎng)，黑暗有利于2種病原菌產(chǎn)孢;pH 4時(shí)最適宜2種病原菌菌絲生長(zhǎng)，pH 4最適宜C. fructicola產(chǎn)孢，pH 5最適宜C. camealliae產(chǎn)孢;2種病原菌對(duì)D-麥芽糖利用最好，乳糖和D-山梨醇最有利于C. fructicola產(chǎn)孢，可溶性淀粉和阿拉伯糖最有利于C. camelliae產(chǎn)孢;蛋白胨和酵母粉均有利于2種病原菌菌絲生長(zhǎng)，酵母粉有利于C. fructicolaz產(chǎn)孢，酵母粉和牛肉膏有利于C. camelliae產(chǎn)孢。【結(jié)論】廣西杉木炭疽病病原為核果炭疽菌（C. fructicola）和山茶炭疽菌（C. camelliae）。溫度、pH和碳氮源對(duì)2種病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢影響明顯，光照對(duì)2種病原的影響略有不同。

關(guān)鍵詞： 杉木;炭疽病;病原菌鑒定;生物學(xué)特性;廣西

中圖分類(lèi)號(hào)： S763.15? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2022）04-1040-09

Identification and biological characteristics of the pathogens

of Chinese fir anthracnose in Guangxi

LIAO Wang-jiao， ZOU Dong-xia， LUO Ji， WU Yao-jun， HUANG Hua-yan*

（Guangxi Forestry Research Institute/Guangxi Engineering Research Center of Forest Pests’

Natural Enemies Breeding， Nanning， Guangxi? 530002， China）

Abstract：【Objective】To identify and determine the biological characteristics of the pathogens causing Chinese fir anthracnose in Guangxi to provides a basis for their control. 【Method】Typical anthracnose samples were collected from Chinese fir seed orchards and woodlands in Hechi，Baise，Guilin，Liuzhou，Hezhou，and Nanning，in Guangxi，and thefungiwere isolated by tissue separation and purification. Their pathogenicity was tested according to Koch’s method and their identity determined through morphological studies and multi-gene phylogenetic analysis of their internal transcribed spacer（ITS），chitin synthelase 1（CHS1），glyceraldehyde 3-phosphoric acid dehydrogenase（GPDH），tubnlin2（TUB2）， actin（ACT） sequences.The biological characteristics of Colletotrichum fructicola and C. camelliae were determined by the plate culture method. 【Result】A total of 60 strains of anthracnose fungi were isolated from collection sites and the all of the isolates could infect healthy Chinese fir leaves，but with different pathogenicities. The pathogens were identified as C. fructicola and C.camelliae from their phenotypic characteristics and multilocus sequence analysis. The study of their biological characteristics indicated that the optimum temperature for mycelial growth and sporulation of C. fructicola and C. camelliae was 28 and 25 ℃，respectively. Light had no obvious effect on the mycelial growth of C. fructicola，but was beneficial to the mycelial growth of C. camelliae. Complete darkness was beneficial to the spore production of the two pathogens. The optimum pH value for mycelial growth of the two pathogens was 4，and the optimum pH value for spore production was 4 and 5 for C. fructicola and C. camelliae，respectively. The better carbon sources for C. fructicola and C. camelliae was D-maltose for mycelium growth，whereas the optimal carbon source for spore germination was lactose and D-sorbitol for C. fructicola，and soluble starch and arabinose in C. camelliae. The best nitrogen sources for C. fructicola and C. camelliae were peptone and yeast powder during mycelium growth，and the optimal nitrogen for spore germination was yeast powder in C. fructicola，and yeast powder and beef extract in C. camelliae. 【Conclusion】The pathogens of Chinese fir anthracnose in Guangxi are identified as C. fructicola and C. camelliae. Temperature，pH，carbon and nitrogen sources have significant effects on mycelial growth and sporulation of C. fructicola and C. camelliae，while the effects of light on the two pathogens are slightly different.

