不同環(huán)境脅迫因子對豬源耐藥大腸桿菌生長的影響

廖書丹 譚艾娟 孫海峰 向潤 楊劍 張?jiān)?宋旭琴 呂世明

摘要：【目的】探究環(huán)境脅迫因子對豬源多重耐藥大腸桿菌生存適應(yīng)性的影響，為創(chuàng)造多重耐藥菌株帶來高適應(yīng)代價(jià)的環(huán)境及加速降低種群耐藥水平提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳苑蛛x自貴州省規(guī)?；i場的多重耐藥大腸桿菌QL15為研究對象，以大腸桿菌質(zhì)控（敏感）菌株ATCC25922為對照，經(jīng)體外競爭試驗(yàn)測定不同環(huán)境（培養(yǎng)基濃度、碳源、氮源、pH和溫度）脅迫下耐藥菌株QL15相對于敏感菌株ATCC25922的適應(yīng)性，并通過重測序變異位點(diǎn)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定分析耐藥基因表型及外排泵和外膜孔道蛋白基因表達(dá)與細(xì)菌適應(yīng)性代價(jià)的關(guān)系?！窘Y(jié)果】耐藥菌株QL15在體外獨(dú)立及混合培養(yǎng)時(shí)，除在稀釋LB培養(yǎng)基（1/4、1/8和1/16）中的長勢較敏感菌株ATCC25922低外，在低碳源（0.1%和0.5%）、低氮源（0.01%和0.05%）、酸堿性（pH=5.0、pH=6.0和pH=8.0）及低溫（20 ℃）和高溫（42 ℃）脅迫下的生長均優(yōu)于敏感菌株ATCC25922，且混合培養(yǎng)結(jié)果優(yōu)于獨(dú)立培養(yǎng)。將耐藥菌株QL15基因組序列與敏感菌株ATCC25922基因組序列進(jìn)行比對，共檢測到509個(gè)InDel突變位點(diǎn)，其中Delete突變位點(diǎn)233個(gè)、Insert突變位點(diǎn)276個(gè);共注釋到71個(gè)功能基因，以細(xì)胞壁與細(xì)胞膜相關(guān)基因突變最多（10個(gè)），占14.1%。與敏感菌株ATCC25922相比，耐藥菌株QL15在不同環(huán)境脅迫下其外排泵與外膜孔道蛋白相關(guān)基因emrB、acrB、tolC和ompC呈下調(diào)表達(dá)，而ompF基因呈上調(diào)表達(dá)。【結(jié)論】多重耐藥大腸桿菌耐藥性的獲得促使其具有更強(qiáng)的適應(yīng)性，但對可直接利用營養(yǎng)物質(zhì)的獲取弱于敏感菌株，即處于競爭劣勢。耐藥大腸桿菌的多重耐藥性主要是由多種外排泵和外膜孔道蛋白介導(dǎo)完成，其中，ompF基因在pH脅迫、全營養(yǎng)脅迫和高、低溫脅迫下均處于上調(diào)表達(dá)狀態(tài)，故推測ompF基因的高表達(dá)有利于大腸桿菌在上述脅迫條件下生長。

關(guān)鍵詞： 多重耐藥大腸桿菌;豬源;環(huán)境脅迫因子;相對適應(yīng)性;耐藥性

中圖分類號： S852.612? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）04-0946-12

Effects of different environmental stress factors on the growth of pig-origin drug-resistant Escherichia coli

LIAO Shu-dan1，TAN Ai-juan2，SUN Hai-feng2，XIANG Run2，YANG Jian1，

ZHANG Yuan-xin3，SONG Xu-qin1*，LYU Shi-ming1*

（1College of Animal Science，Guizhou University， Guiyang， Guizhou? 550025， China; 2College of Life Sciences，Guizhou University， Guiyang， Guizhou? 550025， China; 3 Department of Agriculture and Rural Affairs of

