不同穿膜肽載體轉(zhuǎn)染對豬精子受精能力的影響

陳集成 黃秀蕓 鄭自華 韋英明 楊素芳

摘要：【目的】明確修飾基因組通過穿膜肽載體轉(zhuǎn)染精子的可行性及穿膜肽載體對精子和受精卵的影響，為實現(xiàn)安全有效地大批量制備豬轉(zhuǎn)基因胚胎提供技術(shù)支撐?！痉椒ā恳运ohlh2基因為目的基因，通過細胞穿膜肽（C105y、MPG和TAT）和慢病毒介導轉(zhuǎn)染豬精子后，采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染精子形態(tài)特征的變化，利用精子圖像分析儀（CASA）檢測精子活率、平均曲線運動速度（VCL）、平均直線運動速度（VSL）和前向性（STR）等指標，運用精子頂體染色試劑盒測定豬精子頂體反應(yīng)，并通過體外受精進一步驗證不同載體轉(zhuǎn)染制備生產(chǎn)轉(zhuǎn)Sohlh基因豬胚胎的效果?！窘Y(jié)果】轉(zhuǎn)染后的豬精子頂體結(jié)構(gòu)完整，細胞膜未見破裂;不同細胞穿膜肽（C105y、MPG和TAT）的豬精子轉(zhuǎn)染陽性率分別為56.74%、50.44%和43.58%，低于慢病毒的轉(zhuǎn)染陽性率（61.48%），但差異不顯著（P>0.05，下同）。經(jīng)穿膜肽C105y轉(zhuǎn)染24 h，豬精子活率（70.09%）、平均直線運動速度（35.36 μm/s）、平均曲線運動速度（42.20 μm/s）、前向性（1.03 μm/s）與對照組相比差異均不顯著;而經(jīng)穿膜肽MPG和TAT及慢病毒轉(zhuǎn)染后，豬精子的各項指標均呈一定程度的下降趨勢。細胞穿膜肽轉(zhuǎn)染豬精子的自發(fā)頂體反應(yīng)率與對照組相比無顯著差異，慢病毒轉(zhuǎn)染則呈顯著的上升趨勢（P<0.05，下同）;在誘發(fā)頂體反應(yīng)率方面，慢病毒轉(zhuǎn)染豬精子的誘發(fā)頂體反應(yīng)率較對照組呈顯著下降趨勢，而不同細胞穿膜肽轉(zhuǎn)染對豬精子誘發(fā)頂體反應(yīng)率也無顯著影響。慢病毒和穿膜肽C105y轉(zhuǎn)染豬精子經(jīng)體外受精獲得的受精卵繼續(xù)培養(yǎng)24 h后其卵裂率為64.82%和65.91%，與對照組受精卵的卵裂率（64.52%）差異不顯著;穿膜肽C105y轉(zhuǎn)染組的囊胚率（15.82%）與對照組間無顯著差異，而慢病毒轉(zhuǎn)染組的囊胚率（9.11%）顯著低于對照組;在轉(zhuǎn)基因胚胎陽性率方面，穿膜肽C105y轉(zhuǎn)染組顯著低于慢病毒轉(zhuǎn)染組（8.54% vs 10.38%）?！窘Y(jié)論】穿膜肽C105y對豬精子的受精能力及轉(zhuǎn)基因豬胚胎發(fā)育影響小，且毒害作用不明顯，是一個能高效轉(zhuǎn)導外源基因的安全載體。

關(guān)鍵詞： 穿膜肽載體;豬精子;慢病毒;受精能力;體外受精;轉(zhuǎn)染

中圖分類號： S828.34? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）04-0958-11

Effects of different transmembrane peptide carriers on pig sperm insemination ability

CHEN Ji-cheng1，2， HUANG Xiu-yun3， ZHENG Zi-hua1， WEI Ying-ming1*， YANG Su-fang1*

（1State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources/Guangxi University， Nanning，Guangxi? 530004， China; 2Guangxi Agricultural Vocational University， Nanning， Guangxi? 530007， China; 3Guangxi Polytechnic of Construction， Nanning， Guangxi? 530007， China）