Key words： Cunninghamia lanceolata（Lamb.） Hook.; anthracnose; pathogen identification; biological characteristics; Guangxi

Foundation items：Guangxi Innovation Driven Development Project（Guike AA17204087-10）; Guangxi Forestry Science and Technology Project （Guilingke〔2016〕No.4）

0 引言

【研究意義】杉木[Cunninghamia lanceolata （Lamb.）Hook.]是我國(guó)南方最重要的用材林樹(shù)種之一。杉木生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高、材質(zhì)好、用途廣，其木材是優(yōu)秀的建筑用材、裝飾用材和紙漿用材（陳代喜和李富福，2013）。目前，廣西杉木面積約150.38萬(wàn)ha，占全區(qū)人工林總面積的25.38%，是國(guó)家木材戰(zhàn)略?xún)?chǔ)備廣西核心基地建設(shè)的重要樹(shù)種（戴俊等，2020）。炭疽病是危害廣西杉木的主要病害，主要危害幼樹(shù)先年秋梢，致使針葉干枯或梢頭枯死，嚴(yán)重時(shí)幼樹(shù)整株死亡。2015—2020年，炭疽病在廣西各杉木栽培區(qū)普遍發(fā)生，種子園和林地發(fā)病率30%～80%，嚴(yán)重者發(fā)病率可高達(dá)100%，極大地影響杉木健康生長(zhǎng)，降低球果結(jié)實(shí)率，種子品質(zhì)變差，甚至絕收，嚴(yán)重影響杉木種子的產(chǎn)量和品質(zhì)。關(guān)于杉木炭疽病病原一直沿用膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）（黃飛龍，1993），但該菌是復(fù)合種群，僅憑形態(tài)學(xué)特征很難區(qū)分復(fù)合種群內(nèi)的合格種，而形態(tài)學(xué)結(jié)合多基因系統(tǒng)學(xué)分析能有效區(qū)分復(fù)合種群內(nèi)的合格種（Weir et al.，2012）。目前，廣西杉木炭疽病的研究主要集中在病害發(fā)生和防治等方面，尚缺乏病原菌的準(zhǔn)確鑒定和生物學(xué)特性研究。準(zhǔn)確鑒定杉木炭疽病病原并掌握其生物學(xué)特性是明確病害發(fā)生流行動(dòng)態(tài)和制定有效防治措施的基礎(chǔ)（孔前前等，2018;伍曉麗等，2021），同時(shí)，也是杉木種子園良種抗病選育的前提基礎(chǔ)。因此，明確廣西杉木炭疽病的病原種類(lèi)及生物學(xué)特性，對(duì)杉木良種抗性選育及防治措施制定具有重要的指導(dǎo)意義。【前人研究進(jìn)展】杉木炭疽病最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)70年代，而后李傳道等（1980）和林業(yè)部南方森林植物檢疫所等（1980a，1980b）對(duì)江西省杉木炭疽病進(jìn)行調(diào)查研究，依據(jù)病原菌形態(tài)特征確定病原菌為膠孢炭疽菌，明確了發(fā)病規(guī)律。近年來(lái)報(bào)道的杉木炭疽病病原與此相同或不同，田龍艷等（2019）采用形態(tài)特征結(jié)合ITS等基因序列，確定粵北地區(qū)杉木炭疽病病原亦為膠孢炭疽菌;韓雨庭等（2021）采用形態(tài)特征結(jié)合ITS基因系統(tǒng)分析法明確云南省廣南縣杉木炭疽病病原為暹羅刺盤(pán)孢（C. siamense），該病原與前人所報(bào)道的膠孢炭疽菌不同。