廣西荔浦檳榔芋軟腐病病原鑒定

陳瀟航，黃偉華，顏梅新

（1廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心/農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007；2廣東省微生物信號與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642；3廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，廣西南寧 530003；4百色市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所／廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院百色分院，廣西百色 533000）

芋〔（L）.Schott〕又名芋頭，屬天南星科，多年生草本植物。芋具有較高營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，是世界各地廣為栽培的特色蔬菜和糧食作物。廣西是全國芋頭主要產(chǎn)區(qū)之一，其中有著悠久栽培歷史的荔浦芋，以其品質(zhì)優(yōu)及地域特色備受人們的喜愛，成為國家地理標(biāo)志保護(hù)農(nóng)產(chǎn)品。近幾年，由于特色作物的發(fā)展和人們對芋頭產(chǎn)品的青睞，芋頭種植面積大幅度提高。種植方式從零星種植轉(zhuǎn)變?yōu)檫B片規(guī)模種植，從而導(dǎo)致芋病蟲害嚴(yán)重發(fā)生。自2015 年，廣西荔浦多個(gè)檳榔芋種植田塊相繼出現(xiàn)一種細(xì)菌性病害。該病主要危害地下球莖，球莖染病，球莖組織變褐，向內(nèi)腐爛，球莖迅速軟化、腐敗，出現(xiàn)黏液并散發(fā)惡臭味，最終全株枯萎倒伏死亡，具“細(xì)菌性軟腐病”的明顯特征，嚴(yán)重影響芋頭產(chǎn)量和品質(zhì)。據(jù)我們調(diào)查該病一般發(fā)病率為30%～50%，嚴(yán)重的全田失收。另外，由于該病的危害使得芋作物不能連栽，從而導(dǎo)致土地不能充分利用，種植成本提高，影響產(chǎn)量及市場供需，目前該病已成為阻礙芋頭生產(chǎn)的重要制約因素，嚴(yán)重影響芋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。由于病因不明，病害防治困難，種植戶強(qiáng)烈要求相關(guān)部門對該病害進(jìn)行研究與控制。為明確廣西荔浦檳榔芋“細(xì)菌性軟腐病”的病原，本研究對該病原菌進(jìn)行了分離，并利用生理生化測定和分子生物學(xué)手段對該病原菌進(jìn)行鑒定，為該病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離和培養(yǎng)

從廣西荔浦檳榔芋栽培區(qū)采集患芋軟腐病的發(fā)病植株樣本，選取具有典型軟腐病癥狀的芋球莖發(fā)病組織，采用常規(guī)組織分離方法，將病組織依次按如下步驟進(jìn)行表面消毒：95%乙醇浸泡15 s，75%乙醇浸泡30 s，無菌水清洗3 次。鏡檢后，將觀察有噴菌現(xiàn)象的病組織浸出液，用無菌接種環(huán)接種于LB 培養(yǎng)基上，通過平板三區(qū)劃線法進(jìn)行菌株分離。平板置于28℃培養(yǎng)48 h，分別挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，保存于-80℃冰箱備用。

1.2 致病性測定

將檳榔芋球莖用水清洗干凈，用干凈的水果刀將芋球莖切成長4～7 cm，寬3～6 cm，厚度1cm 左右的切片，放置于直徑15 cm 的培養(yǎng)皿中。將過夜培養(yǎng)的分離物配成10CFU·mL懸浮液，吸取5～10 μL 細(xì)菌懸浮液，滴至芋切片表面，芋切片周圍放置濕水棉團(tuán)，蓋上皿蓋保濕，置于28℃培養(yǎng)16～24 h，記錄發(fā)病結(jié)果，設(shè)接種培養(yǎng)液為對照。對接種發(fā)病的芋球莖組織進(jìn)行病原再分離，觀察分離物是否與接種菌株一致。