Abstract：【Objective】To clarify the feasibility of transfection of modified genome into spermatozoa by transmembrane peptide and the effect of transmembrane peptide on spermatozoa and fertilized eggs， so as to provide technical support for the safe and effective mass production of pig transgenic embryos. 【Method】 With buffalo Sohlh2 gene as the target gene， pig spermatozoa were transfected by cell membrane penetrating peptide （C105y， MPG and TAT） and lentivirus. Morphological characteristics of transfected spermatozoa were observed by laser confocal scanning microscope. Sperm viability， mean curvilinear velocity （VCL）， mean linear velocity （VSL） and forward tropism （STR） were detected by sperm image analyzer （CASA）， Sperm acrosome staining kit （psa-fitc） was used to detect pig sperm acrosome reaction， and in vitro fertilization was used to further verify the effect of different vector transfection on the production of Sohlh transgenic pig embryos. 【Result】The acrosome structure of transfected pig sperm was intact， and the cell membrane was not broken. The positive rates of pig sperm transfection with different cell penetrating peptides （C105y， MPG and TAT） were 56.74%， 50.44% and 43.58% respectively， which were lower than that of lentivirus （61.48%）， but the difference was not significant （P>0.05， the same below）. After transfection with membrane penetrating peptide C105y for 24 hours， the pig sperm viability （70.09%） and the average linear velocity （35.36 μm/s）， average curve velocity （42.20 μm/s）， forward directivity （1.03 μm/s）， compared with the control group， the difference was not significant. After transfection with membrane penetrating peptides MPG， TAT and lentivirus， the indexes of pig sperm showed a downward trend to some extent. There was no significant difference in the incidence of spontaneous acrosome reaction in pig spermatozoa transfected with cell penetrating peptide compared with the control group， but there was a significant upward trend in lentivirus transfection （P<0.05， the same below）. In the aspect of inducing acrosome reaction rate， the rate of inducing acrosome reaction in pig sperm transfected with lentivirus was significantly lower than that in the control group， while the rate of inducing acrosome reaction in pig sperm transfected with different cell penetrating peptides had no significant effect. The cleavage rates of the fertilized eggs obtained from porcine sperm transfected with lentivirus and transmembrane peptide C105y after in vitro fertilization were 64.82% and 65.91% after 24 hours of culture， which were not significantly different from those of the control group （64.52%）. There was no significant difference in the blastocyst rate （15.8%） between the transfected group and the control group， but the blastocyst rate （9.11%） in the lentivirus transfected group was significantly lower than that in the control group. In terms of the positive rate of transgenic embryos， the membrane penetrating peptide C105y transfection group was significantly lower than that of the lentivirus transfection group （8.54% vs 10.38%）. 【Conclusion 】Membrane penetrating peptide C105y has little effect on the fertilization ability of pig sperm and the development of transgenic pig embryos， and its toxic effect is not obvious. It is a safe vector for efficient transduction of foreign genes.

Key words： transmembrane peptide; pig sperm; lentivirus; fertilization ability; in vitro fertilization; transfection

Foundation items： National Natural Science Foundation of China （31860644）; National Modern Agricultural Industrial Technology System Guangxi Innovation Team Construction Project （nycytxgxcxtd-2021-09-01）; Guangxi Natural Science Foundation Project （2019GXNSFDA185002）