炭疽病的空間分布及病害調(diào)查方法已有研究報(bào)道，朱建華等（2004）報(bào)道林地炭疽病空間分布類(lèi)型為聚集分布;伍南等（2012）利用遙感高光譜微分指數(shù)估測(cè)杉木炭疽病病情指數(shù)精度較高，且具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，解決了傳統(tǒng)的人力踏查耗時(shí)耗力，效率和準(zhǔn)確性低，無(wú)法大面積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的難題。病害防治方面的研究報(bào)道較多，傳統(tǒng)的防治措施主要以營(yíng)林為主，化學(xué)防治為輔，適地造林、合理施用化肥，促進(jìn)杉木健康生長(zhǎng)，提高抗病能力;病害發(fā)生嚴(yán)重時(shí)，使用百菌清和甲基托布津能有效防止病害的蔓延（肖斌和肖力，2017）。杉木炭疽病生物防治也有相關(guān)報(bào)道，路宗巖等（2013）發(fā)現(xiàn)一種地衣芽孢桿菌HY32對(duì)杉木炭疽病有較明顯的防治效果;李紅軍等（2014）對(duì)HY32發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高對(duì)杉木炭疽病的防治效果;李冬琴等（2015）從杉木根際土壤篩選到一株對(duì)炭疽菌有良好抑制作用的拮抗細(xì)菌AM53，而且研制出的相應(yīng)菌劑在林間的防治效果良好。杉木炭疽病病原菌生物學(xué)特性研究報(bào)道較少，曾思海等（1998）報(bào)道了球果炭疽病菌（Colletotrichum sp.）生物學(xué)特性，適宜該菌的溫度為22～30 ℃，以26 ℃為菌絲最適生長(zhǎng)溫度，24 ℃為分生孢子萌發(fā)最適溫度;可生長(zhǎng)的酸堿度為pH 5～8，以pH 7為最適酸堿度;分生孢子以在水滴和100%相對(duì)濕度中萌發(fā)率最高;菌絲在常見(jiàn)碳源蔗糖、常見(jiàn)氮源蛋白胨上生長(zhǎng)良好。但該菌沒(méi)有準(zhǔn)確鑒定到種?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人依據(jù)形態(tài)學(xué)特征對(duì)廣西杉木炭疽病病原進(jìn)行鑒定，該方法很難區(qū)分近似種，病原菌分類(lèi)準(zhǔn)確性有待商榷。20世紀(jì)90年代至今未見(jiàn)采用形態(tài)學(xué)與多基因分子系統(tǒng)學(xué)分析對(duì)廣西杉木炭疽菌進(jìn)行鑒定的報(bào)道，病原菌生物學(xué)特性亦未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用五點(diǎn)取樣法和隨機(jī)取樣法分別對(duì)廣西河池、百色、桂林、柳州、賀州和南寧市等杉木種子園和杉木林地炭疽病進(jìn)行全面調(diào)查，采用常規(guī)組織和單孢分離法獲得炭疽病病原菌，通過(guò)形態(tài)特征與多基因分子系統(tǒng)學(xué)分析相結(jié)合的方法對(duì)炭疽病菌菌株進(jìn)行鑒定;采用平板培養(yǎng)法分析影響病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的溫度、光照、pH、碳源和氮源等因子，明確廣西杉木炭疽病病原菌的分類(lèi)地位和生物學(xué)特性，為后續(xù)開(kāi)展抗病育種及防治技術(shù)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試植物材料：杉木炭疽病樣品來(lái)源于廣西河池、百色、桂林、柳州、賀州和南寧市杉木種子園和杉木林地;健康杉木枝條采自廣西林業(yè)科學(xué)研究院杉木試驗(yàn)林。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200.00 g、葡萄糖20.00 g、瓊脂粉20.00 g、水1000 mL。查彼培養(yǎng)基（Czapek）：硝酸鈉2.00 g、磷酸氫二鉀1.00 g、氯化鉀0.50 g、七水合硫酸鎂0.50 g、硫酸鐵0.01 g、蔗糖30.00 g、瓊脂粉20.00 g、水1000 mL。