Guizhou Province， Guiyang， Guizhou? 550005， China）

Abstract：【Objective】To investigate the effects of environmental stress factors on the survival adaptability of pig-origin multi-drug resistant Escherichia coli， so as to provide a theoretical basis for creating an environment where multi-drug resistant strains could present a high cost of adaptability and for accelerating the reduction of resistance level in the population. 【Method】Multi-drug resistant E. coli QL15 isolated from a large-scale pig farm in Guizhou Province was taken as the study object， and E. coli quality control （sensitive） strain ATCC25922 was taken as the control. The adapta-bility of drug-resistant strain QL15 and that of sensitive strain ATCC25922 under different environmental stress （medium concentration， carbon source， nitrogen source， pH and temperature） was determined by in vitro competition assay. The relationship between drug-resistant gene phenotype and gene expression of efflux pump and outer membrane pore protein with the cost of bacterial adaptation was analyzed by resequencing variant loci and fluorescence quantitative PCR. 【Result】Except that the growth of drug-resistant strain QL15 was lower in dilute LB medium （1/4， 1/8 and 1/16） compared with the sensitive strain ATCC25922， the growth of drug-resistant strain QL15 was better than that of sensitive strain ATCC25922 in in vitro independent and mixed cultures under low carbon sources （0.1% and 0.5%）， low nitrogen sources （0.01% and 0.05%）， acid-base property （pH=5.0， pH=6.0 and pH=8.0）， low and high temperature （20 ℃ and 42 ℃）. Besides， the results of mixed culture were better than that of the independent culture. The genome sequence of drug-resistant strain QL15 was compared with that of sensitive strain ATCC25922， and a total of 509 InDel mutation sites were detected， including 233 delete mutation sites and 276 insert mutation sites; a total of 71 functional genes were annotated， most of which were mutations related to cell wall and cell membrane（10）， accounting for 14.1%. Compared with the sensitive strain ATCC25922， in the drug-resistant strain QL15， genes related to efflux pump and outer membrane pore protein， namely emrB， acrB， tolC and ompC showed down-regulated expression， and ompF gene showed up-regulated expression under different environmental stress conditions. 【Conclusion】The acquisition of drug resistance of multi-drug-resistant E. coli makes it more adaptive， while its acquisition of directly available nutrients is weaker than that of sensitive strains， that is， E. coli is at a competitive disadvantage. The multi-drug resistance of drug-resistant E. coli is mainly mediated by a variety of efflux pumps and outer membrane pore proteins. Among them， the ompF gene shows up-regulated expression under pH stress， allotrophic stress， high and low temperature stress， so it is presumed that the high expression of ompF gene is beneficial to the growth of E. coli under the above stress conditions.

Key words：multi-drug-resistant Escherichia coli; pig-origin; environmental stress factors; relative adaptability;drug resistance

Foundation items： National Natural Science Foundation of China （31760749）;Guizhou Science and Technology Project （QKHPTRC〔2017〕5788，QKHJC-ZK〔2022〕yiban129）;Guizhou University Natural Science Special Items （Special Post） Scientific Research Fund Project （GDTGHZ〔2020〕25）