0 引言

【研究意義】豬和人類在解剖學、生理學上具有極大的相似性，是人類異種器官移植的理想來源（蘭宗寶等，2008;潘斌等，2011;孫武和娜日蘇，2015），但強烈的排斥反應(yīng)阻礙著該設(shè)想的臨床實施，而通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造豬的遺傳性狀以適應(yīng)人類性狀有望解決超排斥的問題。據(jù)報道，2022年1月7日美國馬里蘭大學醫(yī)學院團隊成功對一名晚期心臟病男性患者實施全球首例轉(zhuǎn)基因豬心臟移植（Servick，2022），進一步證實經(jīng)基因編輯后的豬器官可作為異種器官移植來源。轉(zhuǎn)基因豬的獲得方法有逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、DNA顯微注射法、基因打靶技術(shù)及精子載體法等（高晗和鐘蓓，2020），其中，精子載體法的原理是利用精子具有自主結(jié)合并內(nèi)化轉(zhuǎn)運外源DNA的能力，可作為載體攜帶外源DNA進入卵母細胞，具有簡單便捷、應(yīng)用廣泛和成本低等特點，是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的有效途徑之一，利用該技術(shù)已成功獲得小鼠、家兔、豬、牛、雞、綿羊等轉(zhuǎn)基因動物（Sperandio et al.，1996;Lavitrano et al.，2003;Shen et al.，2006;Harel-Markowitz et al.，2009）。但精子載體法也存在重復率較低及外源DNA未能整合進入基因組而游離在外的問題（Chaparian et al.，2016），精子細胞膜阻止外源基因進入是主要原因，且利用慢病毒等載體易對精子的受精能力產(chǎn)生一定影響（蔡偉光等，2013）。穿膜肽載體具有安全低毒的特點，可有效穿透精子細胞膜（陳厚仰等，2014;Rádis-Baptista et al.，2017），但其對精子受精能力的影響尚未明確。因此，探究穿膜肽載體對精子受精能力的影響，對成功安全開展豬精子載體法大量培育轉(zhuǎn)基因豬及有效解決臨床醫(yī)學中異種器官移植的超排斥問題具有重要意義。【前人研究進展】早在20世紀70年代，Brackett等（1971）就將家兔精子與H3標記的SV40基因共培養(yǎng)后進行體外受精，結(jié)果發(fā)現(xiàn)家兔精子在受精過程中能將外源DNA帶入卵母細胞，由此開啟了精子介導外源DNA轉(zhuǎn)移的研究工作。但精子載體法一直存在陽性率不高的問題，主要是缺乏有效載體將外源基因送入精子內(nèi)（Gandolfi，2000）。慢病毒載體是一種外源性的轉(zhuǎn)基因載體，是以人類免疫缺陷I型病毒（HIV-1）為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體系統(tǒng)（湯晗等，2017），可有效將外源基因整合到宿主染色體上，但慢病毒有一定細胞毒性及遺傳毒性，有報道稱慢病毒易導致細胞腫瘤化（Montini et al.，2006）。細胞穿膜肽（Cell-penetrating peptides，CPPs）是一種以內(nèi)吞方式直接穿過細胞膜的多肽，自1988年被發(fā)現(xiàn)以來，已有數(shù)百種細胞穿膜肽被發(fā)現(xiàn)報道（Wang et al.，2014），根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點可分為陽離子型、兩親性型和疏水型（Guidotti et al.，2017）。Li等（2018）研究表明，與慢病毒等載體相比，細胞穿膜肽只有在2 μmol/L的高劑量下才表現(xiàn)出細胞毒性。在穿膜活性方面，TAT、MPG-8及Bac-7等穿膜肽能顯著將生物活性親水性分子，如藥物、核酸（DNA和RNA）甚至高分子量蛋白，轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)和細胞器內(nèi)（梅雋彥，2020）。閆可心等（2021）研究表明穿膜肽R9和TAT均可輕易通過血腦屏障，即以穿膜肽作為藥物的高效載體能將藥物轉(zhuǎn)運到大腦，使其對大腦有更強更好的藥效。除了傳導藥物外，穿膜肽還能轉(zhuǎn)導外源基因，促使基因和蛋白表達的改變、誘導多能干細胞重編程和分化，以及推進細胞疫苗制備。王軍（2013）利用重疊PCR將細胞穿膜肽TAT與c-Myc和Nanog基因片段融合，成功將外源基因Oct4、c-Myc等導入成體細胞使其重編程，最終獲得具有類似于干細胞性質(zhì)的誘導多功能干細胞。陳厚仰等（2014）通過構(gòu)建細胞穿膜肽TAT與EGFP融合蛋白的原核表達系統(tǒng)，并鑒定其對人類成熟精子的活性，結(jié)果表明穿膜肽對精子也有穿膜作用，將外源基因帶入人類精子的穿膜效率達65.27%。此外，已有研究證實將精子載體法（Sperm-mediated gene transfer，SMGT）與體外受精（In vitro fertilization，IVF）相結(jié)合能高效制備轉(zhuǎn)基因小鼠（Lavitrano et al.，1989），但體外受精需要完全正常的精子才能進行?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關(guān)細胞穿膜肽作用于精子的研究主要集中在穿膜肽對精子的穿膜活性方面（Jones，2013;陳厚仰等，2014），而針對細胞穿膜肽影響動物精子受精能力及通過體外受精生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因胚胎陽性率的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以水牛Sohlh2基因為目的基因，通過穿膜肽介導轉(zhuǎn)染豬精子后觀察轉(zhuǎn)染精子形態(tài)特征的變化，使用精子全自動分析系統(tǒng)檢測不同載體對轉(zhuǎn)染豬精子各生化指標的影響，并通過體外受精制備轉(zhuǎn)Sohlh2基因豬胚胎，明確修飾基因組通過穿膜肽載體轉(zhuǎn)染精子的可行性及穿膜肽載體對精子和受精卵的影響，為實現(xiàn)安全有效地大批量制備轉(zhuǎn)基因豬胚胎提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

新鮮豬精液由廣西畜禽品種改良站采集提供，水牛Sohlh2基因由亞熱帶生物資源保護利用國家重點試驗室克隆獲得。豬精液常溫稀釋劑基礎(chǔ)液參照陳東峰（2013）的方法進行配制，具體成分如表1所示。胚胎培養(yǎng)液（PCM）：NCSU.23基礎(chǔ)液+0.5%牛血清白蛋白（BSA）。卵巢保存及運輸液：含K+、Ca2+及Mg2+的生理鹽水。受精液（PFM）：mTBM液+113.1 mmol/L NaCl+3.0 mmol/L KCl+7.5 mmol/L CaCl2·2H2O+20.0 mmol/L Tris+11.0 mmol/L葡萄糖+5.0 mmol/L丙酮酸鈉（含0.5 mmol/L咖啡因和0.2% BSA）。0.1%透明質(zhì)酸酶：稱取100 mg透明質(zhì)酸酶，以胚胎培養(yǎng)液溶解，最終定容至100 mL。以上配制好的試劑均采用孔徑0.22 μm的微孔濾膜過濾消毒，分裝后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 精液稀釋與保存

