丹參酮ⅡA對鼠環(huán)孢素性牙齦增生及Bcl-2陽性表達(dá)影響的研究

張馨予 馬肅 豐靖馨 周慧玲 劉培紅 李延武

[摘要]目的：觀察丹參酮ⅡA對大鼠環(huán)孢素A（CyclosporinA，CsA）性牙齦增生上皮內(nèi)Bcl-2表達(dá)的影響。方法：30只7周齡雄性Wistar大鼠隨機(jī)等分為3組（對照組、CsA組、CsA+TanⅡA組），每組再隨機(jī)等分為2個亞組（10 d組和20 d組）。實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束時取材并制作切片，選擇相同部位分別行HE染色及免疫組化PV兩步法，于顯微鏡下觀察并測量各組大鼠頰側(cè)牙齦上皮面積和最長釘突長度，計數(shù)最長釘突內(nèi)Bcl-2蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)，行完全隨機(jī)分組兩因素析因設(shè)計的方差分析。結(jié)果：頰側(cè)牙齦上皮面積、最長釘突長度、抗凋亡蛋白Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)，CsA組顯著大于對照組和CsA+TanⅡA組（P<0.05）;而CsA+TanⅡA組和對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：在本試驗(yàn)周期內(nèi)，TanⅡA能有效地預(yù)防CsA引起的大鼠牙齦上皮增厚，Tan ⅡA抑制大鼠CsA性牙齦增厚上皮內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)可能是其機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]環(huán)孢素A;藥物性牙齦增生;丹參酮ⅡA;上皮;Bcl-2

[中圖分類號]R781.4? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2022）06-0084-04

Study on Influence of Tan ⅡA on Murine Cyclosporine Gingival Hyperplasia and Positive Expression of Bcl-2

ZHANG Xinyu1，MA Su1，2，F(xiàn)ENG Jingxin1，ZHOU Huiling1，LIU Peihong1，2，LI Yanwu1

（1.Department of Periodontology;2.Longjiang Scholars Laboratory，the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150001，Heilongjiang，China）

Abstract： Objective This paper is to observe the effect of Tanshinone ⅡA （TanshinoneⅡA， TanⅡA） on the expression of Bcl-2 in the epithelium Cyclosporin A （CyclosporinA， CsA）-induced gingival overgrowth of rats. Methods Thirty 7-week-old male Wistar rats were randomly divided into 3 groups （control， CsA， CsA+TanⅡA）， and each group was randomly divided into 2 subgroups （10 days， 20 days）. At the end of the experimental cycle， samples were taken and sectioned， and the same parts were selected for HE staining and immunohistochemical PV. The area of buccal gingival epithelium and the length of the longest nail process of rats in each group were observed and measured under the microscope， the imaging analysis system was used to take pictures and measure the buccal gingival epithelial area and the longest spike length of each group of rats， count the number of Bcl-2 protein positive cells in the longest spike， and analyze two-way analysis of varianca of factorial design. Results The area of buccal gingival epithelium， the length of the longest nail process and the number of anti apoptotic protein Bcl-2 positive cells in CsA group were significantly higher than those in control group and CsA + Tan ⅡA group （P<0.05）， there was no significant difference between CSA + Tan ⅡA? group and the control group （P>0.05）. Conclusion? Within this test period， Tan ⅡA can effectively prevent CsA-induced gingival epithelial overgrowth in rats. Tan ⅡA inhibits the expression of intraepithelial anti-apoptotic protein Bcl-2 in CsA-induced gingival overgrowth in rats may be one of its mechanisms.