0 引言

【研究意義】細(xì)菌性疾病嚴(yán)重威脅著畜牧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展（劉菊枚等，2020;付霞麗等，2021），雖然抗菌藥物在動(dòng)物疾病防治、促進(jìn)動(dòng)物生長、保障動(dòng)物福利及提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益等方面發(fā)揮著重要作用（Bassetti et al.，2017;李瑋瑋等，2021），但因動(dòng)物養(yǎng)殖過程中不合理使用及濫用抗菌藥物造成的細(xì)菌耐藥性問題日益嚴(yán)重，不僅直接影響動(dòng)物性食品安全，還可通過食物鏈對人類健康構(gòu)成威脅，解決細(xì)菌耐藥問題已迫在眉睫（周瑤琴等，2018;劉昌孝，2019;劉躍華等，2019）。因此，在動(dòng)物養(yǎng)殖“減抗、禁抗”背景下（Ghosh et al.，2019;顧曉曉等，2020），開展不同環(huán)境條件下耐藥菌的生長適應(yīng)性及相關(guān)耐藥基因表達(dá)調(diào)控研究，對尋找無抗菌藥物壓力下加速細(xì)菌敏感性恢復(fù)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】減少抗菌藥物使用（減抗）是目前遏制細(xì)菌耐藥性發(fā)展的重要手段之一（袁萬哲等，2019），其主要理論依據(jù)是耐藥細(xì)菌在無藥環(huán)境中其適應(yīng)性代價(jià)高于敏感菌（Andersson and Levin，1999）。Gagneux等（2006）的研究結(jié)果顯示，耐利福平結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生了高額的適應(yīng)性代價(jià);Vogwill等（2015）經(jīng)Meta分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)藥物壓力細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生付出了較大代價(jià)，其中染色體突變付出的適應(yīng)代價(jià)通常高于質(zhì)粒的獲得，同時(shí)表現(xiàn)出耐藥菌株生長趨勢弱于敏感菌株;de Sousa等（2017）對克隆出的耐利福平和鏈霉素大腸桿菌與敏感菌進(jìn)行競爭試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在無藥物作用條件下克隆耐藥菌株競爭處于弱勢，但該現(xiàn)象可通過補(bǔ)償性進(jìn)化得以改變。因此，細(xì)菌在抗菌藥物的選擇壓力下產(chǎn)生耐藥性的相關(guān)變化，會(huì)改變細(xì)菌體內(nèi)生理生化關(guān)鍵酶等結(jié)構(gòu)，而對細(xì)菌的生長造成額外負(fù)擔(dān)，進(jìn)而影響細(xì)菌的部分功能，增加其適應(yīng)性代價(jià)（楊焰等，2019）。耐藥菌在停藥后的無藥環(huán)境中會(huì)因其適應(yīng)性代價(jià)高于敏感菌而處于競爭劣勢，逐漸被敏感菌群取代，從而降低種群的耐藥水平。此外，耐藥菌的適應(yīng)性代價(jià)受環(huán)境差異影響，各基因間存在復(fù)雜的協(xié)同與拮抗機(jī)制，同一細(xì)菌在不同環(huán)境中的適應(yīng)性代價(jià)也不同（方結(jié)紅，2018）。Petersen等（2009）研究表明，在環(huán)境脅迫下鏈霉素耐藥大腸桿菌適應(yīng)性代價(jià)顯著增加;商可心（2015）研究發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門氏菌rpsL突變介導(dǎo)的鏈霉素耐藥菌在營養(yǎng)豐富時(shí)的生長弱于敏感菌，但在碳源缺乏時(shí)耐藥菌因RpoS蛋白表達(dá)水平低，其生長優(yōu)于敏感菌;Maharjan和Ferenci（2017）研究表明，rpoB突變的利福平耐藥大腸桿菌在營養(yǎng)豐富時(shí)適應(yīng)性代價(jià)較高，而在營養(yǎng)缺乏時(shí)其適應(yīng)性更強(qiáng);孫海峰等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下多重耐藥大腸桿菌的生長優(yōu)于敏感菌，其機(jī)制可能與外膜孔道蛋白基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】研究耐藥菌的適應(yīng)性代價(jià)有助于認(rèn)識(shí)干預(yù)耐藥軌跡、新藥研發(fā)及聯(lián)合用藥，提高抗生素敏感性和抑制耐藥性進(jìn)化，延長抗生素使用年限。適應(yīng)性代價(jià)是細(xì)菌耐藥性進(jìn)化的重要環(huán)節(jié)，而在無抗菌藥物壓力下環(huán)境脅迫是細(xì)菌在自然環(huán)境中常遇的生存條件，但至今有關(guān)適應(yīng)性代價(jià)在不同環(huán)境中對耐藥菌的影響及其作用機(jī)制鮮見研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以分離自貴州省規(guī)?；i場的多重耐藥大腸桿菌QL15為研究對象，以大腸桿菌質(zhì)控（敏感）菌株ATCC25922為對照，經(jīng)體外競爭試驗(yàn)測定不同環(huán)境脅迫下耐藥菌株QL15相對于敏感菌株ATCC25922的適應(yīng)性，并檢測其攜帶的耐藥基因，分析耐藥基因表型及外排泵和外膜孔道蛋白基因表達(dá)與細(xì)菌適應(yīng)性代價(jià)的關(guān)系，旨在探究環(huán)境脅迫因子對多重耐藥菌株生存適應(yīng)性的影響，為創(chuàng)造多重耐藥菌株帶來高適應(yīng)代價(jià)的環(huán)境及加速降低種群耐藥水平提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

大腸桿菌耐藥菌株QL15由貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院獸醫(yī)藥理實(shí)驗(yàn)室保存提供，敏感菌株ATCC25922購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。LB肉湯培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基及平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基購自貴州為萊科技有限責(zé)任公司;瓊脂糖購自美國Sigma公司;細(xì)菌DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、PCR相關(guān)試劑及RT-PCR相關(guān)試劑購自北京索萊寶科技有限公司。

1. 2 培養(yǎng)基制備

碳源和氮源脅迫培養(yǎng)基制備：參照M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方（王希越等，2017）進(jìn)行制備，其中，碳源脅迫培養(yǎng)基為0.1%和0.5%葡萄糖，氮源脅迫培養(yǎng)基為0.01%和0.05%氯化銨，其他組份含量不變，高壓滅菌后使用。酸堿脅迫培養(yǎng)基制備：常規(guī)LB培養(yǎng)基pH為7.0，分別以1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)LB培養(yǎng)基pH至5.0、6.0、8.0和9.0，高壓滅菌后使用。全營養(yǎng)脅迫培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基與0.9%生理鹽水比例為1∶3、1∶7和1∶15，對應(yīng)的Luria-Bertani（LB）濃度分別為1/4、1/8和1/16，高壓滅菌后使用。溫度脅迫培養(yǎng)基：高溫和低溫脅迫條件選用LB培養(yǎng)基。