精液稀釋液先在水浴鍋中預(yù)熱，使其溫度保持在35.0 ℃左右。采集的豬精液要求在45 min內(nèi)保溫運回實驗室，放入水浴鍋中靜止5 min，以確保與稀釋液溫度一致。取混勻后的原精液5 μL制片（載玻片和蓋玻片先預(yù)熱至38.0 ℃），通過精子圖像分析儀（CASA）對豬精子的活力和密度等進行觀察并記錄（精子活力要求在0.7以上，密度要求在1.5億個/mL以上），然后按照3倍稀釋的原則對原精液進行稀釋，稀釋時將稀釋液沿著管壁緩慢加入豬精液中，邊加入邊輕微晃動，使精液與稀釋液充分接觸（李平等，2020）。豬精液稀釋后的密度保持在3.0×107～5.0×107個/mL。在室溫環(huán)境（20.0～25.0 ℃）下避光放置1 h后進行溫度平衡，然后用毛巾包裹數(shù)十層，放入17.0 ℃恒溫箱中保存（陳東峰，2013）。

1. 3 慢病毒載體構(gòu)建及包裝

采用EcoR I和Xba I分別雙酶切pLvx-ires-zsgreen載體和pMD18-T-Sohlh2，回收酶切產(chǎn)物，通過T4連接法將Sohlh2基因連接至pLvx-ires-zsgreen載體上，即構(gòu)建獲得慢病毒載體（pLvx-ires-zsgreen-Sohlh2）。pLvx-ires-zsgreen-Sohlh2逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝：在病毒包裝前16～20 h將Plat-GP包裝細胞接種至60 mm的細胞培養(yǎng)皿中，并于轉(zhuǎn)染前2～4 h換取3 mL的無血清DMEM。在1 mL的無血清DMEM中加入9 μg 慢病毒載體和9 μL Plus，混勻，室溫孵育5 min;再加入12 μL LTX，混勻，室溫孵育30 min后均勻滴加至細胞培養(yǎng)皿中;4～6 h后換取正常的培養(yǎng)基;轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡觀察，并收集病毒上清液，0.45 μm濾器過濾備用。

1. 4 精子轉(zhuǎn)染及激光共聚焦掃描顯微鏡觀察

細胞穿膜肽室溫放置30 min，于28.0 ℃水浴鍋中平衡液體。向1.5 mL的離心管中加入50 μL無血清DMEM及4 μL細胞穿膜肽，同時向另一支1.5 mL的離心管中加入50 μL無血清DMEM及2 μg制備好的Sohlh2基因質(zhì)粒;混勻2支離心管中的液體，放入37.0 ℃恒溫箱中靜置20 min。以4 μL去離子水混合50 μL無血清DMEM為對照組。將100 μL轉(zhuǎn)染液體滴加至經(jīng)3倍稀釋豬精液（300 μL）中;混合后的豬精液在室溫下避光放置1 h后進行溫度平衡，在熒光顯微鏡450～490 nm激發(fā)光下油鏡觀察涂片。同時利用血細胞計數(shù)器計數(shù)400個以上豬精子，統(tǒng)計其中的發(fā)光精子數(shù)量。備用的豬精液以0.85% NaCl洗滌2次后，3500 r/min離心10 min，棄上清液，再沿離心管內(nèi)壁緩慢加入2.5%戊二醛固定液，4.0 ℃冰箱內(nèi)固定2～4 h，蒸餾水清洗，以激光共聚焦掃描顯微鏡進行觀察，重點觀察精子發(fā)光部位。

1. 5 精子質(zhì)量檢測

檢測時先將從恒溫箱中取出的精液樣品放入35.0～37.0 ℃水浴鍋中預(yù)熱20～30 min，用移液槍輕輕吹打精液樣品使其混合均勻，隨機吸取3～5 μL精液樣本滴在載玻片（預(yù)熱38.0 ℃）上，蓋上蓋玻片（預(yù)熱38.0 ℃）后置于恒熱加熱板上，待精液樣品靜止穩(wěn)定再通過精子圖像分析儀（CASA）檢測精子活率（Motility）、平均曲線運動速度（VCL）、平均直線運動速度（VSL）及前向性（STR）。

1. 6 卵母細胞采集與培養(yǎng)

豬卵巢采自屠宰場的青年母豬，將卵巢放入裝有35.0 ℃生理鹽水的保溫瓶內(nèi)，運送回實驗室的時間控制在1 h內(nèi)。采用眼科剪去除卵巢周圍的脂肪及結(jié)締組織，于超凈恒溫操作臺上用一次性的10 mL注射器抽取直徑2～6 mm卵泡內(nèi)的卵泡液（含卵母細胞），實體視顯微鏡下挑選出卵母細胞，將具有完整形態(tài)的卵丘卵母細胞復合體移入盛有l(wèi) mL成熟培養(yǎng)液（PMH）的培養(yǎng)皿中，每皿200枚，置于38.5 ℃、5% CO2及最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中體外成熟培養(yǎng)24 h，再轉(zhuǎn)移至成熟液（PM）培養(yǎng)22 h。成熟培養(yǎng)結(jié)束后，用200 mL移液槍反復吹打去除卵母細胞周圍的卵丘細胞，放入添加有0.1%透明質(zhì)酸酶的胚胎培養(yǎng)液中繼續(xù)吹打1 min，以除去剩余的卵丘細胞，經(jīng)培養(yǎng)液洗滌后挑選出具有第一極體的成熟卵母細胞，備用。

