純鈦表面微納米形貌對MC3T3-E1細胞的調(diào)控作用及機制研究

吳運 吳群 石夢琪

[摘要]目的：研究純鈦表面微納米形貌對成骨前體細胞MC3T3-E1黏附、遷移及成骨分化的調(diào)控作用及機制。方法：純鈦表面拋光作為對照、接種MC3T3-E1細胞作為對照組;采用酸蝕+20 V電壓陽極氧化的方法在純鈦表面制備微納米形貌、接種MC3T3-E1細胞作為微納米形貌組，轉(zhuǎn)染陰性對照（NC）-siRNA或整合素α2-siRNA作為微納米形貌+si-NC組、微納米形貌+si-整合素α2組，給予二甲基亞砜（DMSO）或細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）抑制劑PD98058作為微納米形貌+DMSO組、微納米形貌+PD98059組，檢測黏附數(shù)目、遷移率、成骨誘導(dǎo)分化后OD540及整合素α2、p-ERK、Runx2的表達水平。結(jié)果：電鏡下觀察，酸蝕+20 V電壓陽極氧化制備得到管徑100 nm的微納米形貌。微納米形貌組的黏附數(shù)目、遷移率、OD540及整合素α2、p-ERK、Runx2的表達水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。微納米形貌+si-整合素α2組的黏附數(shù)目、遷移率、OD540及整合素α2、p-ERK、Runx2的表達水平均低于微納米形貌+si-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。微納米形貌+PD98059組的黏附數(shù)目、遷移率、OD540及p-ERK、Runx2的表達水平均低于微納米形貌+DMSO組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：純鈦表面微納米形貌顯著促進MC3T3-E1細胞黏附、遷移及成骨分化，這一促進作用與激活整合素α2/ERK/Runx2通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]微納米形貌;純鈦表面改性;整合素α2;黏附;遷移;成骨分化;信號通路

[中圖分類號]R783.1? ? [文獻標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2022）06-0078-06

Regulatory Effect and Mechanism of Titanium Surface Micro-nano Topography on Adhesion， Migration and Osteogenic Differentiation of MC3T3-E1 Cells

WU Yun，WU Qun，SHI Mengqi

（Department of Stomatology，Naval Medical Center of PLA，Shanghai 200050，China）

Abstract： Objective? To investigate the effect and mechanism of titanium surface micro-nano topography on the adhesion， migration and osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells. Methods The pure titanium surface was polished for control， and MC3T3-E1 cells were inoculated as the control group. The micro-nano topography on the pure titanium surface was prepared by acid etching+20 V voltage anodization method， and MC3T3-E1 cells were inoculated as the micro-nano topography group. The negative control （NC）-siRNA or integrin α2-siRNA was transfected as the micro-nano topography+si-NC group， micro-nano topography +si-integrin α2 group. And DMSO or PD98058 was given as micro-nano topography+DMSO group， micro-nano topography+PD98059 group. The adhesion number， migration rate， OD540 after osteogenic differentiation and the expression level of integrin α2， p-ERK， Runx2 were detected. Results? Under the electron microscope， the micro-nano topography with diameter of 100 nm was prepared by acid etching+20 V anodizing. The adhesion number， migration rate， OD540 and the expression levels of integrin α2， p-ERK and Runx2 in the micro-nano topography group were higher than those in the control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The adhesion number， migration rate， OD540 and the expression levels of integrin α2， p-ERK and Runx2 in the micro-nano topography+si-integrin α2 group were lower than those in the micro-nano topography+si-NC group （P<0.05）. The adhesion number， migration rate， OD540 and the expression levels of p-ERK and Runx2 in the micro-nano topography+PD98059 group were lower than those in the micro-nano topography+DMSO group（P<0.05）. Conclusion? The titanium surface micro-nano topography significantly promote the adhesion， migration and osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells， which is related to the activation of integrin α2/ERK/Runx2 pathway.