Key words： cyclosporine A; drug-induced gingival overgrowth; tan ⅡA; epithelium; Bcl-2

環(huán)孢素A（CsA）屬于強(qiáng)效免疫抑制劑，其臨床應(yīng)用廣泛，但其使用過程中會產(chǎn)生一種常見的副作用，即環(huán)孢素性牙齦增生（Cyclosporin A-induced gingival overgrowth，CsA-GO）[1]。牙齦上皮增厚是CsA-GO的主要病理特征之一，其發(fā)病機(jī)制可能與抗凋亡蛋白Bcl-2陽性表達(dá)明顯增加有關(guān)[2]。在本課題組開展的丹參酮ⅡA（Tanshinone ⅡA，TanⅡA）對大鼠環(huán)孢素性牙齦增生干預(yù)治療研究中發(fā)現(xiàn)，TanⅡA可有效緩解大鼠牙齦上皮的增生[3]。本實(shí)驗(yàn)以Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，定量分析TanⅡA對CsA-GO大鼠牙齦上皮層的影響及TanⅡA對CsA-GO大鼠牙齦上皮內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)的影響，探討TanⅡA緩解CsA所致的大鼠牙齦上皮組織部位特異性增厚的發(fā)病機(jī)制。

1? 材料和方法

1.1 藥物和儀器：CsA（瑞士諾華制藥）;丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液（上海第一生化藥業(yè)有限公司）;兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體（武漢博士德有限公司）;PV兩步法免疫組織化學(xué)檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德有限公司）;Nikon ECLIPSE 80i顯微鏡、尼康NIS-ELements BR 3.0成像分析系統(tǒng)（日本尼康，哈醫(yī)大一院龍江學(xué)者實(shí)驗(yàn)室）。

1.2 動物選擇及分組：7周齡健康雄性Wistar大鼠30只（哈醫(yī)大一院動物實(shí)驗(yàn)中心提供），隨機(jī)等分為對照組、CsA組、CsA+TanⅡA組（每組各10只），每組又隨機(jī)等分為10 d、20 d兩組（每組各5只）。

1.3 建模：①CsA-GO動物模型：大鼠每日胃飼濃度為5 mg/ml的CsA鮮牛奶混濁液，CsA攝入量為30 mg/（kg·d），同時腹腔注射8 mg/（kg·d）的生理鹽水;②CsA+TanⅡA動物模型：大鼠每日胃飼等量等濃度的CsA鮮牛奶混濁液，同時腹腔注射8 mg/（kg·d）的TanⅡA注射液;③對照組動物模型：大鼠每日胃飼不含CsA的等量鮮牛奶并腹腔注射等量等濃度生理鹽水。所有大鼠都被安置在類似的條件下，每日稱重并根據(jù)體重調(diào)整CsA和TanⅡA劑量。本研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號：2020095。

1.4 取材、組織病理學(xué)檢測：在實(shí)驗(yàn)周期（10 d、20 d）結(jié)束后，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計處死各組大鼠。使用10%水合氯醛行大鼠腹腔注射麻醉，全麻下解剖暴露心臟，0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注內(nèi)固定。解剖獲得大鼠牙體-牙周復(fù)合組織標(biāo)本，4%多聚甲醛外固定24 h、4℃靜止脫鈣3個月，組織標(biāo)本脫水、透明、浸蠟，然后以下頜第一磨牙近中面為包埋面常規(guī)石蠟包埋，頰舌向連續(xù)切片，片厚4 μm。選擇下頜第一磨牙近遠(yuǎn)中面中點(diǎn)處切片4張，2張進(jìn)行HE染色，2張行Bcl-2 PV兩步法免疫組織化學(xué)染色，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

光鏡下觀察各組牙齦組織形態(tài)，利用尼康NIS-Elements BR 3.0成像分析系統(tǒng)攝片，在100倍視野下采用手動測量選項(xiàng)分別測定頰側(cè)上皮面積和最長釘突長度，具體測定方法如圖1～2。