1. 7 精子準備處理

將新鮮采集且3倍稀釋的豬精液迅速帶回實驗室，取200 mL稀釋精液小心置于含2 mL受精液（預(yù)熱38.5 ℃）的圓底試管底部，懸浮30 min后將上層液吸出，1900 r/min離心3 min，棄上清液，再添加洗清液至2 mL，800 r/min離心3 min，棄上清液，最后將試管底部的沉淀用1 mL受精液重懸，室溫（26.0 ℃）下存放備用。

1. 8 精子頂體染色試劑盒測定豬精子頂體反應(yīng)

依照ARIC檢測試劑盒說明，采用密度梯度離心法聯(lián)合上游法處理液化好的精液，調(diào)整濃度至1×106個/mL后等分成2管，置于5% CO2、37.0 ℃下孵育3 h，以誘導精子獲能。其中一管加入鈣離子載體A23187誘發(fā)15 min（誘發(fā)管），另一管不加鈣離子載體A23187但同步孵育15 min（自發(fā)管），頂體反應(yīng)結(jié)束后，500 r/min離心5 min，PBS清洗1次，然后以50 μL PBS重懸獲得精子懸液。涂片（每片10 μL）后在空氣中完全干燥，4% PFA室溫固定10 min，PBS洗5 min，重復2次。以豌豆凝集素熒光標記（PSA-FITC）4.0 ℃孵育過夜，熒光顯微鏡450～490 nm激發(fā)光下油鏡觀察涂片以檢測精子頂體反應(yīng)。利用血細胞計數(shù)器計數(shù)400個以上豬精子，統(tǒng)計誘發(fā)頂體發(fā)生數(shù)量及自發(fā)頂體發(fā)生數(shù)量。自發(fā)頂體反應(yīng)率（%）=自發(fā)頂體發(fā)生數(shù)/檢測精子總數(shù)×100;誘發(fā)頂體反應(yīng)率（%）=誘發(fā)頂體發(fā)生數(shù)/檢測精子總數(shù)×100。

1. 9 精子載體法+體外受精（SMGT+IVF）

將預(yù)處理的豬精液（約20 μL）與30個具有第一極體的成熟豬卵母細胞置于受精液滴（50 μL）中，精卵比例約1000∶1，置于5% CO2、38.5 ℃和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中共孵育6 h，然后取出以洗卵液充分洗滌，再放入50 μL的胚胎培養(yǎng)液滴中，繼續(xù)培養(yǎng)觀察其發(fā)育情況，并做好記錄。

1. 10 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)分別采用SPSS 22.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）及Duncan?s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 轉(zhuǎn)染前后豬精子形態(tài)特征的變化情況

3種細胞穿膜肽（C105y、MPG和TAT）轉(zhuǎn)染豬精子24 h的效果如圖1所示。經(jīng)細胞穿膜肽轉(zhuǎn)染后各處理組的豬精子頂體結(jié)構(gòu)完整，細胞膜未見破裂;C105y組、MPG組、TAT組和慢病毒組均有精子發(fā)出綠色熒光，在不同細胞穿膜肽（C105y、MPG和TAT）處理組中以穿膜肽C105y轉(zhuǎn)染后獲得的發(fā)綠色熒光精子數(shù)量最多。經(jīng)統(tǒng)計，C105y組、MPG組、TAT組的豬精子轉(zhuǎn)染陽性率分別為56.74%、50.44%和43.58%，均低于慢病毒組（61.48%），但差異不顯著（P>0.05，下同）。圖2所示為穿膜肽C105y轉(zhuǎn)染豬精子后其頂體部位發(fā)出綠色熒光，說明外源水牛Sohlh2基因已成功轉(zhuǎn)染豬精子。

2. 2 不同穿膜肽載體轉(zhuǎn)染對豬精子活率的影響

采用精子圖像分析儀（CASA）檢測轉(zhuǎn)染后的豬精子活率，結(jié)果如表2所示。3種細胞穿膜肽（C105y、Mpg和TAT）轉(zhuǎn)染24 h的豬精子活率分別為70.09%、66.40%和64.73%，與對照組的豬精子活率（74.02%）差異不顯著，以穿膜肽C105y轉(zhuǎn)染對豬精子活率的影響最小;經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染24 h后豬精子活率降至60.69%，顯著低于對照組和C105y組（P<0.05，下同）。不同載體轉(zhuǎn)染48 h后，豬精子活率呈明顯下降趨勢，與對照組的差異均達顯著差異水平。

