加工番茄系統(tǒng)抗性誘導(dǎo)促生菌的篩選鑒定及其促生防病效果

林 青，史應(yīng)武，王 娜，華蘭蘭，楊紅梅， 楚 敏，曾 軍，高 雁，霍向東

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實驗室，烏魯木齊 830091；2.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 烏魯木齊 830046；3.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830054)

0 引 言

【研究意義】加工番茄是新疆特色經(jīng)濟優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)[1-2]。不同程度改變了種植區(qū)生態(tài)環(huán)境，病蟲害發(fā)生頻繁，制約當(dāng)?shù)丶庸し逊N植業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]?！厩叭搜芯窟M展】早疫病、灰霉病在新疆加工番茄各種植區(qū)普遍發(fā)生，發(fā)病率可達100%，產(chǎn)量損失10%～30%[4]。除加強田間管理外，農(nóng)藥仍然是最廣泛的防治選擇[5]?；瘜W(xué)農(nóng)藥需在植物發(fā)病前、發(fā)病期多次施用[3]，不僅增加生產(chǎn)成本，對土壤中的有益微生物有影響[6]。有研究已明確了新疆加工番茄早疫病、灰霉病病原菌，并成功篩選到具有較好抑菌性能的拮抗菌，對早疫病有一定防效[7-9]。拮抗菌發(fā)揮防治功效依賴于穩(wěn)定長久的定殖，受植物品種、栽培模式、施用農(nóng)藥、田間生態(tài)環(huán)境等因素影響，防治效果不穩(wěn)定[10]。一些促生菌可介導(dǎo)植物發(fā)生誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(Induced Systemic Resistance，簡稱ISR)，對多種真菌、細菌、病毒病害，甚至對一些害蟲和線蟲產(chǎn)生抗性。與化學(xué)防治和拮抗菌功效相比，誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性通常具有無污染、廣譜性、系統(tǒng)性、非特異性的特點，且不會使病原微生物產(chǎn)生耐藥性[11]?！颈狙芯壳腥朦c】目前針對誘導(dǎo)新疆加工番茄產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的促生菌研究相對較少，篩選系統(tǒng)抗性誘導(dǎo)促生菌，并評價其對早疫病、灰霉病的誘抗效果。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用稀釋涂布法，分離番茄等作物的根部土壤細菌，利用發(fā)芽實驗初篩加工番茄促生菌，測量葉片中茉莉酸含量，復(fù)篩系統(tǒng)抗性誘導(dǎo)菌株，為新疆加工番茄病害的生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

樣品采集：2018年10月15日于新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團農(nóng)十二師104團2連蔬菜站(N43°41′15.3″E87°27′34.7″)，采集番茄、辣椒、豆角作物的根及根部土壤，一同放置于滅菌牛皮紙袋，共采集24份樣品，冷藏運回實驗室進行后續(xù)試驗。

PDA 培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8，115℃高壓滅菌20 min；營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉浸粉3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH(7.3±0.1)，121℃高壓滅菌15 min；營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉浸粉3 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH(7.3±0.1)，121℃高壓滅菌15 min。植物茉莉酸(JA)酶聯(lián)免疫分析 (ELISA)試劑盒：江蘇酶標生物科技有限公司；SK8255Ezup柱式細菌基因組 DNA 抽提試劑盒：生工生物工程(上海)股份有限公司。

早疫病病原菌茄鏈格孢菌Alternariasolani、灰霉病病原菌灰葡萄孢菌Botrytiscinerea由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)種子健康中心提供。加工番茄種子新番45號(新紅48號)由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 根區(qū)、根際土壤細菌的分離純化

土壤樣品制備：根區(qū)土為附著在作物根系上抖落下的土。根際土為抖落根系上附著的大量土后根表面仍粘附的少量土壤。按照段佳麗[12]的方法，收集并制備根區(qū)、根際土壤懸液。將上述土壤懸液用無菌生理鹽水梯度稀釋至10-4、10-5和10-6濃度，各取100 μL相應(yīng)濃度土壤稀釋溶液，分別涂布于PDA、NA培養(yǎng)基上，每個梯度3個重復(fù)。于28℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～7 d，及時挑取平板上新長出的單菌落進行純化、保藏備用。

1.2.2 加工番茄促生菌的篩選

將分離純化的菌株接種于50 mL NB培養(yǎng)基中，于37℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min條件下震蕩培養(yǎng)24 h。將菌液用生理鹽水稀釋至104倍數(shù)，菌液濃度為104cfu/mL，用于加工番茄種子浸種。