主要試劑及儀器：DNA提取試劑盒和PCR擴(kuò)增試劑盒（2×Es Taq Master Mix）均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Biometra PC48型PCR儀（德國(guó)BIOMETRE公司）;DYCP-31DN型電泳儀（北京六一儀器廠）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 病原菌分離純化 病針葉沖洗干凈后，依次浸泡75%酒精1～3 min，0.1%升汞4～5 min，無(wú)菌水沖洗3次。滅菌剪刀在病健交界處剪取約1.00 cm長(zhǎng)組織，接種到PDA培養(yǎng)基上，置于28 ℃下培養(yǎng)5 d，組織塊長(zhǎng)出菌絲和分生孢子后，挑取單孢接種在新的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，菌株保存至PDA斜面試管培養(yǎng)基，4 ℃冰箱保藏（方中達(dá)，2001）。

1. 2. 2 致病性測(cè)定 取杉木健康嫩枝，經(jīng)75%酒精表面消毒和無(wú)菌水沖洗干凈后用直徑0.30 cm的衛(wèi)生香在近針葉葉尖處燙一個(gè)直徑約0.20 cm的傷口，解剖刀挑取0.30 cm病原菌菌餅接種到傷口上，以無(wú)菌PDA接種為對(duì)照，處理和對(duì)照各20張針葉，接種后置于底部鋪有濾紙的白色透明塑料盒中，脫脂棉蘸滅菌水保濕。置于室溫中培養(yǎng)，10 d后觀察是否發(fā)病，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和測(cè)量病斑長(zhǎng)度。取發(fā)病針葉進(jìn)行病原菌再次分離，與接種菌進(jìn)行比較是否相同，從而確定致病菌。

1. 2. 3 病原菌鑒定

1. 2. 3. 1 病原菌形態(tài)鑒定 純化菌株置于PDA培養(yǎng)基25 ℃恒溫、黑暗條件下培養(yǎng)，逐日觀察。培養(yǎng)7 d后，記錄菌株培養(yǎng)性狀和菌落直徑，鏡檢、拍攝和測(cè)量100個(gè)病原分生孢子和20個(gè)分生孢子附著胞大?。钣崖?lián)，2010）。

1. 2. 3. 2 病原菌基因序列測(cè)定及多基因系統(tǒng)分析

病原菌基因組DNA提取參照試劑盒使用說(shuō)明操作，選擇真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS，ITS4/ITS5）、幾丁質(zhì)合成酶（CHS1，CHS1-79F/CHS1-784R）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GPDH，GDF1/GDR1）、微管蛋白（TUB2，T1/β-tubulin2b）和肌動(dòng)蛋白（ACT，ACT-512F/ ACT-783R）基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和條件、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建等參考朱英芝等（2015）的方法。

1. 2. 4 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

1. 2. 4. 1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 從分離獲得的杉木炭疽病病原菌中選擇2株菌株作為代表菌株進(jìn)行生物學(xué)特性測(cè)定。將直徑為6 mm（下同）的病原菌菌餅接種至新的PDA培養(yǎng)基上，置于黑暗條件下分別于5、10、15、20、25、28、30和35 ℃培養(yǎng)，每處理6個(gè)重復(fù)，7 d后用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，10 d后用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定產(chǎn)孢量（方中達(dá)，2001）。

1. 2. 4. 2 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 取病原菌菌餅接至PDA培養(yǎng)基上，分別置于全光照（8 W，燈皿距離20 cm，下同）、全黑暗和12 h光暗交替25 ℃恒溫培養(yǎng)，菌落直徑及測(cè)定方法同1.2.4.1。

1. 2. 4. 3 不同pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 取病原菌菌餅接至不同pH的PDA（1 mol/L的HCl和NaOH調(diào)制）培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗培養(yǎng)，菌落直徑及測(cè)定方法同1.2.4.1。