2. 3 不同穿膜肽載體轉(zhuǎn)染對豬精子平均直線運動速度的影響

采用精子圖像分析儀（CASA）檢測轉(zhuǎn)染后的豬精子平均直線運動速度，結(jié)果如表3所示。穿膜肽C105y轉(zhuǎn)染24 h，豬精子平均直線運動速度為35.36 μm/s，與對照組相（36.80 μm/s）的差異不顯著，但顯著高于MPG組（31.15 μm/s）和慢病毒組（21.74 μm/s）。不同載體轉(zhuǎn)染48 h后，轉(zhuǎn)染豬精子平均直線運動速度均顯著低于對照組。

2. 4 不同穿膜肽載體轉(zhuǎn)染對豬精子平均曲線運動速度的影響

采用精子圖像分析儀（CASA）檢測轉(zhuǎn)染后的豬精子平均曲線運動速度，結(jié)果如表4所示。經(jīng)穿膜肽C105y轉(zhuǎn)染24 h，豬精子平均曲線運動速度（42.20 μm/s）與對照組（45.78 μm/s）相比差異不顯著，而經(jīng)其他細胞穿膜肽（MPG和TAT）和慢病毒轉(zhuǎn)染后的豬精子平均曲線運動速度與對照組間存在顯著差異。不同載體轉(zhuǎn)染48 h后，以慢病毒轉(zhuǎn)染對豬精子平均曲線運動速率的影響最大，與對照組間存在顯著差異，而不同細胞穿膜肽（C105y、MPG和TAT）轉(zhuǎn)染的豬精子平均曲線運動速率（30.64、29.17和29.28 μm/s）與對照組相比差異均不顯著。

2. 5 不同穿膜肽載體轉(zhuǎn)染對豬精子前向性的影響

由表5可得知，經(jīng)穿膜肽TAT和慢病毒轉(zhuǎn)染24 h，豬精子前向性分別為0.97和0.92 μm/s，與對照組（1.12 μm/s）間存在顯著差異，但與穿膜肽C105y和MPG轉(zhuǎn)染的豬精子相比差異不顯著。至轉(zhuǎn)染48 h后，慢病毒轉(zhuǎn)染的豬精子前向性（0.80 μm/s）顯著低于比對照組（1.11 μm/s），但與不同細胞穿膜肽（C105y、MPG和TAT）轉(zhuǎn)染的豬精子前向性（0.95、0.93和0.91 μm/s）相比差異均不顯著。

2. 6 轉(zhuǎn)染后豬精子頂體反應(yīng)率變化的測定結(jié)果

由表6可知，細胞穿膜肽（C105y、MPG和Tat）轉(zhuǎn)染1 h后，豬精子的自發(fā)頂體反應(yīng)率分別為5.71%、5.42%和5.71%，與對照組豬精子的自發(fā)頂體反應(yīng)率（5.80%）無顯著差異，而經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后豬精子的自發(fā)頂體反應(yīng)率（7.21%）呈顯著上升趨勢。在誘發(fā)頂體反應(yīng)率方面，慢病毒轉(zhuǎn)染豬精子的誘發(fā)頂體反應(yīng)率（25.22%）較對照組（36.22%）呈顯著下降趨勢，而不同細胞穿膜肽轉(zhuǎn)染對豬精子誘發(fā)頂體反應(yīng)率無顯著影響。

2. 7 慢病毒和穿膜肽C105y轉(zhuǎn)染對轉(zhuǎn)Sohlh2基因豬胚胎發(fā)育的影響

通過體外受精進一步驗證不同載體轉(zhuǎn)染制備生產(chǎn)轉(zhuǎn)Sohlh基因豬胚胎的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)慢病毒和穿膜肽C105y轉(zhuǎn)染的豬精子與體外培養(yǎng)成熟豬卵母細胞進行體外受精均能獲得受精卵，在熒光顯微鏡下能觀察到均勻的綠色熒光，且慢病毒轉(zhuǎn)染的受精卵發(fā)出綠色熒光較強烈（圖3），而對照組的受精卵未觀察到綠色熒光。轉(zhuǎn)Sohlh基因豬胚胎發(fā)育結(jié)果（表7）顯示，慢病毒和穿膜肽C105y轉(zhuǎn)染的受精卵體外繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，其卵裂率為64.82%和65.91%，與對照組受精卵的卵裂率（64.52%）差異不顯著;穿膜肽C105y轉(zhuǎn)染組的囊胚率（15.82%）與對照組（13.80%）間無顯著差異，而慢病毒轉(zhuǎn)染組的囊胚率（9.11%）顯著低于對照組;在轉(zhuǎn)基因胚胎陽性率方面，穿膜肽C105y轉(zhuǎn)染組顯著低于慢病毒轉(zhuǎn)染組（8.54% vs 10.38%）。