1. 3 不同環(huán)境脅迫下大腸桿菌生長曲線測定

采用比濁法測定敏感和耐藥大腸桿菌在不同環(huán)境因子脅迫下的生長曲線（姜興粲等，2020）。設(shè)活化敏感與耐藥大腸桿菌的OD600 nm=0.5，吸取50 μL菌液置于50 mL培養(yǎng)基中進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)。碳源脅迫、氮源脅迫、酸堿脅迫和全營養(yǎng)脅迫的培養(yǎng)溫度均為37 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min，溫度脅迫條件為42和20 ℃，每隔1 h測定其吸光值。

1. 4 不同環(huán)境脅迫下耐藥大腸桿菌相對適應(yīng)性測定

相對適應(yīng)性表現(xiàn)為不同環(huán)境脅迫下耐藥菌株和敏感菌株生存競爭能力的差異，主要通過體外混合培養(yǎng)競爭試驗(yàn)測定。參考本課題組前期改良的方法（孫海峰等，2021）：分別取10 μL的敏感菌株ATCC25922和耐藥菌株QL15（活化后調(diào)節(jié)麥?zhǔn)媳葷岫戎?.5），置于5 mL不同脅迫條件的培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min的條件下進(jìn)行培養(yǎng)（高溫脅迫培養(yǎng)溫度42 ℃，低溫脅迫培養(yǎng)溫度20 ℃）。取培養(yǎng)0和24 h的菌液，適當(dāng)稀釋后涂布在無藥培養(yǎng)基和有藥（含5 μg/mL恩諾沙星）培養(yǎng)基上。無藥培養(yǎng)基的菌落數(shù)為敏感菌落和耐藥菌落總數(shù)，有藥培養(yǎng)基則為耐藥菌落數(shù)，二者的差值即為敏感菌落數(shù)。混合培養(yǎng)0 h的敏感菌株和耐藥菌株數(shù)量記錄為S0和R0，培養(yǎng)24 h的分別記錄為R24和S24，根據(jù)以下公式計(jì)算相對適應(yīng)度（Relative fitness，F(xiàn)）：

F=ln（R24/R0）/ln（S24/S0）

1. 5 菌株外排泵與外膜孔道蛋白基因表達(dá)量測定

采用本課題組設(shè)計(jì)的引物（孫海峰等，2021），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。敏感菌株和耐藥菌株總RNA按照試劑盒操作說明進(jìn)行提取。菌株外排泵與外膜蛋白基因表達(dá)量測定：將耐藥菌株QL15和敏感菌株ATCC25922在37 ℃、150 r/min的條件下活化培養(yǎng)12 h，取50 μL菌液加入到50 mL不同環(huán)境脅迫培養(yǎng)基中，待細(xì)菌生長至對數(shù)生長期時(shí)，提取細(xì)菌總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定耐藥菌株和敏感菌株外排泵與外膜孔道蛋白基因在不同環(huán)境脅迫下的相對表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參照孫海峰等（2021）的方法。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同環(huán)境脅迫下大腸桿菌的生長曲線

2. 1. 1 碳源和氮源脅迫下大腸桿菌的生長曲線

如圖1所示，在不同濃度的碳源和氮源脅迫下，耐藥菌株QL15與敏感菌株ATCC25922相比其生長速率更快，能更快地進(jìn)入對數(shù)生長期且峰濃度均高于敏感菌株ATCC25922，表明碳源和氮源的濃度變化對耐藥菌株QL15生長速率影響較小，其獨(dú)立生長適應(yīng)性更強(qiáng)。隨著碳源濃度的升高，耐藥菌株QL15和敏感菌株ATCC25922的生長速率均降低，而氮源濃度的升高能促進(jìn)二者快速生長（圖2）。此外，由圖3可看出，培養(yǎng)10 h后不同碳源和氮源對敏感菌株ATCC25922的影響均達(dá)極顯著水平（P<0.01，下同），當(dāng)碳源為0.1%和氮源為0.01%時(shí)對耐藥菌株QL15的影響極顯著，當(dāng)?shù)礊?.05%時(shí)對耐藥菌株QL15的影響顯著（P<0.05，下同），但在碳源為0.5%時(shí)對耐藥菌株QL15生長無顯著影響（P>0.05，下同）。同時(shí)，碳源濃度為0.5%時(shí)耐藥菌株QL15的峰濃度是0.1%碳源濃度的2倍，繼續(xù)增加濃度至1.0%則對峰值影響不明顯，表明在一定范圍內(nèi)碳源對耐藥大腸桿菌種群的承載度影響明顯。