Key words： micro-nano topography; surface modification of pure titanium; integrin α2; adhesion; migration; osteogenic differentiation; signal pathway

鈦是臨床上廣泛使用的口腔種植材料，具有良好的生物相容性、抗腐蝕性和機械性能，但因為鈦是一種惰性金屬，缺乏生物活性，光滑的純鈦表面不利于成骨細胞黏附、鋪展及分化，進行種植后存在骨結(jié)合不良或不穩(wěn)定、骨結(jié)合時間較長等不足[1-2]。為了在口腔種植治療后實現(xiàn)更好更快的種植體周圍骨結(jié)合，近些年越來越多的學(xué)者主張對鈦表面進行改性，具體是指通過物理、化學(xué)、生物等處理形成微納米形貌以模擬類似細胞外基質(zhì)的微環(huán)境，有利于成骨細胞的黏附、遷移及分化[3-4]。酸蝕、陽極氧化、噴砂、堿熱是純鈦表面微納米形貌常用的制備方法，已有研究證實純鈦表面微納米形貌對間充質(zhì)干細胞、成骨細胞前體細胞MC3T3-E1的黏附、遷移及成骨分化具有促進作用[5-7]，但與之相關(guān)的分子機制尚不十分清楚。為了更加深入認識純鈦表面微納米形貌在口腔種植治療中的價值，本研究將以成骨細胞前體細胞MC3T3-E1為實驗對象，深入探究純鈦表面微納米形貌對MC3T3-E1細胞黏附、遷移及成骨分化的調(diào)控作用及機制。

1? 材料和方法

1.1 材料：純鈦樣品（拉瓦生物公司，杭州），MC3T3-E1細胞（ATCC公司，美國）;整合素α2-siRNA、陰性對照（Negative control，NC）-siRNA（吉瑪公司，上海）;細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases，ERK）抑制劑PD98059（MCE公司，美國）;二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、茜素紅（Sigma公司，美國），整合素α2、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）、β-actin一抗（Abcam公司，美國），ERK、磷酸化-ERK（p-ERK）一抗（CST公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 純鈦表面微納米形貌的制備：參照張琰[7]的研究采用酸蝕+電壓下陽極氧化的方法進行純鈦表面微納米形貌的制備。純鈦樣品用400-7000目的SiC水砂紙依次拋光，拋光后的純鈦用于對照，紫外照射消毒后備用。另取拋光的純鈦浸于0.5%氫氟酸溶液、酸蝕20 min，而后以純鈦為陽極、石墨棒為陰極、設(shè)置電壓為20 V進行陽極氧化1 h，最后依次在丙酮、無水乙醇、去離子水中超聲清洗15 min，紫外照射消毒后備用。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及分組：MC3T3-E1細胞在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，待細胞融合至90%后用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代，傳代后的細胞接種在培養(yǎng)板內(nèi)進行培養(yǎng)及分組。對照組在培養(yǎng)孔內(nèi)放入拋光后的純鈦樣品，而后接種MC3T3-E1細胞;微納米形貌組在培養(yǎng)孔內(nèi)放入酸蝕+陽極氧化的純鈦樣品，而后接種MC3T3-E1細胞;微納米形貌+si-NC組和微納米形貌+si-整合素α2組在培養(yǎng)孔內(nèi)放入酸蝕+陽極氧化的純鈦樣品，而后接種MC3T3-E1細胞，按照說明書轉(zhuǎn)染NC-siRNA或整合素α2-siRNA;微納米形貌+DMSO組和微納米形貌+PD98059組在培養(yǎng)孔內(nèi)放入酸蝕+陽極氧化的純鈦樣品，而后接種MC3T3-E1細胞，加入PD98059使其終濃度達到10μmol/L或加入等體積（體積分數(shù)0.1%）DMSO。

1.2.3 細胞黏附的檢測：細胞接種在純鈦表面后進行分組處理，24 h后用4%多聚甲醛固定0.5 h，0.05% Triton X-100透膜10 min，避光孵育Hochest，在熒光顯微鏡的高倍視野下進行觀察，對黏附的細胞進行計數(shù)。

1.2.4 細胞遷移的檢測：細胞接種在純鈦表面，融合后在無血清培養(yǎng)基中饑餓8 h，在中央做一劃痕并在顯微鏡下觀察，計算劃痕面積為A0;按照1.2.2的方法分組處理24 h后，在顯微鏡下觀察劃痕并計算劃痕面積為A24。按照公式[（A0-A24）/A0]×100%計算遷移率。