3 討論

3. 1 穿膜肽載體轉(zhuǎn)染方式對豬精子功能的影響

精子載體法是制備轉(zhuǎn)基因豬的重要手段，而介導外源基因進入精子的穿膜肽安全性及其對精子功能的影響，是利用精子載體法+體外受精成功制備轉(zhuǎn)基因豬的關(guān)鍵，目前國內(nèi)外針對精子正常功能的研究主要涉及精子能動性參數(shù)、精子頂體反應(yīng)及體外受精能力。采用精液稀釋劑可有效延長豬精液保存期限。陳東峰（2013）研究表明，使用稀釋劑3倍稀釋豬精液，7 d后的活精子數(shù)（70.84±1.81）與剛稀釋時（88.20±1.48）無顯著差異，精子質(zhì)膜完整率及頂體完整率也無顯著變化，說明稀釋劑能有效延長豬精液保存期限，且對精子的受精能力無顯著影響。頂體反應(yīng)是完成受精的必要條件，不僅促使精子穿透卵母細胞，還能釋放頂體內(nèi)容物中的大量水解酶而激活精子與卵母細胞相互融合，只有發(fā)生頂體反應(yīng)的精子才能完成體外受精（何晨，2020）。已有研究表明，精子在與透明帶結(jié)合前發(fā)生頂體反應(yīng)會影響其受精能力，因此檢測精子是否存在自發(fā)頂體反應(yīng)是判斷其受精能力的重要手段（劉樹沅等，2018），當精子自發(fā)頂體反應(yīng)率≥9.52%時，其受精能力受到明顯影響，需要人工助孕措施（陳其桂等，2020）。在本研究中，慢病毒轉(zhuǎn)染致使豬精子的自發(fā)頂體反應(yīng)率顯著升高，而經(jīng)細胞穿膜肽（C105y、Mpg和Tat）轉(zhuǎn)染的豬精子自發(fā)頂體反應(yīng)率與對照組無顯著差異。此外，使用鈣離子載體A23187體外誘導Ca2+進入精子內(nèi)部獲能后即發(fā)生頂體反應(yīng)，是世界衛(wèi)生組織（World health organization，WHO）推薦的精子受精能力評估指標（許世艷等，2021）。Katsuki等（2005）預(yù)測表明，體外受精時完全不受精的頂體反應(yīng)率閾值是21.00%，建議當頂體反應(yīng)率<21.00%時宜選擇人工助孕。本研究結(jié)果表明，細胞穿膜肽（C105y、Mpg和TAT）和慢病毒轉(zhuǎn)染的豬精子誘發(fā)頂體反應(yīng)率均在21.00%以上，慢病毒轉(zhuǎn)染的豬精子誘發(fā)頂體反應(yīng)率顯著低于對照組，而細胞穿膜肽轉(zhuǎn)染對豬精子誘發(fā)頂體反應(yīng)率無顯著影響，說明細胞穿膜肽對豬精子頂體反應(yīng)的影響不明顯。

除了頂體反應(yīng)外，精子能動性參數(shù)也影響其受精能力，包括精子活率、平均直線運動速度、平均曲線運動速度及前向性（陳永霞等，2018）。根據(jù)GB/T 25172—2010《豬常溫精液生產(chǎn)與保存技術(shù)規(guī)范》和GB 23238—2009《種豬常溫精液》的定義，精子活率是指在37.0 ℃下呈直線前進運動精子數(shù)占精子總數(shù)的百分率。因此，利用全自動精子分析儀測定豬精液中呈直線前進運動的精子數(shù)量即可獲知豬常溫下的精子活率。精子活率是反映精子質(zhì)量和衡量轉(zhuǎn)染精子能否受精的一項重要指標。除了常規(guī)指標外，動態(tài)指標也能間接反映精子的受精能力。胡國娟（2020）研究表明，豬精子能動性參數(shù)和正常形態(tài)精子的比例與其體外受精率及妊娠率顯著相關(guān);范妮等（2021）研究發(fā)現(xiàn)精子密度、精子活率、前向運動率及正常形態(tài)率與人類精子的受精能力呈正相關(guān)。精子活率是精液品質(zhì)的重要指標，豬的人工授精成功率主要受精子活率的影響，一般要求精子活率在60.00%以上。馮文武等（2021）對長白豬、杜洛克及柯樂豬等3個品種的精子活率和能動性參數(shù)進行測定，發(fā)現(xiàn)精子的動態(tài)指標對其存活時間影響顯著，且柯樂豬的精子活率高于其他良種豬。為此，本研究通過測定精子活率、平均曲線運動速度、平均直線運動速度及前向性等指標，以確定各種載體轉(zhuǎn)染對豬精子受精能力的影響，結(jié)果表明，C105y、TAT和Mpg等3種細胞穿膜肽轉(zhuǎn)染對豬精子活率的影響相對較小，具體表現(xiàn)為穿膜肽C105y和TAT轉(zhuǎn)染對豬精子直線運動速度影響較小，穿膜肽C105y轉(zhuǎn)染對豬精子平均曲線運動速度影響最小，穿膜肽C105y和Mpg轉(zhuǎn)染對豬精子前向性影響不明顯。以慢病毒轉(zhuǎn)染的豬精子各項指標均呈顯著下降趨勢，說明慢病毒對豬精子有毒性。綜上所述，C105y是最適于豬體外受精的穿膜肽載體，對各項指數(shù)影響較小。C105y屬于疏水性穿膜肽，而疏水性是其高效率運輸修飾基因組通過細胞膜到達精子內(nèi)部的關(guān)鍵（P?rnaste et al.，2017）。Jones等（2013）利用3種穿膜肽（C105y、Cyt c5–13和Camptide）轉(zhuǎn)染處理人類精子3 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3種穿膜肽對精子活率的影響都很小。本研究也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)穿膜肽C105y轉(zhuǎn)染24 h，豬精子活率仍高達70.09%，與對照組的豬精子活率差異不顯著，即穿膜肽C105y轉(zhuǎn)染對豬精子活率的影響最小。