2. 1. 2 pH脅迫下大腸桿菌的生長曲線 不同pH對敏感菌株ATCC25922和耐藥菌株QL15生長的影響如圖4和圖5所示。與敏感菌株ATCC25922相比，耐藥菌株QL15在pH=5.0、pH=6.0和pH=8.0脅迫下均能較快地進(jìn)入對數(shù)生長期，且其峰值濃度差異不顯著;在pH=9.0時(shí)，耐藥菌株QL15進(jìn)入對數(shù)生長期的時(shí)間更快，但在對數(shù)生長期的生長速率慢于敏感菌株ATCC25922。pH=7.0是細(xì)菌生長的最適pH，pH的升高和降低均會(huì)抑制敏感菌株ATCC25922和耐藥菌株QL15的生長，尤其在pH=9.0脅迫下耐藥菌株QL15的生長受到明顯抑制。

2. 1. 3 全營養(yǎng)脅迫下大腸桿菌的生長曲線 不同LB濃度對敏感菌株ATCC25922和耐藥菌株QL15生長的影響如圖6和圖7所示。不同LB濃度脅迫下，敏感菌株ATCC25922和耐藥菌株QL15進(jìn)入對數(shù)生長期的時(shí)間及對數(shù)生長期的生長速率差異均不顯著，但敏感菌株ATCC25922在穩(wěn)定期的峰值濃度均顯著高于耐藥菌株QL15，表明敏感菌株在不同營養(yǎng)物質(zhì)濃度下處于優(yōu)勢生長。此外，隨著LB培養(yǎng)基稀釋倍數(shù)的增加，敏感菌株ATCC25922和耐藥菌株QL15對數(shù)生長期的生長速率和穩(wěn)定期的峰值濃度均明顯降低，表明LB濃度脅迫對細(xì)菌的生長具有明顯影響。

2. 1. 4 不同溫度脅迫下大腸桿菌的生長曲線 不同溫度脅迫對敏感菌株ATCC25922和耐藥菌株QL15生長的影響如圖8所示。當(dāng)溫度為20 ℃時(shí)，敏感菌株ATCC25922和耐藥菌株QL15的適應(yīng)期時(shí)間相近且二者在培養(yǎng)10 h內(nèi)均未到達(dá)穩(wěn)定期，但耐藥菌株QL15在對數(shù)生長期的生長速率更快，為優(yōu)勢菌株;當(dāng)培養(yǎng)溫度為42 ℃時(shí)，敏感菌株ATCC25922和耐藥菌株QL15的生長曲線差異不明顯，且到達(dá)穩(wěn)定期的峰值濃度相近，但耐藥菌株QL15在對數(shù)生長期的生長速率仍高于敏感菌株ATCC25922。比較敏感菌株ATCC25922和耐藥菌株QL15在不同溫度脅迫下的生長曲線，結(jié)果（圖9）發(fā)現(xiàn)37 ℃下大腸桿菌的生長速率最高，42和20 ℃對細(xì)菌生長均有一定的抑制作用，且以20 ℃的抑制作用最大。

2. 2 耐藥大腸桿菌在不同環(huán)境脅迫下的相對適應(yīng)性

耐藥菌株QL15的相對適應(yīng)性如表1所示。在LB、碳源、氮源、pH=6.0～8.0、20 ℃和42 ℃脅迫下，耐藥菌株QL15的相對適應(yīng)度均大于1.00，表明其與敏感菌株ATCC25922在上述環(huán)境脅迫下競爭優(yōu)勢明顯;耐藥菌株QL15在pH=9.0及所有LB培養(yǎng)基稀釋條件下則表現(xiàn)出競爭劣勢（相對適應(yīng)度<1.00），其中1/4 LB濃度脅迫下的相對適應(yīng)度最低，僅為0.95。

2. 3 耐藥大腸桿菌基因突變位點(diǎn)檢測結(jié)果

將耐藥菌株QL15和敏感菌株ATCC25922的基因組序列進(jìn)行比對，共檢測到509個(gè)InDel突變位點(diǎn)，其中Delete突變位點(diǎn)233個(gè)、Insert突變位點(diǎn)276個(gè);共注釋到71個(gè)功能基因，以細(xì)胞壁與細(xì)胞膜相關(guān)基因突變最多（10個(gè)），占14.1%，其次為氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝（9個(gè)）占12.7%。突變涉及多種蛋白，包括磷酸轉(zhuǎn)移酶、羧肽酶、細(xì)胞分裂蛋白、青霉素結(jié)合蛋白、ABC型外排系統(tǒng)、細(xì)胞壁水解酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶及外膜蛋白TolC等均檢測到InDel位點(diǎn)。