1.2.5 細胞成骨分化的檢測：細胞接種在純鈦表面，融合后更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C、10%胎牛血清）進行成骨誘導(dǎo)分化，并按照1.2.2的方法分組，每2 d更換1次成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液。成骨誘導(dǎo)分化第21天，4%多聚甲醛固定0.5 h，1%茜素紅染色液孵育20 min，顯微鏡下拍照;棄去茜素紅染色液，加入十六烷基吡啶，37℃孵育15 min，在酶標(biāo)儀上測定540 nm波長處的吸光值OD540。

1.2.6 整合素α2、p-ERK、ERK、Runx2表達的檢測：細胞接種在純鈦表面，融合后按照1.2.2的方法分組，24 h后收集細胞并加入裂解液提取細胞內(nèi)的蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)測定結(jié)果取含有30 μg蛋白的樣本在SDS-PAGE中進行電泳，電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，而后在5%脫脂牛奶中室溫封閉硝酸纖維素（NC）膜1 h，在1：2 000稀釋的整合素α2、p-ERK、ERK、Runx2一抗或1：5 000稀釋的β-actin一抗中4℃孵育過夜;次日，NC膜在1：2 000稀釋的二抗中室溫孵育1 h，最后在凝膠成像系統(tǒng)中顯影，根據(jù)蛋白條帶的灰度值、以β-actin為內(nèi)參計算整合素α2、Runx2的表達水平，以ERK為內(nèi)參、計算p-ERK的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)均為計量資料、以均數(shù)±標(biāo)準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，有統(tǒng)計學(xué)差異后進一步比較采用SNK-q檢驗進行兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 純鈦表面形貌的電鏡觀察：電鏡下觀察純鈦表面形貌如圖1所示。對照組純鈦表面光滑，隱約可見少量平行的細小拋光痕;微納米形貌組純鈦表面可見納米級結(jié)構(gòu)，納米管徑約100 nm。

2.2 純鈦表面微納米形貌對MC3T3-E1細胞黏附、遷移及成骨分化的影響：采用Transwell檢測細胞黏附、劃痕實驗檢測細胞遷移，比較兩組間黏附數(shù)目、遷移率的差異。微納米形貌組MC3T3-E1細胞的黏附數(shù)目、遷移率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖2A～D;成骨誘導(dǎo)分化后，微納米形貌組可見大量礦化結(jié)節(jié)，對照組可見少量礦化結(jié)節(jié)，微納米形貌組的OD540水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖2E～F。

注：A.Hochest熒光染色結(jié)果;B.細胞黏附數(shù)目比較;C.細胞劃痕實驗結(jié)果;D.細胞遷移率比較;E.成骨誘導(dǎo)分化后的茜素紅染色結(jié)果;F.OD540水平比較。*表示與對照組比較，P<0.05

2.3 純鈦表面微納米形貌對MC3T3-E1中整合素α2、p-ERK、Runx2表達的影響：微納米形貌組MC3T3-E1細胞中整合素α2、p-ERK、Runx2的表達水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

2.4 轉(zhuǎn)染整合素α2-siRNA對純鈦表面微納米形貌下MC3T3-E1細胞中整合素α2、p-ERK、Runx2表達的影響：微納米形貌+si-整合素α2組MC3T3-E1細胞中整合素α2、p-ERK、Runx2的表達水平均低于微納米形貌+si-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖4。

2.5 敲低整合素α2對純鈦表面微納米形貌促進MC3T3-E1黏附、遷移及成骨分化的影響：微納米形貌+si-整合素α2組MC3T3-E1細胞的黏附數(shù)目、遷移率均低于微納米形貌+si-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖5A～D;成骨誘導(dǎo)分化后，微納米形貌+si-NC組可見大量礦化結(jié)節(jié)，微納米形貌+si-整合素α2組可見少量礦化結(jié)節(jié)，微納米形貌+si-整合素α2組的OD540水平低于微納米形貌+si-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖5E～F。

2.6 ERK抑制劑對純鈦表面微納米形貌下MC3T3-E1細胞中整合素α2、p-ERK、Runx2表達的影響：微納米形貌+PD98059組MC3T3-E1細胞中整合素α2的表達水平與微納米形貌+DMSO組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;p-ERK、Runx2的表達水平均低于微納米形貌組+DMSO組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖6。