光鏡下選取每張Bcl-2蛋白陽性切片中最長上皮釘突，并計算其內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)（表達(dá)呈棕褐色顆粒，定位于細(xì)胞胞漿內(nèi)）。以上測量均由同1人完成，每個標(biāo)本測2張切片，每張切片測3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 26.0統(tǒng)計分析軟件包對各組數(shù)值進(jìn)行兩因素析因設(shè)計方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學(xué)觀察：與對照組相比，CsA組牙齦發(fā)生部位特異性的增厚，牙齦上皮的增厚均主要集中在附著齦，牙齦上皮棘層細(xì)胞層數(shù)和數(shù)量明顯增加，上皮釘突數(shù)量增多、伸長增粗;與CsA組相比，CsA+TanⅡA組牙齦部位特異性的增厚均減輕，上皮棘層細(xì)胞層數(shù)和數(shù)量明顯減少，上皮釘突數(shù)量減少、伸長減輕。見圖3。

2.2 Bcl-2蛋白表達(dá)細(xì)胞觀察：與對照組相比，CsA組Bcl-2陽性表達(dá)的細(xì)胞層厚度和細(xì)胞數(shù)量增加，陽性表達(dá)范圍和表達(dá)密度增加主要集中于附著齦，上皮釘突處密集表達(dá);與CsA組相比，CsA+TanⅡA組Bcl-2陽性表達(dá)強(qiáng)度弱，其與對照組Bcl-2蛋白的免疫反應(yīng)性相似。見圖4。

2.3 各因素析因設(shè)計方差分析結(jié)果：同一時間點(diǎn)內(nèi)，不同處理方式的（CsA和TanⅡA）大鼠牙齦上皮面積、最長釘突長度和Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)也不同，CsA組顯著大于對照組和CsA+TanⅡA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），而CsA+TanⅡA組和對照組兩組間相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;同一處理方式下，不同時間點(diǎn)內(nèi)（10 d和20 d）大鼠牙齦上皮面積、最長釘突長度均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而CsA組Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖5～7，表1～2。

3? 討論

CsA-GO會危害口腔衛(wèi)生和美觀，也會影響到患者言語及咀嚼功能，嚴(yán)重時還會影響患者的心理健康。傳統(tǒng)治療CsA-GO的方法為尋找其他藥物替代或停藥，現(xiàn)代觀點(diǎn)認(rèn)為最主要的是牙周基礎(chǔ)治療，對于一些牙齦有明顯炎癥的患者可結(jié)合局部藥物治療（短療程阿奇霉素、短療程甲硝唑）;增生達(dá)到一定程度，牙齦外形不理想時需手術(shù)治療介入。但上述治療方法均有其不足之處[4]，所以本課題組考慮研究CsA-GO的微觀病理變化，尋找CsA-GO新的預(yù)防治療途徑。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在CsA給藥后10 d，與相同時間點(diǎn)的對照組大鼠正常牙齦相比，CsA處理的大鼠頰側(cè)牙齦上皮面積及最長釘突長度表現(xiàn)出顯著的增加;在CsA給藥后20 d，這種增加更為明顯，而30 d至40 d增生程度逐漸減弱。根據(jù)動物實(shí)驗(yàn)中“3R”的原則，減少不必要的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所以本實(shí)驗(yàn)周期選用了牙齦增生最明顯的10 d和20 d進(jìn)行研究。

CsA-GO結(jié)締組織的纖維性增生與瘢痕組織和實(shí)質(zhì)器官纖維化的組織病理學(xué)特點(diǎn)相似[5]，所以本課題組選用抗纖維化的藥物丹參酮試驗(yàn)性干預(yù)治療CsA-GO。在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)TanⅡA不但通過減少膠原沉積緩解了結(jié)締組織增生[3]，且可以緩解CsA所致的大鼠牙齦上皮部位特異性的增厚。CsA-GO上皮增厚的確切發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但目前的總體觀點(diǎn)認(rèn)為是增殖與凋亡之間失平衡。本課題組前期長期實(shí)驗(yàn)研究主要集中在凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化方面，CsA使大鼠口腔齦上皮內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)上調(diào)，推測線粒體凋亡途徑受到干擾，細(xì)胞凋亡受到抑制可能是CsA使大鼠口腔齦上皮增厚的發(fā)生機(jī)制之一[2]。