3. 2 穿膜肽C105y對轉(zhuǎn)Sohlh基因豬胚胎發(fā)育的影響

精子的受精能力除了體現(xiàn)在各項指標正常外，更表現(xiàn)在受精卵的正常發(fā)育方面，只有制備產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因胚胎陽性率高且不受影響，才能真正體現(xiàn)出穿膜肽既有穿透效率又對精子低毒的價值。精子獲取外源基因的能力可因新介質(zhì)的使用而顯著增加（Gong et al.，2018）。最新研究表明，許多穿膜肽已成功將寡核苷酸、蛋白質(zhì)和載藥納米顆粒等物質(zhì)運送至哺乳動物細胞群體，精子作為重要的動物細胞群體之一，還具有產(chǎn)生下一代基因載體的作用（Hadar et al.，2018）。精子的運動狀態(tài)受大劑量DNA抑制影響，究其原因可能是精子內(nèi)容物受大劑量脂質(zhì)體的毒性影響。Rostami等（2018）使用新型穿膜肽M918成功將熱休克蛋白（Hsp）基因轉(zhuǎn)運至HEK-293T哺乳動物細胞系中，并證實穿膜肽M918的轉(zhuǎn)染效率顯著高于單一使用Nef或Hsp20-Nef的轉(zhuǎn)染效率，即穿膜肽M918能有效增加Hsp20-Nef的穿透效果。慢病毒等介質(zhì)雖然也能有效介導外源基因進入靶細胞內(nèi)，但對靶細胞具有一定的毒害作用（蔡偉光等，2013）。穿膜肽不僅可有效促使生殖細胞攝取外源基因，且對精子無毒害作用，不影響其受精能力。

本研究以濃縮滴度達108的慢病毒為陽性對照載體，結(jié)果顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染豬精子體外受精獲得的轉(zhuǎn)基因胚胎陽性率（10.38%）略高于穿膜肽C105y轉(zhuǎn)染的豬精子（8.54%），但二者差異不顯著。由于慢病毒對精子具有一定的毒害作用，因此其受精卵的囊胚率（9.11%）顯著低于穿膜肽C105y（15.82%）。冉林武等（2017）研究表明，通過睪丸注射慢病毒載體能制備獲得轉(zhuǎn)基因小鼠，其仔代轉(zhuǎn)基因小鼠陽性率最高為35%，即慢病毒孵育精子可得到陽性后代。盡管慢病毒轉(zhuǎn)染效率高，但利用精子載體法進行人工授精時顯著影響其受胎率，孫克寧（2011）以慢病毒先孵育精子后進行體外受精，并未得到陽性結(jié)果，但采用低滴度的慢病毒（106 TU/mL）轉(zhuǎn)染小鼠受精卵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受精卵的陽性率為8.3%。此外，慢病毒具有一定的遺傳毒性，易導致轉(zhuǎn)基因動物觸發(fā)癌癥（陳彩云等，2012）。本研究采用精子載體法聯(lián)合體外受精，結(jié)果獲得8.54%的轉(zhuǎn)基因胚胎陽性率，略高于孫克寧（2011）直接以慢病毒感染受精卵的陽性率，但今后仍需進一步提高轉(zhuǎn)基因胚胎陽性率以滿足制備生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的需求。

4 結(jié)論

穿膜肽C105y對豬精子的受精能力及轉(zhuǎn)基因豬胚胎發(fā)育影響小，且毒害作用不明顯，是一個能高效轉(zhuǎn)導外源基因的安全載體。

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收稿日期：2022-01-20

基金項目：國家自然科學基金項目（31860644）;國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣西創(chuàng)新團隊建設(shè)項目（nycytxgxcxtd-2021-09-01）;廣西自然科學基金項目（2019GXNSFDA185002）

通訊作者：韋英明（1962-），https：//orcid.org/0000-0003-4458-9139，研究員，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究工作，E-mail：dkywym@163.com;楊素芳（1972-），https：//orcid.org/0000-0002-4648-0201，博士，教授，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究工作，E-mail：85997362@qq.com

第一作者：陳集成（1986-），https：//orcid.org/0000-0002-9091-1013，研究方向為動物遺傳育種與繁殖，E-mail：2035977949@qq.com