2.7 ERK抑制劑對純鈦表面微納米形貌促進MC3T3-E1黏附、遷移及成骨分化的影響：微納米形貌+PD98059組MC3T3-E1細胞的黏附數(shù)目、遷移率均低于微納米形貌+DMSO組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖7A～D;成骨誘導(dǎo)分化后，微納米形貌+DMSO組可見大量礦化結(jié)節(jié)，微納米形貌+PD98059組可見少量礦化結(jié)節(jié)，微納米形貌+PD98059組的OD540水平低于微納米形貌+si-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖7E～F。

3? 討論

酸蝕、陽極氧化、噴砂、堿熱等是常用的純鈦表面改性手段，改性后顯著促進成骨前體細胞MC3T3-E1的黏附、遷移及成骨分化具有促進作用[5-6，8-9]。陽極氧化法最早由Gong在2001年報道[10]，與傳統(tǒng)的噴砂、酸蝕等方法比較，該方法制備得到的納米管結(jié)構(gòu)可以更好地改善種植體表面的骨結(jié)合[11-12]。國內(nèi)張琰[7]的實驗研究采用酸蝕+陽極氧化的方法進行純鈦表面微納米形貌的制備，5 V、10 V、20 V電壓的陽極氧化分別制備得到管徑30 nm、50 nm、100 nm的微納米形貌，隨著電壓升高、納米管徑增強，間充質(zhì)干細胞在純鈦表面的成骨分化能力增強。本研究采用與張琰相同的方法制備得到管徑100 nm的純鈦表面微納米形貌，接種成骨前體細胞MC3T3-E1后發(fā)現(xiàn)細胞的黏附、遷移及成骨分化均得到增強，與張琰[7]的實驗結(jié)果吻合。在此基礎(chǔ)上，本研究將對相關(guān)的分子機制進行深入探究。

有研究報道，噴砂、酸蝕、等離子噴涂進行純鈦表面改性后，細胞中整合素α5β1、整合素α2等表達增加[13-14]。骨質(zhì)疏松相關(guān)的研究證實整合素α2對間充質(zhì)干細胞、成骨前體細胞的黏附、遷移及成骨分化具有促進作用[15-17]。本研究在純鈦表面制備微納米形貌后接種MC3T3-E1細胞，細胞中整合素α2的表達水平明顯增加;通過轉(zhuǎn)染siRNA的方式敲低整合素α2的表達后，微納米形貌促進MC3T3-E1細胞黏附、遷移及成骨分化的作用明顯減弱，表明酸蝕+陽極氧化制備的微納米形貌通過上調(diào)整合素α2表達的途徑促進成骨前體細胞的黏附、遷移及成骨分化。

MAPK家族是整合素發(fā)揮生物學(xué)作用的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[18]。蔣代富[17]在間充質(zhì)干細胞中證實整合素α2通過激活MAPK家族中的ERK調(diào)控細胞遷移及黏附、成骨分化的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)純鈦表面微納米形貌增加MC3T3-E1細胞中p-ERK、Runx2的表達，敲低整合素α2后細胞中p-ERK、Runx2的表達降低，表明純鈦表面微納米形貌通過上調(diào)整合素α2表達的途徑促進下游ERK激活、Runx表達。在MC3T3-E1細胞接種在純鈦表面微納米形貌的同時加用ERK抑制劑處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微納米形貌促進MC3T3-E1細胞黏附、遷移及成骨分化的作用明顯減弱。以上敲低整合素α2、抑制ERK的反向驗證實驗表明整合素α2/ERK/Runx2通路在純鈦表面微納米形貌促進成骨前體細胞黏附、遷移及成骨分化中起重要作用。

綜上所述，本研究采用酸蝕+20 V電壓的陽極氧化方法在純鈦表明制備了管徑為100 nm的微納米形貌，該微納米形貌顯著促進成骨前體細胞MC3T3-E1的黏附、遷移及成骨分化，并且本研究還初步闡明了微納米形貌發(fā)揮上述作用的分子機制與促進整合素α2/ERK/Runx2通路激活有關(guān)，這是本研究的創(chuàng)新性所在。本研究的上述實驗結(jié)果為今后發(fā)現(xiàn)更優(yōu)的純鈦表面改性方法、改進純鈦種植體移植治療的效果提供了新思路。

[參考文獻]

[1]Basso F G，Pansani T N，Cardoso L M，et al.Influence of bisphosphonates on the behavior of osteoblasts seeded onto titanium discs[J].Braz Dent J，2020，31（3）：304-309.

