納米材料在食品安全多殘留免疫層析檢測(cè)中的應(yīng)用*

黃佳佳，張燕姬，曾寶鈿，劉穎誼，洪日韋婷，翟 培

(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520)

食品安全與國(guó)民經(jīng)濟(jì)和人民生活水平密切聯(lián)系，快速檢測(cè)技術(shù)在推進(jìn)我國(guó)食品安全整治過程中發(fā)揮著重要作用，而該領(lǐng)域也逐步朝著標(biāo)準(zhǔn)化方向發(fā)展[1]。20世紀(jì)80年代，免疫層析技術(shù)(Immunochromatographic Assay，ICA)以其簡(jiǎn)單、快速、靈敏等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用于食品安全、環(huán)境和醫(yī)療診斷領(lǐng)域[2]。免疫層析試紙條一般由樣品墊、結(jié)合墊、層析膜、吸水紙和PVC底板構(gòu)成(圖1)。其核心原理是基于抗原-抗體的特異性結(jié)合，將捕獲抗原或抗體固定在硝酸纖維素膜上，采用有色或發(fā)光納米顆粒標(biāo)記抗體作為信號(hào)標(biāo)記物，通過樣品溶液層析泳動(dòng)，即可在反應(yīng)區(qū)域?qū)崿F(xiàn)快速顯色，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的定性或定量分析[3]。在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，基于雙抗夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法的ICA現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于大分子蛋白質(zhì)和小分子有毒有害的檢測(cè)[4]。本文旨在歸納目前納米材料在食品安全多殘留ICA的應(yīng)用情況，并對(duì)ICA未來發(fā)展進(jìn)行展望。

圖1 免疫層析試紙條構(gòu)造和檢測(cè)原理Fig.1 Structure and principle of immunochromatographic test strip

1 納米材料在免疫層析技術(shù)中的應(yīng)用

膠體金(gold nanoparticles，GNPs)是免疫層析技術(shù)的傳統(tǒng)標(biāo)記物，具有制備簡(jiǎn)單、容易標(biāo)記、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，但是膠體金本身不具備發(fā)光特性，光學(xué)信號(hào)低，使得檢測(cè)靈敏度較低，從而限制了膠體金在低檢出限項(xiàng)目中的應(yīng)用[5]。為進(jìn)一步提高靈敏度，基于不同功能性納米顆粒標(biāo)記物的ICA被開發(fā)利用，主要可分為有色納米顆粒、發(fā)光納米顆粒、磁性納米顆粒和其他新型標(biāo)記材料[6]。

1.1 有色納米顆粒

有色納米顆粒包括金納米花(gold nanoflowers，AuNFs)、乳膠微球(latex microspheres，LMs)、碳納米顆粒(carbon nanoparticles，CNPs)和膠體硒納米顆粒(colloidal selenium nanoparticles，SNPs)等。金納米花具有多分支結(jié)構(gòu)和比表面積大的優(yōu)勢(shì)，與檢測(cè)對(duì)象結(jié)合親和力增強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度提高。金玉等[7]分別合成了球狀膠體金和金納米花作為標(biāo)記探針，檢測(cè)牛奶中的黃曲霉毒素M1，結(jié)果顯示金納米花作為標(biāo)記物的免疫層析試紙條檢測(cè)限為12.3 pg/mL，比傳統(tǒng)球型膠體金標(biāo)記物靈敏度提高了5倍左右。CNPs是一種無定形的黑色粉末，局部石墨化結(jié)構(gòu)，具有穩(wěn)定性高、易制備、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。Liu等[8]開發(fā)了CNPs作為標(biāo)記探針的試紙條，檢測(cè)肉類樣品中沙丁胺醇，檢測(cè)限低至10 μg/kg，且試紙條穩(wěn)定性高于膠體金(GNPs)標(biāo)記試紙條，制備成本更低。膠體硒納米顆粒SNPs是一種鐵銹色的納米微粒，具有很好的生物吸附性能，與蛋白標(biāo)記簡(jiǎn)單且不容易發(fā)生沉聚。Wang等[9]以SDS和PEG為穩(wěn)定劑，在常溫下成功制備了SNPs，開發(fā)了基于SNPs的試紙條檢測(cè)豬尿中的克倫特羅，檢測(cè)限為3 ng/mL，與市售的同類試紙條具有相同的靈敏度，但穩(wěn)定性更高，可在37 ℃下儲(chǔ)存60天。