選取飽滿、均勻一致的加工番茄種子，參照趙偉進等[13]方法表面消毒。以無菌生理鹽水和稀釋至104倍數(shù)未接菌的NB培養(yǎng)基為空白對照，將種子分別浸泡于稀釋的菌液和對照中，37℃吸附4 h，在超凈工作臺風(fēng)干后，放置于鋪有用等量無菌水濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿10粒種子，每個處理重復(fù)3次，于28℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)，3 d后調(diào)查種子的發(fā)芽勢，測量根長，5 d后調(diào)查種子的發(fā)芽率，篩選具有顯著促生作用的菌株。

1.2.3 誘導(dǎo)加工番茄番系統(tǒng)抗性菌株的篩選

誘導(dǎo)接種：將表面消毒的加工番茄種子點播在裝有草炭∶蛭石=2∶1基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，待番茄幼苗長至3葉1心時，挑選長勢、株高一致的幼苗。將初篩的促生菌株分別接種于NB培養(yǎng)基中，在37℃，180 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h。將菌液于9 000 r/min下離心10 min，棄上清，將沉淀的菌體用清水重懸并調(diào)整至濃度為109cfu/mL，用于灌根處理。每缽加工番茄用15 mL重懸菌液灌根，再添加75 mL清水。每缽播種4粒種子，出苗后選取長勢一致的幼苗，每缽留2株，每個處理種10缽，重復(fù)3次。以清水處理為對照，期間保持每缽澆水量相同。

灌根后采集番茄葉片，每天采集6缽，每株采集1片，將葉片混合分成3份，連續(xù)5 d用植物茉莉酸(JA)酶聯(lián)免疫分析 (ELISA)試劑盒，按說明書操作，測量番茄葉片茉莉酸含量，篩選能顯著提高加工番茄茉莉酸含量的菌株。

1.2.4 誘導(dǎo)加工番茄番系統(tǒng)抗性菌株的分子生物學(xué)鑒定

通過16S rDNA序列進行菌株鑒定。采用 SK8255Ezup 柱式細菌基因組 DNA 抽提試劑盒提取菌株 DNA基因組，用通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R:CGGTTACCTTGTTACGACTTC擴增菌株的16S rDNA。PCR 反應(yīng)體系：2×Mix 25 μL、27F、1 492R (10 μmol/L) 各1 μL、菌株DNA模板1 μL，加ddH2O至總體積50 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃，5 min；94℃，30 s，54℃，30 s，72℃，90 s，30次循環(huán)；72℃，10 min。PCR 產(chǎn)物由北京鼎國昌盛生物科技有限公司純化和測序，測得序列經(jīng)NCBI BLAST比對分析。序列提交GenBank獲得登錄號。采用 MEGA5 以鄰接法(Neighbor Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，bootstrap值1 000。

1.2.5 誘導(dǎo)加工番茄番系統(tǒng)抗性菌株的防病效果驗證

對峙實驗：將病原菌茄鏈格孢菌Alternariasolani、灰葡萄孢菌Botrytiscinerea分別點接于PDA培養(yǎng)基平板中心，將誘導(dǎo)促生菌點接于病原菌四周，置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～7 d，觀察菌株的生長情況。

病原菌制備：將2株病原菌分別接種于裝有50 mL PDA培養(yǎng)基的錐形瓶中，每株菌接種10瓶，于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～14 d，待長出孢子，用無菌水在無菌條件下洗脫孢子，血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整其濃度為106cfu/mL的孢子懸浮液。

誘導(dǎo)接種：方法同1.2.3。

挑戰(zhàn)接種：誘導(dǎo)處理5 d后，分別將2種病原菌孢子懸浮液進行葉面噴施，接種后保濕48 h，培養(yǎng)室溫度28℃，濕度RH≥90%。挑戰(zhàn)接種第5 d和第14 d統(tǒng)計病情指數(shù)和誘抗效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用WPS2016進行數(shù)據(jù)整理和繪圖，IBM SPSS Statistics 20進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同作物根區(qū)與根際土壤分離細菌

研究表明，分離得到根際土壤細菌91株，根區(qū)土壤細菌56株，共計獲得 147株細菌。表1

表1 不同作物根際和根區(qū)土壤分離細菌數(shù)量Table 1 The number of bacteria isolated from rhizosphere and root zone soil of different crops