丹參酮ⅡA具有天然的抗癌活性[6]。TanⅡA可通過細(xì)胞凋亡途徑抑制多種癌細(xì)胞系生長，包括人鼻咽癌[7]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[8]、食管癌[9]、惡性星形細(xì)胞瘤[10]、宮頸癌[11]和白血病[12]等。體外和體內(nèi)模型表明TanⅡA可能是通過干擾線粒體途徑，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[13-16]。

HE染色分析表明，在本實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，CsA處理可引起大鼠頰側(cè)牙齦上皮組織面積及最長釘突增大，CsA對牙齦上皮的影響有部位特異性，上皮增厚主要位于頰側(cè)附著齦;TanⅡA可有效預(yù)防CsA誘導(dǎo)的大鼠牙齦上皮面積增厚。筆者的數(shù)據(jù)表明，TanⅡA可以在預(yù)防大鼠中CsA牙齦過度生長方面發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與對照組相比，CsA顯著上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2在牙齦上皮中的表達(dá)，與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致;而與CsA組相比，CsA+TanⅡA組大鼠頰側(cè)牙齦上皮最長釘突內(nèi)Bcl-2蛋白陽性細(xì)胞數(shù)下降。

細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑，也稱為線粒體損傷途徑，起源于細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激[17]。在發(fā)現(xiàn)Bcl-2（及其相關(guān)家族成員）后的幾十年里，大量的研究揭示了Bcl-2蛋白質(zhì)家族對內(nèi)在凋亡途徑的正確調(diào)控對于所有多細(xì)胞生物的正常發(fā)育和生理是必不可少的，Bcl-2蛋白的平衡被視為細(xì)胞凋亡的觸發(fā)因素[18]。抗凋亡蛋白Bcl-2抑制上皮細(xì)胞分化和凋亡，在基底細(xì)胞層上的過度表達(dá)，與增生上皮角化層角化有關(guān)，抗凋亡蛋白Bcl-2過表達(dá)可能通過抑制晚期分化，牙齦上皮細(xì)胞凋亡受抑制，導(dǎo)致牙齦增生[19]。TanⅡA下調(diào)大鼠CsA-GO上皮內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，這可能是TanⅡA預(yù)防CsA-GO上皮增厚的機(jī)制之一，這與TanⅡA對各種腫瘤的研究中觀察到的發(fā)現(xiàn)一致。

CsA-GO發(fā)病機(jī)制是多因素的[20]，一個被認(rèn)為在病變的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用的因素是菌斑積聚和預(yù)先存在的牙周炎癥狀態(tài)。而許多研究報告表明，TanⅡA能抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[21]。TanⅡA對CsA-GO有抑制作用，其抑制機(jī)制可能是多方面的。TanⅡA是否通過線粒體凋亡途徑促進(jìn)大鼠CsA-GO牙齦上皮細(xì)胞凋亡活動，從而恢復(fù)牙齦生理形態(tài)有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)討論，以闡明丹參酮上皮抑制機(jī)制，為其在CsA-GO臨床預(yù)防治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Chatzopoulos G S，Koidou V P，Wolff L F.Systematic review of cyclosporin a-induced gingival overgrowth and genetic predisposition[J].Quintessence Int，2017，48（9）：711-724.

[2]Ma S，Liu P，Li Y，et al.Cyclosporine a inhibits apoptosis of rat gingival epithelium[J].J Periodontol，2014，85（8）：1126-1134.

[3]Ma S，Liu W，Liu P，et al.Tanshinone ⅡA treatment alleviated the rat gingival connective tissue overgrowth induced by cyclosporine A[J].Periodontal Res，2016，51（5）：567-576.

[4]Candotto V，Baj A，Beltramini G，et al.Drug-induced gingival overgrowth： an in vitro study on cyclosporine and human gingival fibroblasts[J].Biol Regul Homeost Agents，2019，33（6 Suppl.1）：21-28.

[5]馬肅，劉培紅，李延武，等.環(huán)孢菌素對大鼠牙齦結(jié)締組織膠原及TIMP-1蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2011，20（9）：1398-1400.