1.2 發(fā)光納米顆粒

發(fā)光納米顆粒包括量子點(diǎn)(quantum dots，QDs)，熒光微球(fluorescent microspheres，F(xiàn)Ms)，時(shí)間分辨熒光微球(time-resolved fluorescent microspheres，TRFMs)，上轉(zhuǎn)換發(fā)光顆粒(UP-converting phosphor，UCP)等。量子點(diǎn)是一種光學(xué)穩(wěn)定性高，發(fā)射帶窄，吸收光譜寬的熒光半導(dǎo)體納米晶體，因其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，被認(rèn)為是應(yīng)用前景最廣的生物標(biāo)記材料。Liu等[10]利用量子點(diǎn)作為標(biāo)記探針研發(fā)了檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中啶蟲脒的免疫層析試紙條，定性檢測(cè)限為1 ng/mL，結(jié)合便攜式熒光測(cè)定儀檢測(cè)，其線性范圍為0.098～25 ng/mL，最高半抑制濃度(IC50)為1.12 ng/mL，樣品平均回收率為78.38%～126.97%，盲樣檢測(cè)結(jié)果與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果高度相關(guān)。Zhao等[11]開發(fā)了一種基于競(jìng)爭(zhēng)性上轉(zhuǎn)換熒光免疫層析檢測(cè)谷物和其它農(nóng)作物中的黃曲霉毒素B1污染水平，檢測(cè)限為0.1～5 ng/g，遠(yuǎn)低于目前我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中農(nóng)作物黃曲霉毒素B1最大殘留限量，可滿足現(xiàn)行檢測(cè)需求。

1.3 磁性納米顆粒

磁珠納米顆粒(magnetite nanoparticles，MNPs)常被用來從食物基質(zhì)中濃縮和分離目標(biāo)分析物。用這種方法制備樣品，可消除食品基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，提高檢測(cè)靈敏度。Li等[12]將磁性納米顆粒與抗體偶聯(lián)，制備免疫磁珠，用于富集分離出牛肉、牛奶和水樣中的大腸桿菌O157：H7并富集，結(jié)合熒光微球試紙條檢測(cè)，其靈敏度比非磁富集樣品方法提高了33倍。為進(jìn)一步提高檢測(cè)性能，Yan等[13]提出了一種基于磁納米顆粒標(biāo)記得雙探針信號(hào)放大策略，利用MNPs標(biāo)記小鼠單克隆抗體和MNPs標(biāo)記羊抗鼠抗體之間的高親和力，通過生成雙探針網(wǎng)絡(luò)復(fù)合物來獲得擴(kuò)增信號(hào)，該方法實(shí)現(xiàn)3-氨基-2-惡唑烷酮的高靈敏度檢測(cè)，檢出限為0.044 ng/mL。

1.4 其他新型標(biāo)記材料

1.4.1 納米酶顆粒

納米酶具有類酶特性，作為天然酶的直接替代品，提高了檢測(cè)方法靈敏度，在生物傳感器領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用潛力。Wei等[14]利用基于金Au@Pt納米酶的新型ICA對(duì)牛奶中鏈霉素進(jìn)行檢測(cè)，與傳統(tǒng)膠體金ICA相比，其靈敏度提高了80倍。Yang等[15]合成了催化效率高、穩(wěn)定性好的鉑銥納米材料(Pt-Ir NCs)，該研究比較了Pt-Ir NCs-ICA和底物AEC介導(dǎo)增強(qiáng)的 Pt-Ir NCs-ICA，結(jié)果顯示Pt-Ir NCs-ICA的檢測(cè)限為0.5 ng/mL，而ACE介導(dǎo)增強(qiáng)的Pt-Ir NCs-ICA檢測(cè)限達(dá)到0.05 ng/mL，靈敏度提升一個(gè)數(shù)量級(jí)。

1.4.2 雙重信號(hào)標(biāo)記材料

大部分多殘留ICA是基于幾種多色標(biāo)記載體，用于單獨(dú)抗體標(biāo)記，雖然該策略豐富了信號(hào)輸出，但檢測(cè)系統(tǒng)也變得更復(fù)雜，甚至多種標(biāo)記材料之間會(huì)產(chǎn)生諸多干擾。因此，開發(fā)靈敏、方便快捷的雙讀出策略將是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)[16-17]。Wang等[18]采用簡(jiǎn)單一步法制備魯米諾還原金納米顆粒(AuNPs)，分別以AuNPs比色信號(hào)和化學(xué)發(fā)光信號(hào)作為定性輸出。單探針雙讀出技術(shù)具有分析效率高、成本低、操作方便、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，在藥物安全、環(huán)境衛(wèi)生和臨床診斷等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