2.2 加工番茄促生菌的初步篩選

研究表明，加工番茄種子的發(fā)芽實驗可初步排除非致病菌和篩選促生菌。在147株根際、根區(qū)土壤細菌中，共篩選到19株可顯著促進加工番茄種子根長，并明顯改善發(fā)芽率和發(fā)芽勢的促生菌。其中有7株菌浸種處理的種子根長為清水對照(1.73 cm)的2倍以上，以FY138菌液浸種根最長，為4.37 cm，是清水對照的2.61倍，是NB培養(yǎng)基稀釋液對照的1.50倍。FY15、FY10、FY8浸種的種子發(fā)芽率是清水對照的2倍以上，是NB培養(yǎng)基稀釋液對照的1.47倍以上。FY10等6株菌浸種的種子發(fā)芽勢是清水對照的1.53倍以上，是NB培養(yǎng)基稀釋液對照的1.38倍以上。圖1

注：A:加工番茄種子根長；B：加工番茄種子發(fā)芽率；C：加工番茄種子發(fā)芽勢

2.3 加工番茄系統(tǒng)抗性誘導(dǎo)菌株的篩選結(jié)果

研究表明，加工番茄幼苗茉莉酸含量會隨基質(zhì)中水分含量的變化而略有波動，呈現(xiàn)出缺水時升高澆水后逐步降低的規(guī)律。而誘導(dǎo)菌作用于加工番茄幼苗，植株葉片茉莉酸含量顯著提高。FY93作用效果最快，幼苗茉莉酸含量在第2 d即開始上升，第3 d達到峰值，隨后下降。FY136作用效果最持久，幼苗茉莉酸含量從第3 d開始逐步上升。FY10、FY12則在第3 d使幼苗茉莉酸含量顯著提高，隨后下降。在檢測期內(nèi)，各菌株誘導(dǎo)加工番茄幼苗茉莉酸含量上升的峰值，均顯著(P<0.05)高于對照各時期。圖2

圖2 菌株誘導(dǎo)接種后加工番茄幼苗茉莉酸含量Fig.2 Jasmonic acid content of processing tomato seedlings after induction of strains

2.4 加工番茄系統(tǒng)抗性誘導(dǎo)菌株的分子生物學(xué)鑒定

研究表明，菌株FY10與BacillusatrophaeusJCM 9070相似性為99.93%，F(xiàn)Y12與PseudomonaswadenswilerensisCCOS 864相似性為100%，F(xiàn)Y93與BacilluspumilusATCC 7061相似性為99.93%，F(xiàn)Y136與BacilluslicheniformisATCC 14580相似性為99.78%，親緣關(guān)系最近。4株菌屬于芽孢桿菌屬和假單胞菌屬，經(jīng)分子生物學(xué)初步將菌株FY10鑒定為萎縮芽孢桿菌Bacillusatrophaeus，菌株FY12鑒定為Pseudomonaswadenswilerensis，菌株FY93鑒定為短小芽孢桿菌Bacilluspumilus，菌株FY136鑒定為地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis。圖3

圖3 基于16SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence

2.5 誘導(dǎo)菌株的防病效果

2.5.1 加工番茄系統(tǒng)抗性誘導(dǎo)菌株對病原菌的拮抗作用

研究表明，4株誘導(dǎo)菌中，F(xiàn)Y10、FY12對早疫病、灰霉病病原菌均產(chǎn)生不同程度的拮抗作用，而FY93、FY136則對2種病原菌無拮抗性。圖4

圖4 誘導(dǎo)菌株與茄鏈格孢菌Alternaria solani(A)灰葡萄孢菌Botrytis cinerea(B)的拮抗作用Fig.4 Antagonism of induced strains with Alternaria solani (A) and Botrytis cinerea(B)

2.5.2 加工番茄系統(tǒng)抗性誘導(dǎo)菌株的防病驗證效果

研究表明，除FY136外，篩選的誘導(dǎo)株菌均能顯著降低加工番茄早疫病、灰霉病的病情指數(shù)，在挑戰(zhàn)接種14 d分別有27.59%、29.63%以上的誘抗效果，最高達39.44%。而FY136只對灰霉病有顯著防效，對早疫病誘抗效果不佳。在發(fā)病早期即挑戰(zhàn)接種5 d，菌株的誘抗效果至少能達70.57%以上，最高達92.13%。表2

表2 誘導(dǎo)菌株對加工番茄早疫病、灰霉病的誘抗效果Table 2 Inducing effect of induced strains on early blight and gray mold of processing tomato