1. 2. 4. 4 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 以不含蔗糖的查彼培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別配制D-麥芽糖、乳糖和阿拉伯糖等10種碳源培養(yǎng)基，取病原菌菌餅接種至上述含不同碳源的培養(yǎng)基上，菌落直徑及測(cè)定方法同1.2.4.1。

1. 2. 4. 5 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 以不含NaNO3的查彼培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別配制L-賴(lài)氨酸、硫酸銨和蛋白胨等8種氮源培養(yǎng)基，取病原菌菌餅接種至上述含不同氮源的培養(yǎng)基上，菌落直徑及測(cè)定方法同1.2.4.1。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010整理，數(shù)據(jù)分析及差異顯著性檢驗(yàn)采用DPS 13.01中的Duncan’s新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病原菌分離及致病性測(cè)定結(jié)果

從采集自廣西河池、百色、桂林、柳州、賀州和南寧市的杉木炭疽病樣品中共分離獲得60株菌株，分為兩大類(lèi)型，其中CSHC01、CSNN01、CSBS01、CSGL01和CSHZ01為第一種類(lèi)型，共37株;CSHC02、CSNN02、CSLZ01、CSBS02和CSGL02為第二種類(lèi)型，共23株。選擇CSHC01和CSHC02為測(cè)試菌株，菌株接種健康杉木針葉3 d后，接種點(diǎn)褐變開(kāi)始擴(kuò)展，10 d后接種的針葉均感病，病斑擴(kuò)展至針葉1/4～3/4，癥狀與自然感病癥狀相同（圖1-A和圖1-B）;對(duì)照接種點(diǎn)變褐，但未擴(kuò)展（圖1-C）。感病針葉及對(duì)照針葉進(jìn)行再次分離，接種處理針葉獲得的菌株與原接種菌株一致，對(duì)照處理未獲得任何菌株，依據(jù)柯赫氏法則，確定接種菌即為杉木炭疽病致病菌。

2. 2 病原菌形態(tài)特征

CSHC01菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，菌落平均直徑為82.96 mm，平均生長(zhǎng)速率11.85 mm/d，菌落圓形，氣生菌絲絨毛狀，灰色至灰黑色，邊緣整齊，背面產(chǎn)生黑色色素（圖2-A和圖2-B）。分生孢子圓柱狀，兩端鈍圓或一端稍尖，無(wú)色，單胞，光滑，具有1～2個(gè)油球，平均大小為（20.04±1.92）μm×（5.42±0.57）μm（圖2-C）。分生孢子附著胞圓形或近橢圓形，淺褐色至褐色，少數(shù)呈不規(guī)則形，邊緣完整，單個(gè)或多個(gè)，平均大小為（9.85±0.87）μm×（7.85±0.42）μm（圖2-D），形態(tài)特征與核果炭疽菌（C. fructicola）相符（楊友聯(lián)等，2014）。

CSHC02菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，菌落平均直徑為78.28 mm，平均生長(zhǎng)速率11.18 mm/d，菌落近圓形，氣生菌絲棉花狀，白色至灰色，邊緣整齊，背面灰色至黑色（圖3-A和圖3-B）。分生孢子圓柱狀，兩端鈍圓或一端略粗，另一端稍尖，無(wú)色，單孢，光滑，平均大小為（15.90±1.07）μm×（5.17±0.35）μm（圖3-C）;附著胞近圓形，褐色至黑褐色，單個(gè)或多個(gè)，平均大小為（7.92±0.71）μm×（6.24±0.58）μm（圖3-D）。形態(tài)特征與山茶炭疽菌（C. camelliae）相符（李河等，2017）。