2. 4 不同環(huán)境脅迫因子對大腸桿菌外排泵與外膜孔道蛋白基因表達(dá)量的影響

2. 4. 1 碳源和氮源脅迫下大腸桿菌外排泵與外膜孔道蛋白基因的相對表達(dá)量 在碳源和氮源脅迫下，大腸桿菌外排泵與外膜孔道蛋白基因的相對表達(dá)情況如圖10所示。與常規(guī)的LB培養(yǎng)條件相比，敏感菌株ATCC25922和耐藥菌株QL15中的外排泵與外膜孔道蛋白基因（acrB、ompF、emrB、tolC和ompC）相對表達(dá)量均呈下調(diào)趨勢，且耐藥菌株QL15的5種基因在0.5% C、0.05% N、0.01% N和1.0% C+0.1% N條件下的相對表達(dá)量較0.1% C脅迫的下調(diào)程度更大，敏感菌株ATCC25922則表現(xiàn)為除0.1% C和1.0% C+0.10% N條件外，其他條件下均呈顯著下調(diào)。

2. 4. 2 pH脅迫下大腸桿菌外排泵與外膜孔道蛋白基因的相對表達(dá)量 敏感菌株ATCC25922和耐藥菌株QL15在pH=5.0～9.0的條件下其外排泵與外膜孔道蛋白基因的相對表達(dá)量如圖11所示。與pH=7.0相比，敏感菌株ATCC25922和耐藥菌株QL15的emrB、acrB、tolC和ompC基因相對表達(dá)呈下調(diào)趨勢，而ompF基因表達(dá)呈上調(diào)趨勢。其中，ompC基因隨環(huán)境pH的變化未表現(xiàn)出明顯的變化趨勢（除耐藥菌株QL15在pH=9.0條件下的相對表達(dá)量外）。

2. 4. 3 全營養(yǎng)脅迫下大腸桿菌外排泵與外膜孔道蛋白基因的相對表達(dá)量 敏感菌株ATCC25922和耐藥菌株QL15的外排泵與外膜孔道蛋白基因表達(dá)在不同LB濃度脅迫下表現(xiàn)出不同變化規(guī)律。隨著LB稀釋倍數(shù)的增加，敏感菌株ATCC25922的emrB基因表達(dá)呈上調(diào)趨勢，而耐藥菌株QL15的emrB基因表達(dá)呈下調(diào)趨勢。2種大腸桿菌ompF基因在不同LB稀釋倍數(shù)下均呈上調(diào)表達(dá)，且耐藥菌株QL15的ompF基因隨稀釋倍數(shù)的增加其相對表達(dá)量呈遞增趨勢。此外，敏感菌株ATCC25922和耐藥菌QL15的acrB、tolC、ompC基因相對表達(dá)量在不同LB濃度脅迫下均呈下調(diào)趨勢（圖12）。

2. 4. 4 高溫和低溫脅迫下大腸桿菌外排泵與外膜孔道蛋白基因的相對表達(dá)量 敏感菌株ATCC25922和耐藥菌株QL15的外排泵與外膜孔道蛋白基因在高溫和低溫脅迫下的相對表達(dá)量如圖13所示。敏感菌株ATCC25922和耐藥菌QL15的emrB、acrB、tolC和ompC基因在20 ℃下的相對表達(dá)量較37 ℃下呈下調(diào)趨勢，在42 ℃下這4種基因的相對表達(dá)量則是上調(diào)和下調(diào)趨勢并存。2種大腸桿菌的ompF基因在20和42 ℃下均呈上調(diào)表達(dá)，且在42 ℃下的相對表達(dá)量高于20 ℃。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年約有9.7萬t抗菌藥物用于畜牧業(yè)，接近抗菌藥物年產(chǎn)總量的50%。由于抗菌藥物的大量使用及濫用，細(xì)菌耐藥性已成為全球廣泛關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，意味著人類可能進(jìn)入后抗生素時(shí)代（李瑞珍等，2011;Houston，2011）。目前，全球都在為降低細(xì)菌耐藥性而努力，主要措施包括從源頭控制抗菌藥物使用、阻斷耐藥病原傳播及開發(fā)新型藥物或疫苗等。通過阻斷耐藥性傳播和開發(fā)新型藥物等方法以降低細(xì)菌的耐藥性，其技術(shù)要求較高、研發(fā)較難、周期較長，且細(xì)菌耐藥速度遠(yuǎn)大于新藥的產(chǎn)出速度，因此“減抗”被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為主要措施。適應(yīng)性代價(jià)是降低細(xì)菌耐藥性的重要隱含機(jī)制，耐藥菌株在無藥物作用條件下較敏感菌株競爭劣勢，二者相互競爭生長后敏感菌株會(huì)成為優(yōu)勢菌群，其群體敏感性得以恢復(fù)。但在無藥物作用的環(huán)境中，耐藥基因的敏感性恢復(fù)速度極慢，因此，尋找無藥條件下加速耐藥菌株敏感性恢復(fù)的方法對降低或減緩細(xì)菌耐藥性具有重要意義。