[2]Hong J Y，Ko S Y，Lee W，et al.Enhancement of bone ingrowth into a porous titanium structure to improve osseointegration of dental implants： a pilot study in the canine model[J].Materials（Basel），

2020，13（14）：3061.

[3]Mughal M P，F(xiàn)arooq M U，Mumtaz J，et al.Surface modification for osseointegration of Ti6Al4V ELI using powder mixed sinking EDM[J].J Mech Behav Biomed Mater，2021，113：104145.

[4]Tovani C B，F(xiàn)erreira C R，Sim?o A M S，et al. Characterization of the in vitro osteogenic response to submicron TiO2 particles of varying structure and crystallinity[J].ACS Omega，2020，5（27）：16491-16501.

[5]Lu M，Chen H，Yuan B，et al.Electrochemical deposition of nanostructured hydroxyapatite coating on titanium with enhanced early stage osteogenic activity and osseointegration[J].Int J Nanomedicine，2020，15：6605-6618.

[6]Fu X，Liu P，Zhao D，et al.Effects of nanotopography regulation and silicon doping on angiogenic and osteogenic activities of hydroxyapatite coating on titanium implant[J].Int J Nanomedicine，2020，15：4171-4189.

[7]張琰，石夢琪，吳群，等.純鈦表面不同管徑微納米改性對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞生物學(xué)行為的影響[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2019，17（6）：350-356，366.

[8]Xu A T，Xie Y W，Xu J G，et al.Effects of strontium-incorporated micro/nano rough titanium surfaces on osseointegration via modulating polarization of macrophages[J].Colloids Surf B Biointerfaces，2021，207：111992.

[9]Zhang Z，Xu R，Yang Y，et al.Micro/nano-textured hierarchical titanium topography promotes exosome biogenesis and secretion to improve osseointegration[J].J Nanobiotechnology，2021，19（1）：78.

[10]Gong D，Grimes C A，Varghese O K，et al.Titanium oxide nano-tube arrays prepared by anodic oxidation[J].J Mater Res，2001，16（12）：3331-3334.

[11]Zhan X，Li S，Cui Y，et al.Comparison of the osteoblastic activity of low elastic modulus Ti-24Nb-4Zr-8Sn alloy and pure titanium modified by physical and chemical methods[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2020，113：111018.

[12]Yeo I L.Modifications of dental implant surfaces at the micro- and nano-level for enhanced osseointegration[J].Materials（Basel），2019，13（1）：89.

[13]Kaczmarek M，Jurczyk K，Purwin D，et al.Molecular analysis of biocompatibility of anodized titanium with deposited silver nanodendrites[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2018，93：437-444.

[14]Fernandes C J C，Bezerra F，do Carmo M D D，et al.CoCr-enriched medium modulates integrin-based downstream signaling and requires a set of inflammatory genes reprograming in vitro[J].J Biomed Mater Res A，2018，106（3）：839-849.

[15]Szekacs I，F(xiàn)arkas E，Gemes B L，et al.Integrin targeting of glyphosate and its cell adhesion modulation effects on osteoblastic MC3T3-E1 cells revealed by label-free optical biosensing[J].Sci Rep，2018，8（1）：17401.

[16]Raines A L，Berger M B，Schwartz Z，et al.Osteoblasts grown on microroughened titanium surfaces regulate angiogenic growth factor production through specific integrin receptors[J].Acta Biomater，2019，97：578-586.

[17]蔣代富，朱曉英，肖雪.整合素α2在老齡骨質(zhì)疏松BMSC成骨分化的調(diào)控機制[J].中國老年學(xué)雜志，2019，39（20）：5055-5058.

[18]Chen X，Wang J，Chen Y，et al.Roles of calcium phosphate-mediated integrin expression and MAPK signaling pathways in the osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells[J].J Mater Chem B，2016，4（13）：2280-2289.

[收稿日期]2021-07-14

本文引用格式：吳運，吳群，石夢琪.純鈦表面微納米形貌對MC3T3-E1細胞的調(diào)控作用及機制研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2022，31（6）：78-83.