2. 3 病原菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

獲得菌株的ITS、CHSI、GPDH、TUB2和ACT基因序列后，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)各基因序列分別進(jìn)行比對(duì)，下載相關(guān)序列，用MEGA 5.0中的鄰接法構(gòu)建上述5個(gè)基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果（圖4）顯示，CSBS01、CSGL01、CSHZ01、CSHC01和CSNN01菌株與C. fructicola菌株聚在同一分支，相似性達(dá)100%，CSLZ01、 CSGL02、CSNN02、CSHC02和CSBS02菌株與C. camelliae菌株聚在同一分支上，相似性達(dá)100%，遺傳進(jìn)化距離最近，能與炭疽菌其他種區(qū)分，各分支支持率均較高（圖4）。分子生物學(xué)分析結(jié)果表明，廣西杉木炭疽病病原菌為核果炭疽菌（C. fructicola）和山茶炭疽菌（C. camelliae）。

2. 4 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果

2. 4. 1 溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響 試驗(yàn)結(jié)果（表1）顯示，C. fructicola菌絲生長(zhǎng)溫度為10～35 ℃，溫度低于5 ℃菌絲不生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為25～30 ℃，其中以28 ℃處理最好，菌落直徑顯著大于除25和30 ℃處理外的其他溫度處理（P<0.05，下同），超過(guò)30 ℃菌絲生長(zhǎng)急劇下降，至35 ℃時(shí)菌落直徑僅為10.09 mm;C. fructicola在15～28 ℃均能產(chǎn)孢，其中以25 ℃產(chǎn)孢量最大，其次是20 ℃，2個(gè)溫度處理間產(chǎn)孢量差異顯著。C. camealliae菌絲生長(zhǎng)溫度為10～30 ℃，最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，其次是25 ℃，各溫度處理間菌落直徑差異顯著;C. camealliae在15～30 ℃均能產(chǎn)孢，其中以25 ℃產(chǎn)孢量最大，其次是28 ℃。2株菌株菌絲生長(zhǎng)溫度范圍基本相同，菌絲生長(zhǎng)最適溫度和產(chǎn)孢最適溫度一致，分別為28和25 ℃。

2. 4. 2 光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 由表2可知，C. fructicola在3種光照條件下菌絲生長(zhǎng)差異不明顯，菌落直徑差異不顯著（P>0.05，下同）;產(chǎn)孢量存在一定差異，以全黑暗處理產(chǎn)孢量最大，其次是全光照處理，兩者間產(chǎn)孢量差異不顯著，最差的是12 h光暗交替處理，產(chǎn)孢量與全光照處理差異顯著。C. camealliae在全光照條件下生長(zhǎng)最好，其次是全黑暗處理，兩者間菌落直徑差異不顯著;產(chǎn)孢量以全黑暗處理最高，其次是12 h光暗交替處理，全光照處理最少，各處理間產(chǎn)孢量差異顯著。

2. 4. 3 不同pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

由表3可知，C. fructicola在pH 4～12范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)及產(chǎn)孢，其中以pH 4處理菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量最大，其次為pH 5和pH 6處理，菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量均隨著pH升高而降低;C. camealliae菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢pH范圍較C. fructicola略小，pH 4處理菌絲生長(zhǎng)最好，pH 5處理產(chǎn)孢量最大，其次為pH 6處理，此后產(chǎn)孢量隨著pH升高而降低。

2. 4. 4 不同碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

試驗(yàn)結(jié)果（表4）顯示，C. fructicola在供試的10種碳源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，其中以D-麥芽糖處理生長(zhǎng)最好，其次是D-木糖、可溶性淀粉、乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、甘露醇、D-山梨醇和阿拉伯糖處理，9種碳源處理間菌落直徑差異不顯著，在半乳糖處理上生長(zhǎng)最差;C. fructicola可在除D-木糖外的9種碳源培養(yǎng)基上產(chǎn)孢，以乳糖和D-山梨醇處理產(chǎn)孢量最大。C. camealliae亦可在供試的10種碳源培養(yǎng)基生長(zhǎng)，生長(zhǎng)最佳碳源與C. fructicola相同，均為D-麥芽糖，其次是D-木糖、可溶性淀粉和阿拉伯糖，生長(zhǎng)最差的碳源與C. fructicola相同，為半乳糖，與其他碳源處理菌落直徑差異顯著;C. camealliae只在乳糖、半乳糖、甘露醇、可溶性淀粉和阿拉伯糖培養(yǎng)基上產(chǎn)孢，其中在阿拉伯糖和可溶性淀粉培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大，兩者的產(chǎn)孢量與其他碳源處理差異顯著。