本課題組前期對耐藥菌株QL15的耐藥基因進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在15種耐藥基因（孫海峰等，2021），分別是aac（3）-IV、cmlA、ompC、ompF、acrA、tolC、emrB、emrD、tetA、blaTEM、acrB、sugE、mdtL、sul2和sul3。其中，與外排泵相關(guān)的基因有8種，外膜孔道蛋白基因有3種。AcrAB-TolC為RND外排家族，包括由融合蛋白（AcrA）、細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（AcrB）及外膜通道（TolC），是目前發(fā)現(xiàn)與大腸桿菌聯(lián)系最緊密的外排泵（Yasufuku et al.，2010），能外排氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、氯霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類等多種抗菌藥物（黃嬌和穆青，2019）。在自然環(huán)境中，AcrAB-TolC的正常表達(dá)有助于大腸桿菌抵抗腸道膽鹽和脂肪酸等物質(zhì)的侵入，但在某些條件下AcrAB-TolC過量表達(dá)可使大腸桿菌表現(xiàn)出對多種化合藥物的耐受，甚至呈高水平耐受（甘露等，2020）?？梢?，外排泵和外膜孔道蛋白對大腸桿菌耐藥性具有積極作用。

生長曲線（獨(dú)立生長）和相對適應(yīng)性（競爭生長）是測定細(xì)菌適應(yīng)性的主要方法（楊焰等，2019）。本研究中，耐藥菌株QL15在不同環(huán)境脅迫下獨(dú)立生長時(shí)，表現(xiàn)為在0.1% C、0.5% C、1.0% C+0.10% N、0.05% N、0.01% N、pH=5.0、pH=6.0、pH=8.0、20 ℃和42 ℃中的生長狀況均優(yōu)于敏感菌株ATCC25922，而在pH=9.0、1/4 LB、1/8 LB和1/16 LB中的生長狀況弱于敏感菌株ATCC25922。將2種大腸桿菌混合培養(yǎng)測定出的相對適應(yīng)性，表現(xiàn)為耐藥菌株QL15在0.1% C、0.5% C、1.0% C+0.10% N、0.05% N、0.01% N、pH=5.0、pH=6.0、pH=8.0、20 ℃和42 ℃中均處于競爭優(yōu)勢，而在pH=9.0、1/4 LB、1/8 LB和1/16 LB中處于劣勢生長。此外，本研究發(fā)現(xiàn)稀釋LB培養(yǎng)基不利耐藥菌株QL15生長，但隨著LB稀釋倍數(shù)的增加，其相對適應(yīng)性又逐漸增強(qiáng)，與林文芳等（2016）的研究結(jié)果相近，即貧營養(yǎng)和痕量抗生素對質(zhì)?？股乜剐赃m應(yīng)度代價(jià)有重要影響，較低的營養(yǎng)濃度和痕量抗生素均能增加耐藥菌株的適應(yīng)性代價(jià)。但某些耐藥菌株的基因突變在不同營養(yǎng)中對其生長影響可能不同，如耐利福平大腸桿菌的rpoB基因突變在營養(yǎng)豐富時(shí)能抑制其生長，而在營養(yǎng)豐富時(shí)（鐵元素、碳源和磷酸鹽）具有積極作用（Maharjan and Ferenci，2017）。本研究通過比對分析耐藥菌株QL15和敏感菌株ATCC25922的基因組序列，結(jié)果共檢測到509個(gè)InDel突變位點(diǎn)，且以細(xì)胞壁和細(xì)胞膜相關(guān)功能基因居多，占注釋到71個(gè)功能基因的14.1%。由此推測，耐藥菌株QL15在物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝方面得到突變增強(qiáng)的同時(shí)，膜相關(guān)功能基因的突變可能促使其擁有更強(qiáng)的膜功能，包括通透性和物質(zhì)運(yùn)輸能力等方面，致使耐藥菌株QL15在多數(shù)環(huán)境脅迫下較敏感菌株ATCC25922具有更強(qiáng)的適應(yīng)性。