1.3 細(xì)菌的形態(tài)和鞭毛觀察

用無菌水將細(xì)菌配制成懸浮液，醋酸鈾（pH4.5）負(fù)染1～2 s 后，電鏡（JEM1200EX）觀察并拍照。

1.4 生理生化測定

對能夠?qū)е掠笄蚯o產(chǎn)生軟腐病的分離物進(jìn)行生理生化特性的測定，主要包括：革蘭氏染色、接觸酶、氧化酶活性、厭氧生長、D-葡萄糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵、麥芽糖發(fā)酵、山梨醇發(fā)酵、木糖發(fā)酵、棉子糖發(fā)酵、淀粉水解、明膠液化、37℃生長、甘露醇發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、D-海藻糖發(fā)酵、L-鼠李糖發(fā)酵、纖維二糖發(fā)酵等，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 PCR 擴(kuò)增

將細(xì)菌分離物在LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h 后，采用細(xì)菌DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取細(xì)菌分離物全基因組DNA。以提取后的DNA 作為PCR 擴(kuò)增模板，應(yīng)用表1 所示引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系總體積均為25 μL，包括2×Tag PCR MasterMix 12.5 μL，DNA 1.0 μL，引物各1.0μL，雙蒸水10.5μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5 min；94℃30 s，退火55℃30 s，72℃1 min，30 個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送英駿生物技術(shù)進(jìn)行測序。

表1 本研究中所用引物及其序列

測序結(jié)果使用BioEdit 7.25 修剪低質(zhì)量序列，然后使用DNAMAN 將序列進(jìn)行拼接，最后使用Phylosuit 1.2.2進(jìn)行序列對齊并構(gòu)建進(jìn)化樹，在ITOL上對進(jìn)化樹進(jìn)行編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 危害癥狀

該病主要為害檳榔芋球莖，引起芋球莖組織變褐腐爛、變軟，植株發(fā)黃萎蔫枯萎，后期芋球莖內(nèi)部組織繼續(xù)軟化、腐敗，出現(xiàn)黏液并伴有惡臭味（圖1A），有些球莖內(nèi)部組織干燥發(fā)黑，形成空洞，最終全株枯萎死亡。

2.2 病原細(xì)菌分離和致病性測定

從廣西荔浦檳榔芋栽培區(qū)采集到的芋軟腐病發(fā)病植株，對100 塊病組織進(jìn)行病原菌分離，共分離純化出4 株菌株，其中一株菌株占比達(dá)到85%，將其命名為Pec1 。通過16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得大約為1.5 kb 的特異性片段，測序所獲得序列經(jīng)BLAST 分析，結(jié)果表明Pec1 與P.subsp.PC1（GenBank Accession No.CP001657.1）的相似度為99.34%。對芋球莖切片組織進(jìn)行回接菌株P(guān)ec1，同時(shí)設(shè)置空白培養(yǎng)液作對照。結(jié)果表明，接種24 h 后，接種菌株P(guān)ec1 的芋球莖組織出現(xiàn)水漬狀的腐爛癥狀（圖1C），對照芋球莖組織未出現(xiàn)此癥狀（圖1B）。重新分離發(fā)病的芋球莖組織上病原菌，結(jié)果分離物與接種菌Pec1 培養(yǎng)形態(tài)完全一致。將重新分離的病原菌再次用16S rDNA 通用引物進(jìn)行擴(kuò)增測序，測序結(jié)果進(jìn)行BLAST，結(jié)果與Pec1 的結(jié)果一致。可見菌株P(guān)ec1 是引起芋軟腐病的致病菌。

圖1 芋軟腐病癥狀及病原

2.3 菌體形態(tài)特征與生理生化特征

菌株P(guān)ec1 在NA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，菌落呈圓形或者近圓形，邊緣光滑；革蘭氏陽性，電鏡顯微下，菌體為短桿狀，無芽孢產(chǎn)生，具鞭毛（圖1E）。生理生化測試結(jié)果表明菌株可在37℃和厭氧條件下生長，接觸酶、氧化酶反應(yīng)為陽性；不能使山梨醇發(fā)酵、木糖發(fā)酵、麥芽糖發(fā)酵，淀粉水解反應(yīng)為陰性；可利用D-葡萄糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、蔗糖、D-海藻糖、L-鼠李糖、纖維素二糖，能使明膠液化。以上形態(tài)特征與生理生化特征與胡蘿卜果膠桿菌subsp.高度相似。