2. 4. 5 不同氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

試驗(yàn)結(jié)果（表5）表明，C. fructicola在供試的8種氮源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，其中以蛋白胨處理生長(zhǎng)最好，其次是牛肉膏和酵母粉處理，3種有機(jī)氮源處理的菌落直徑差異不顯著，說(shuō)明有機(jī)氮源有利于該菌的菌絲生長(zhǎng);C. fructicola在除硫酸銨處理外的7種氮源培養(yǎng)基上均能產(chǎn)孢，其中以酵母粉處理的產(chǎn)孢量最大，其次是L-賴(lài)氨酸處理，在牛肉膏處理的產(chǎn)孢量最少。C. camealliae與C. fructicola相似，可在供試的8種氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其中以蛋白胨和酵母粉處理生長(zhǎng)最好，其次是牛肉膏處理;C. camealliae只在DL-丙氨酸、甘酸氨、蛋白胨、牛肉膏和酵母粉培養(yǎng)基上產(chǎn)孢，以酵母粉處理的產(chǎn)孢量最大，其次是牛肉膏處理，DL-丙氨酸和甘酸氨處理的產(chǎn)孢量最少。

3 討論

3. 1 廣西杉木炭疽病病原

本研究確定廣西杉木炭疽病病原為C. fructicola和C. camelliae，且以C. fructicola為優(yōu)勢(shì)病原。與李傳道等（1980）和林業(yè)部南方森林植物檢疫所等（1980a，1980b）報(bào)道的C. gloeosporioides不同，也與韓雨庭等（2021）報(bào)道的C. siamense不同。C. fructicola寄主范圍較廣，可危害小?？Х龋–offea arabica）、沙梨（Pyrus pyrifolia）、深波葉補(bǔ)血草（Limonium sinense）、葡萄（Vitis vinifera）、草莓（Fragaria ananassa）、茶樹(shù)（Camellia sinensis）、棉花（Gossypium hirsutum）、油茶（C. oleifera）和土沉香（Aquilaria sinensis）等植物（Weir et al.，2012;楊友聯(lián)等，2014;李河等，2017;廖旺姣等，2018）。C. camelliae寄主范圍較C. fructicola窄，目前已報(bào)道的寄主為油茶、茶樹(shù)和金花茶（C. nitidissima）（謝玲等，2009;李河等，2017;王雪等，2020），報(bào)道的3種寄主均為山茶科植物。

C. fructicola和C. camelliae是油茶炭疽病重要病原（吳耀軍和奚福生，2010;李河等，2017），此次在廣西杉木上發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明杉木是這2種病原菌的新記錄寄主。在河池、百色、南寧和桂林市的杉木上2種病原菌均有發(fā)現(xiàn)，在賀州的杉木上只發(fā)現(xiàn)C. fructicola，在柳州的杉木上只發(fā)現(xiàn)C. camelliae，可能與采集樣品范圍有關(guān)。百色、河池、柳州和賀州市是杉木主要栽培區(qū)，同時(shí)是廣西油茶的重要栽培區(qū)，桂林和南寧市也分布有大量的油茶林。杉木炭疽病與油茶炭疽病病原是否有關(guān)聯(lián)有待進(jìn)一步研究。