[6]Guo R，Li L，Su J，et al.Pharmacological activity and mechanism of tanshinone

ⅡA in related diseases[J].Drug Des Devel Ther，2020，14：4735-4748.

[7]Liu B，Liu L，Zang A，et al.Tanshinone ⅡA inhibits proliferation and induces apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cells via p53-cyclin B1/CDC2[J].Oncol Lett，2019，18（3）：3317-3322.

[8]Qiu Y，Li C，Wang Q，et al.Tanshinone ⅡA induces cell death via Beclin-1-dependent autophagy in oral squamous cell carcinoma SCC-9 cell line[J].Cancer Med，2018，7（2）：397-407.

[9]Liao X，Gao Y，Liu J，et al.Combination of tanshinone ⅡA and cisplatin inhibits esophageal cancer by downregulating NF-κB/COX-2/VEGF pathway[J].Front Oncol，2020，10：1756.

[10]Dong W，Zhang Y，Chen X，et al.High-dose tanshinone iia suppresses migration and proliferation while promoting apoptosis of astrocytoma cells via notch-1 pathway[J].Neurochem Res，2018，43（9）：1855-1861.

[11]Liu Z，Zhu W，Kong X，et al.Tanshinone ⅡA inhibits glucose metabolism leading to apoptosis in cervical cancer[J].Oncol Rep，2019，42（5）：1893-1903.

[12]Zhang Y，Geng Y，He J，et al.Tanshinone ⅡA induces apoptosis and autophagy in acute monocytic leukemia via downregulation of PI3K/Akt pathway[J].Am J Transl Res，2019，11（5）：2995-3006.

[13]Huang ST，Huang CC，Huang WL，et al.Tanshinone ⅡA induces intrinsic apoptosis in osteosarcoma cells both in vivo and in vitro associated with mitochondrial dysfunction[J].Sci Rep，2017，7：40382.

[14]Zhang X，Zhou Y，Gu Y E.Tanshinone ⅡA induces apoptosis of ovarian cancer cells in vitro and in vivo through attenuation of PI3K/AKT/JNK signaling pathways[J].Oncol Lett，2019，17（2）：1896-1902.

[15]Zhou J，Jiang Y Y，Wang X X，et al.Tanshinone ⅡA suppresses ovarian cancer growth through inhibiting malignant properties and angiogenesis[J].Ann Transl Med，2020，8（20）：1295.

[16]Liao X Z，Gao Y，Huang S，et al.Tanshinone ⅡA combined with cisplatin synergistically inhibits non-small-cell lung cancer in vitro and in vivo via down-regulating the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signalling pathway[J].Phytother Res，2019，33（9）：2298-2309.

[17]Campbell K J，Tait S W G.Targeting BCL-2 regulated apoptosis in cancer[J].Open Biol，2018，8（5）：180002.

[18]Cavalcante G C，Schaan A P，Cabral G F，et al.A cell's fate： an overview of the molecular biology and genetics of apoptosis[J].Int J Mol Sci，2019，20（17）：4133.

[19]楊儒壯，張瑜，齊羲明.鈣通道阻滯劑對牙齦組織細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)研究進(jìn)展[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2020，29（12）：190-193.

[20]Ponnaiyan D，Jegadeesan V.Cyclosporine a： novel concepts in its role in drug-induced gingival overgrowth[J].Dent Res J （Isfahan），2015，12（6）：499-506.

[21]Zhou Z Y，Zhao W R，Zhang J，et al.Sodium tanshinone ⅡA sulfonate： A review of pharmacological activity and pharmacokinetics[J].Biomed Pharmacother，2019，118：109362.

[收稿日期]2020-04-02

本文引用格式：張馨予，馬肅，豐靖馨，等.丹參酮ⅡA對鼠環(huán)孢素性牙齦增生及Bcl-2陽性表達(dá)影響的研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2022，31（6）：84-87.