1.4.3 金屬有機(jī)框架

金屬有機(jī)框架(MOFs)憑借其高度生物親和力以及新穎的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在在分離、催化、傳感、生物醫(yī)藥等方面有著廣泛的應(yīng)用[19]。普魯士藍(lán)(PBNPs)是MOFs材料中的一種，這種基于MOFs材料的ICA分析在靈敏度和穩(wěn)定性方面發(fā)揮強(qiáng)大的優(yōu)越性，Zhao等[20]首次以PBNPs為標(biāo)記材料，應(yīng)用于克倫特羅的ICA分析。在最佳條件下，基于PBNPs的ICA測(cè)定克倫特羅線性范圍為0.5～5 ng/mL，檢測(cè)限為1.0 ng/mL，靈敏度比傳統(tǒng)的金納米粒子ICA提高了5倍。

2 多殘留ICA在食品安全中的應(yīng)用

食品及農(nóng)產(chǎn)品在生產(chǎn)、加工、包裝、運(yùn)輸、儲(chǔ)存過程中，有害化合物混合污染聯(lián)合效應(yīng)廣泛存在[21-22]，單個(gè)農(nóng)產(chǎn)品中同時(shí)檢出多種藥物殘留的現(xiàn)象較為普遍[23]。較多的研究只關(guān)注單一毒性效應(yīng)，忽視了混合污染帶來的危害風(fēng)險(xiǎn)。因此，開發(fā)多殘留免疫層析方法更適用食品安全現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。

2.1 食源性微生物

全球每年多達(dá)30%的人口患食源性疾病，其中食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因[24]。Zheng等[25]開發(fā)了一種基于硅量子點(diǎn)(QDs)的熒光ICA，用于同時(shí)鑒定食品中寒沙門氏菌和大腸桿菌O157：H7，在雙通道ICA條帶中，QDs提供優(yōu)越的熒光信號(hào)，且具有單分散性和良好穩(wěn)定性；而該方法對(duì)沙門氏菌和大腸桿菌的檢出限均能達(dá)到50 CFU/mL，與傳統(tǒng)方法(GNPs-ICA)相比，靈敏度提高了200倍(圖2)。Wang等[26]把等溫DNA擴(kuò)增技術(shù)與ICA聯(lián)合，將擴(kuò)增的沙門氏菌和大腸桿菌DNA分別與乳膠微球(LMs)進(jìn)行標(biāo)記，該方法對(duì)兩種細(xì)菌的檢測(cè)限達(dá)到100 CFU/mL。

圖2 量子點(diǎn)雙通道免疫層析[25]Fig.2 Dual channel of quantum dot immunochromatography assay

2.2 真菌毒素

農(nóng)產(chǎn)品在貯藏、運(yùn)輸和加工過程容易受真菌侵染。而由真菌代謝所產(chǎn)生的真菌毒素對(duì)食品及農(nóng)產(chǎn)品的污染降低產(chǎn)品質(zhì)量，引發(fā)了嚴(yán)峻的食品安全問題[27]。Liu等[28]建立了一種基于智能手機(jī)的定量雙檢測(cè)模式裝置(圖3)，集成了膠體金和時(shí)間分辨熒光微球免疫層析，用于檢測(cè)谷物中多種真菌毒素；兩種方法對(duì)黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、T-2毒素和伏馬毒素B1檢測(cè)限分別為0.59/0.24/0.32/0.9/0.27 μg/kg、0.42/0.10/0.05/0.75/0.04 μg/kg。雙檢測(cè)模式為真菌毒素高通量、高靈敏度的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供有力支撐。此外，Goryacheva等[29]為了在親水介質(zhì)和生物偶聯(lián)過程中保持量子點(diǎn)的高熒光量子產(chǎn)率，合成CdSe/CdS和CdSe/CdS/ZnS核殼異質(zhì)結(jié)構(gòu)，并用不同表面組成的二氧化硅涂層擴(kuò)展它們，使熒光量子產(chǎn)率在水介質(zhì)中保持高達(dá)70%；將表面含有環(huán)氧和羧基的硅烷化量子點(diǎn)與單克隆抗體進(jìn)行生物偶聯(lián)，開發(fā)多色熒光ICA，用于同時(shí)檢測(cè)玉米和小麥中的玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素。