3. 2 廣西杉木炭疽病病原C. fructicola和C. camealliae生物學(xué)特性

對(duì)廣西杉木炭疽病病原生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果表明，C. fructicola最適生長(zhǎng)溫度為25～30 ℃，其中以28 ℃最好，最佳產(chǎn)孢溫度為25 ℃。C. fructicola菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢最佳溫度與劉倩麗等（2014）報(bào)道的海南檀香炭疽病菌（C. fructicola）最適生長(zhǎng)溫度及分生孢子最適萌發(fā)溫度為30 ℃相比偏低;與宋麗麗等（2019）報(bào)道草莓炭疽病菌（C. fructicola）最適生長(zhǎng)溫度范圍一致，但最佳生長(zhǎng)溫度較草莓炭疽病菌（30 ℃）略低?？赡芘c廣西杉木生長(zhǎng)的環(huán)境溫涼有關(guān)（王獻(xiàn)溥等，2004）。C. fructicola適宜生長(zhǎng)的pH為4～12，與檀香炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)適宜的pH 4～11（劉倩麗等，2014）略寬;C. fructicola最適宜生長(zhǎng)的pH為4，比檀香炭疽病菌最適pH為6（劉倩麗等，2014）和草莓炭疽病菌最佳pH為6～7（宋麗麗等，2019）不同，C. fructicola適合偏酸條件下生長(zhǎng);光照對(duì)C. fructicola生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，與劉倩麗等（2014）報(bào)道光照有利于檀香炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的結(jié)論存在差異;黑暗有利于產(chǎn)孢，兩者結(jié)論一致;C. fructicola在可溶性淀粉等碳源上生長(zhǎng)較好，與檀香炭疽病菌（劉倩麗等，2014）的研究結(jié)果一致;C. fructicola在蛋白胨氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，與檀香炭疽病菌（劉倩麗等，2014）的研究結(jié)論一致;本研究中，C. fructicola在硫酸銨氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較差，而檀香炭疽病菌（劉倩麗等，2014）卻生長(zhǎng)良好，可能與病原菌的不同寄主來(lái)源有關(guān)。

C. camealliae最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，與王雪等（2019）報(bào)道的貴州茶褐枯病病原菌（C. camelliae）最適生長(zhǎng)溫度結(jié)論一致;C. camealliae菌絲生長(zhǎng)最適pH為4，與茶褐枯病病原菌最適pH為4.5～6.0（王雪等，2019）存在差異，本研究的C. camealliae適宜在偏弱酸條件下生長(zhǎng);C. camealliae在蛋白胨氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，茶褐枯病病原菌在蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一般（王雪等，2019），可能與菌株不同寄主來(lái)源有關(guān)。

本研究的C. fructicola和C. camealliae從杉木種子園分離獲得，研究發(fā)現(xiàn)這2種炭疽菌與不同寄主來(lái)源的菌株的生物學(xué)特性存在一定差異，可能與菌株的遺傳特性有關(guān)，有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

采用形態(tài)學(xué)結(jié)合病原菌的ITS、CHS1、GPDH、TUB2和ACT基因分子系統(tǒng)學(xué)分析，確定廣西杉木炭疽病病原菌為核果炭疽菌（C. fructicola）和山茶炭疽菌（C. camelliae），以C. fructicola分離率較高，這是國(guó)內(nèi)杉木炭疽病新病原首次報(bào)道，杉木是這2種炭疽菌的新寄主。溫度、pH、碳氮源對(duì)C. fructicola和C. camelliae菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢影響明顯，光照對(duì)C. fructicola菌絲生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，但對(duì)C. camelliae有影響，黑暗條件均利于產(chǎn)孢。

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收稿日期：2021-09-06

基金項(xiàng)目：廣西創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)（桂科AA17204087-10）;廣西林業(yè)科技項(xiàng)目（桂林科字〔2016〕第4號(hào)）

通訊作者：黃華艷（1974-），https：//orcid.org/0000-0003-2436-862X，正高級(jí)工程師，主要從事林木病蟲(chóng)害防治研究工作，E-mail：258939303@qq.com

第一作者：廖旺姣（1980-），https：//orcid.org/0000-0002-1378-1358，高級(jí)工程師，主要從事林木病害防治研究工作，E-mail：liaowangjiao@126.com