腸道細(xì)菌的存活和生長取決于pH耐受性，pH可影響RND泵底物的積累和流出，細(xì)菌在酸性條件下的培養(yǎng)初期，acrA和acrB基因表達(dá)下調(diào)，培養(yǎng)18 h后檢測到基因表達(dá)顯著上調(diào)（Nové et al.，2020）。耐藥菌株QL15和敏感菌株ATCC25922在pH=5.0和pH=6.0脅迫下進(jìn)入對數(shù)生長期的培養(yǎng)時(shí)間遠(yuǎn)低于18 h，且二者的acrB基因相對表達(dá)量均呈下調(diào)趨勢，與Nové等（2020）的研究結(jié)果一致。此外，tolC和emrB基因的上調(diào)表達(dá)能促進(jìn)大腸桿菌在極端酸性條件下存活（Deininger et al.，2011），但本研究中tolC和emrB基因的相對表達(dá)量并未上調(diào)，可能是由于pH=5.0尚未達(dá)到極端酸性條件，大腸桿菌或通過其他機(jī)制應(yīng)對酸脅迫。溫度是病原體在感染初期經(jīng)歷的關(guān)鍵環(huán)境信號。有研究表明，升高培養(yǎng)溫度能增加RND泵的表達(dá)量，如熒光假單胞菌RND泵（Adebusuyi and Foght，2011）和鼠傷寒沙門氏菌AcrAB泵（Hartog et al.，2008）在35和37 ℃下的表達(dá)量均高于25和28 ℃。本研究中，acrB和tolC基因在20 ℃脅迫下呈下調(diào)表達(dá)趨勢也進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)論。

細(xì)菌能通過抗菌藥物的非特異性通道蛋白OmpC和OmpF進(jìn)行物質(zhì)交換，既能阻礙抗菌藥物進(jìn)入細(xì)胞，又能促進(jìn)營養(yǎng)吸收和有毒物質(zhì)的擴(kuò)散（Knopp and Andersson，2015）。如大腸桿菌在葡萄糖中的生長速度取決于其通過中央碳代謝途徑的有效運(yùn)輸及分解代謝，憑借外膜孔蛋白（OmpC、OmpF和LamB）將葡萄糖從細(xì)胞外環(huán)境運(yùn)輸至周質(zhì)空間（Ferenci，2001;Masi et al.，2019）。根據(jù)細(xì)胞生長的環(huán)境條件差異，糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的典型作用明顯不同。特定膜外蛋白（OMPs）在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用因培養(yǎng)液中可用葡萄糖含量（痕量或過量）而異（Alva et al.，2020）。本研究中，耐藥菌株QL15和敏感菌株ATCC25922的ompC基因在不同LB濃度（1/4 LB、1/8 LB和1/16 LB）脅迫下均呈下調(diào)表達(dá)，ompF基因則呈上調(diào)表達(dá)，說明在此條件下糖類營養(yǎng)物質(zhì)可能主要通過OmpF蛋白進(jìn)人細(xì)胞。但在不同碳源（0.1% C、0.5% C和1.0% C）脅迫下，2種大腸桿菌的ompC和ompF基因表達(dá)量均下調(diào)，可能是在此濃度脅迫下葡萄糖通過其他轉(zhuǎn)運(yùn)體系進(jìn)入細(xì)胞?？梢?，ompF基因?qū)?xì)菌抗逆生長具有一定的積極作用。本研究中，ompF基因在pH脅迫、全營養(yǎng)脅迫和高、低溫脅迫下均呈上調(diào)表達(dá)，故推測ompF基因的高表達(dá)有利于大腸桿菌在上述脅迫條件下生長。

4 結(jié)論

多重耐藥大腸桿菌耐藥性的獲得促使其具有更強(qiáng)的適應(yīng)性，但對可直接利用營養(yǎng)物質(zhì)的獲取弱于敏感菌株，即處于競爭劣勢。耐藥大腸桿菌的多重耐藥性主要是由多種外排泵和外膜孔道蛋白介導(dǎo)完成，其中，ompF基因在pH脅迫、全營養(yǎng)脅迫和高、低溫脅迫下均處于上調(diào)表達(dá)狀態(tài)，故推測ompF基因的高表達(dá)有利于大腸桿菌在上述脅迫條件下生長。

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收稿日期：2021-12-28

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31760749）;貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合平臺(tái)人才〔2017〕5788號，黔科合基礎(chǔ)-ZK〔2022〕一般129號）;貴州大學(xué)自然科學(xué)專項(xiàng)（特崗）科研基金項(xiàng)目（貴大特崗合字〔2020〕25號）

通信作者：宋旭琴（1991-），https：//orcid.org/0000-0002-8671-3161，博士，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)研究工作，E-mail：xqsong@gzu.edu.cn;呂世明（1963-），https：//orcid.org/0000-0001-5939-0574，博士，教授，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)研究工作，E-mail：lvlvsm@163.com

第一作者：廖書丹（1994-），https：//orcid.org/0000-0001-8419-1702，研究方向?yàn)楂F醫(yī)藥理毒理學(xué)，E-mail：871823310@qq.com