圖3 真菌毒素多殘留免疫層析方法[28]Fig.3 The immunochromatographic assayfor multiple mycotoxin

2.3 獸藥及違禁藥

在畜牧業(yè)的發(fā)展過程中，獸藥的使用可提高禽畜產(chǎn)品質(zhì)量，然而也導(dǎo)致動(dòng)物源性食品的獸藥殘留。為此，Hendrickson[30]建立了一種快速、靈敏的GNPs-ICA，用于牛奶中環(huán)丙沙星和氯霉素的同時(shí)檢測(cè)。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單，對(duì)于兩種藥物的檢測(cè)限分別是20 pg/mL和0.5 ng/mL。Liu等[31]建立了磁性普魯士藍(lán)納米酶(MPBN)介導(dǎo)的雙讀數(shù)的多殘留ICA(圖4)，以顯色底物TMB催化氧化產(chǎn)生的催化信號(hào)和探針原始顏色的比色信號(hào)為基礎(chǔ)，這種雙信號(hào)輸出策略不僅提高了檢測(cè)精度，且方法重現(xiàn)性好，對(duì)萊克多巴胺和克倫特羅加樣回收率為84.01%～119.94%。

圖4 基于磁性普魯士藍(lán)納米酶的多殘留免疫層析方法Fig.4 Multiplex lateral flow immunoassay based on magnetic Prussian blue nanoenzyme

2.4 農(nóng) 藥

化學(xué)防治是農(nóng)作物保護(hù)的重要手段之一，但農(nóng)藥殘留帶來的危害不容忽視。Zou等[32]建立了一種基于上轉(zhuǎn)化納米顆粒(UCPs)的快速、靈敏的ICA方法，用于三種有機(jī)磷農(nóng)藥的多殘留檢測(cè)。優(yōu)化后的UCPs-ICA針對(duì)對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷和殺螟硫磷的IC50分別為3.44 ng/mL、3.98 ng/mL和12.49 ng/mL，檢測(cè)范圍為0.98～250 ng/mL，添加回收率為67%～120%，該方法可作為快速檢測(cè)食品中3種有機(jī)磷農(nóng)藥的替代篩選工具。Sheng等[33]制備了基于表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)的試紙條，同時(shí)檢測(cè)百菌清、吡蟲啉和氧氟芬三種農(nóng)藥，該方法通過測(cè)定紙條檢測(cè)線上SERS信號(hào)的強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量分析。

表1 免疫層析技術(shù)在食品各領(lǐng)域的應(yīng)用Table 1 Application of immunochromatographic assay in various field of food

續(xù)表1

3 結(jié) 語

食品安全關(guān)系人民健康和社會(huì)穩(wěn)定。免疫層析技術(shù)在食品安全現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控中發(fā)揮著不可替代的作用，為食品安全快速檢測(cè)提供了有效保障。

各種納米材料的應(yīng)用為ICA帶來新的活力，與傳統(tǒng)的膠體金免疫層析相比，其靈敏度和穩(wěn)定性等方面得到較大得提升。多殘留免疫層析可同時(shí)進(jìn)行多對(duì)象檢測(cè)，具有樣品用量少，檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)靈敏度高等方面優(yōu)點(diǎn)。在未來的研究當(dāng)中，高通量檢測(cè)可通過借助于精密的試劑分配技術(shù)，如噴墨印刷技術(shù)[39-40]實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，蠟印技術(shù)的興起為構(gòu)建多通道免疫層析提供了一種新的手段。然而高通量的ICA往往存在一定的交叉反應(yīng)。為解決這一問題，一方面可制備高特異性的抗體避免交叉影響，或開發(fā)具有廣譜性的抗體同時(shí)檢測(cè)多種有害分子，另一方面以新型識(shí)別分子(如適配體)來代替抗體[41]。此外，通過將智能手機(jī)的光學(xué)成像系統(tǒng)與免疫層析技術(shù)深度融合，可提高分析性能。智能成像的引入使檢測(cè)準(zhǔn)確性明顯提高，但是目前基于智能手機(jī)的免疫層析方法多數(shù)針對(duì)單一目標(biāo)物的分析，在高通量定量檢測(cè)方面仍有待提升。

綜上，免疫層析技術(shù)在多年發(fā)展中得到不斷完善，它是未來快速檢測(cè)方法中最具發(fā)展前景的工具，具有簡(jiǎn)單、便攜、易用、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，是食品安全快速檢測(cè)不可或缺的工具。