3 討 論

植物的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(ISR)有別于系統(tǒng)獲得抗性 (systemic acquired resistance, SAR)[14]，雖然二者都能使植物體在誘導(dǎo)部位以外的非誘導(dǎo)部位獲得廣譜抗病能力，但前者的作用特點是誘導(dǎo)因子對植物是非致病性的，對病原菌沒有直接的殺死或抑制作用，而是通過生物或非生物因子激活植物自身的物理或化學(xué)屏障，通過茉莉酸途徑產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[15]。篩選誘導(dǎo)菌株常注意兩點：一是檢測誘導(dǎo)菌的非致病性和與病原菌的拮抗性，二是接種時誘導(dǎo)菌和挑戰(zhàn)菌在空間上相對隔離，進一步避免菌株拮抗作用造成的抗病性[16]。研究篩選的4株細菌均能顯著提高加工番茄幼苗的茉莉酸含量，使植株產(chǎn)生誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性，對早疫病(除FY136)和灰霉病有顯著的誘抗效果。FY10和FY12還兼具對2種病原菌的拮抗性，其顯著的抗病效果也許是菌株誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)抗性和對病原菌拮抗的協(xié)同增效作用所致。實驗中雖使誘導(dǎo)菌株和挑戰(zhàn)菌株相對分離，研究表明，一些芽孢桿菌類的生防拮抗菌可產(chǎn)生醇類、酸類、烯烴類、酯類、醛類和酮類等揮發(fā)性氣體，能有效抑制真菌活性[17]。揮發(fā)性物質(zhì)可通過破壞細胞膜，使菌絲畸形生長，減少孢子囊數(shù)目抑制病原真菌生長[18]。GAO等[19]發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌 ZSY-1產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)4-氯-3-甲基苯酚對番茄疫病、灰霉病的病原菌有顯著的抗菌活性。

花東來等[20]從阿魏根際中篩選分離獲得具有ACC脫氨酶活性的PGPR菌株，其菌液對加工番茄種子萌發(fā)有促進作用。楊蓉等[9]篩選到2株番茄早疫病菌拮抗菌，拮抗菌發(fā)酵液處理的盆栽試驗相對防效達35%以上。Zhang等[21]分離到13株細菌，含有多種抗生素生物合成基因，且具固氮、溶磷、抑制病原菌的多種功能。將其中6株菌接種于番茄根部，能有效預(yù)防莖腐根腐病并促進番茄生長。

一些促生菌不僅可以促進植物生長，提高作物產(chǎn)量，還能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性以抵御生物和非生物脅迫[22]。Akhtar等[23]分離的促生菌能在干旱脅迫下提高小麥種子發(fā)芽屬性，與氧化硅納米粒子聯(lián)合應(yīng)用，通過調(diào)節(jié)植物的不同生理和代謝過程誘導(dǎo)小麥的耐旱性，提高干旱脅迫下小麥的生長和產(chǎn)量。商業(yè)化使用的促生菌BacillussubtilisMBI600[24]對番茄具有較強的定植、促生能力，對3種番茄土傳病害有較好的防控效果，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，接種MBI600增加了番茄水楊酸 (SA) 信號通路、茉莉酸/乙烯信號通路中防御相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)生了系統(tǒng)抗性的誘導(dǎo)。芽孢桿菌GBSC56的揮發(fā)物使番茄的植物生長促進基因、防御相關(guān)基因的表達量上升，并對南方根結(jié)線蟲有較高的殺滅活性[25]。Xing等[26]從BacillussimplexSneb545 的培養(yǎng)物中分離出6種誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性的化合物，能延緩Sneb545浸種處理的大豆根中大豆孢囊線蟲的發(fā)育，其中3種化合物在防御大豆孢囊線蟲時，誘導(dǎo)參與了水楊酸和茉莉酸途徑防御相關(guān)基因的表達。

4 結(jié) 論

篩選獲得3株誘導(dǎo)促生菌，能顯著增加加工番茄茉莉酸含量，產(chǎn)生誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性，對番茄早疫病、灰霉病有顯著防效，誘抗效果在27.59%～39.44%。3株誘導(dǎo)促生菌可顯著促進加工番茄種子萌發(fā)和增加根長，其中2株菌還能拮抗番茄早疫病、灰霉病病原菌。菌株FY10、FY12、FY93經(jīng)分子生物學(xué)分析鑒定為Bacillusatrophaeus，Pseudomonaswadenswilerensis和Bacilluspumilus。