2.4 Pec1 菌株16S rDNA 序列測定分析結(jié)果

基于16S rDNA 的進(jìn)化樹顯示，Pec1 與subsp.親緣關(guān)系最近，聚在同一簇（圖2），但自舉支持率僅有69%。通過對icdA、mdh、mtld、proA 四個(gè)管家基因進(jìn)行多基因聯(lián)合建樹，得到圖3 所示進(jìn)化樹，由圖可知Pec1 與subsp.PC1 仍然聚集在同一簇，并且自舉支持率達(dá)到99%。

圖2 基于16S rDNA 序列進(jìn)化樹分析

圖3 基于四個(gè)管家基因的多基因序列進(jìn)化樹分析

3 結(jié)論與討論

自2015 年，廣西荔浦多個(gè)檳榔芋種植區(qū)相繼出現(xiàn)一種細(xì)菌性病害。該病主要為害地下球莖，球莖染病，球莖組織變褐，向內(nèi)腐爛，球莖迅速軟化、腐敗，出現(xiàn)黏液并散發(fā)惡臭味，最終全株枯萎倒伏死亡，該病嚴(yán)重影響芋頭產(chǎn)量和品質(zhì)。為明確病原分類地位，本研究對芋細(xì)菌性軟腐病病原菌進(jìn)行了分離，分離物在NA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，菌落呈圓形或者近圓形，邊緣光滑；革蘭氏陽性，電鏡顯微下，菌體為短桿狀，無芽孢產(chǎn)生，具鞭毛。經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證，分離物接種芋球莖組織引起的腐爛癥狀與田間芋球莖腐爛癥狀一致，重新分離發(fā)病的芋球莖組織上的病原菌，與原接種物培養(yǎng)形態(tài)完全一致，證明了該細(xì)菌是引起芋細(xì)菌性軟腐的致病菌。

經(jīng)生理生化測定，結(jié)果顯示該病原細(xì)菌可37℃和厭氧生長，可使接觸酶、氧化酶反應(yīng)為陽性，不能發(fā)酵山梨醇、木糖、麥芽糖，不能水解淀粉，能使明膠液化；可利用D-葡萄糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、蔗糖、D－海藻糖、L－鼠李糖、纖維素二糖。這些生理生化特性與胡蘿卜果膠桿菌subsp.高度相似。其16S rDNA 序列分析結(jié)果顯示該病原細(xì)菌與subsp.親緣關(guān)系最近，相似度為99.34%，且進(jìn)化樹顯示，它們聚在同一簇。并且icdA、mdh、mtld、proA 四個(gè)管家基因多基因聯(lián)合分析也證實(shí)Pec1 與subsp.同源性最高。這些信息進(jìn)一步證明了subsp.為芋細(xì)菌性軟腐病的病原菌。本研究結(jié)果與福鼎市的檳榔芋軟腐病的病原鑒定結(jié)果一致。

據(jù)報(bào)道，subsp.（Jones）Bersey et al.稱為胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐致病型病原，也可引起檳榔芋軟腐病菌。而本研究分離獲得的芋（檳榔芋）軟腐病病原P.subsp.接種多子芋，也可引起腐爛癥狀，這證實(shí)該病原細(xì)菌對芋類作物造成潛在威脅。

由于在細(xì)菌分類上是一個(gè)大屬，本研究獲得的subsp.與原先報(bào)道的檳榔芋軟腐病病原subsp.（Jones）Bersey et al.是否為同一種細(xì)菌還需要進(jìn)一步甄別。

本文通過形態(tài)特征觀察、生理生化測定和16S rDNA 以及4 個(gè)看家基因進(jìn)行多位點(diǎn)序列分析，鑒定出一株引起芋細(xì)菌性軟腐病的病原菌subsp.菌株P(guān)ec1。研究結(jié)果旨在為芋軟腐病病原的致病機(jī)理研究提供材料以及該病害防治提供理論依據(jù)。