野菊藥用及非藥用部位中總黃酮和總酚酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

楊 勇，魏 民，嚴(yán) 露，楊 菁

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 茶+大健康食品開發(fā)研究中心，貴州 貴陽 550025；3.華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518110；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012）

野菊花（Flos Chrysanthemi Indici）為菊科（Asteraceae）植物野菊（Chrysanthemum indicumL.）的干燥頭狀花序，性涼、味苦、辛，歸肝、心經(jīng)，具有清熱解毒、抗菌消炎的功效，是治療疔瘡癰腫、目赤腫痛、頭痛眩暈的常用中草藥[1]。野菊花的主要成分包括黃酮類、酚酸類、萜類、揮發(fā)油類、多糖類、甾體類及烴類等[2]，但其抗菌消炎、清熱解毒的藥效成分主要是黃酮類和以綠原酸為代表的酚酸類化合物[2-3]。

市場上以野菊花為原料的中成藥、日化用品和茶飲種類繁多，導(dǎo)致近年來野菊花的需求量巨大。目前，市場上均以花序作為野菊的藥用部位，而非藥用部位（根、莖和葉）往往得不到充分利用。前人已采用高效液相色譜或超高效液相色譜等方法對野菊花、葉、莖中的單一或多個黃酮和酚酸類成分進(jìn)行定量分析[4-6]。由于野菊花抗菌消炎、清熱解毒的藥效貢獻(xiàn)主要來自其所含的黃酮和酚酸類成分的協(xié)同作用，對其中單一或多個成分含量的測定并不能真正表征野菊花的藥理活性。目前，測定野菊中總黃酮和總酚酸的方法尚未見報道，且總黃酮和總酚酸類藥效成分在野菊藥用及非藥用部位中的含量也不清楚，建立相應(yīng)的方法進(jìn)行測定，有助于為野菊非藥用部位的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

紫外-可見分光光度計（UV-5900型，上海元析儀器有限公司），電子分析天平（AR2140型，奧豪斯國際貿(mào)易有限公司），超聲波提取器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司）。

蘆丁對照品（上海笛柏生物科技有限公司，批號153-18-4，純度不低于98.00%），綠原酸對照品（上海笛柏生物科技有限公司，批號327-97-9，純度不低于98.00%）。無水乙醇、醋酸、醋酸鈉、鹽酸、三氯化鋁、十二烷基硫酸鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵和其他試劑均為分析純，試驗用水為蒸餾水。

實驗所需野菊藥材由華潤三九醫(yī)藥股份有限公司提供，采于湖北省陽新縣，為栽培型品種，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)麻秀萍教授鑒定為野菊Chrysanthemum indicumL.的全株。將野菊各部位分離后經(jīng)60 ℃烘箱烘干，粉碎，過3號篩，分裝于密封袋中備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法

2.1.1 對照品溶液的制備

精確稱取11.240 mg蘆丁對照品置于25.00 mL容量瓶中，用70.00%乙醇溶解并定容，配制成0.449 6 mg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

精確稱取野菊根、莖、葉和花樣品約0.25 g，置于50.00 mL具塞錐形瓶中，精確加入30.00 mL 70.00%乙醇，稱重，超聲提取40 min，冷卻至室溫，用70.00%乙醇補足失重，搖勻、過濾，得野菊各部位供試品溶液。

2.1.3 顯色劑溶液的配制

稱取AlCl31.34 g，加100.00 mL水溶解，得0.1 mol/L AlCl3溶液；取一定量0.2 mol/L CH3COONa溶液（2.72 g CH3COONa·3H2O加水溶解成100.00 mL溶液），加入0.2 mol/L HAc溶液（1.15 mL冰醋酸加水稀釋至100.00 mL）調(diào)節(jié)pH至5.2，得NaAc-HAc緩沖溶液。

2.1.4 顯色方法

楊雅欣等[7]指出，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色方法對黃酮類化合物顯色后會產(chǎn)生紅色絮狀物，導(dǎo)致測量結(jié)果不準(zhǔn)確，所以本實驗采用顯色后不會出現(xiàn)絮狀物的AlCl3-NaAc-HAc顯色法。精確吸取適量對照品或供試品溶液于10.00 mL容量瓶中，加0.1 mol/L AlCl3溶液0.50 mL和NaAc-HAc緩沖溶液（pH=5.2）2.00 mL，用70.00%乙醇稀釋至刻度，搖勻，顯色20 min后測定。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精確吸取0.449 6 mg/mL蘆丁對照品溶液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mL于10.00 mL容量瓶中，按“2.1.4”方法顯色后，同樣方法制備空白溶液。于411 nm處分別測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程?；貧w方程為：Y=24.71X+0.018，相關(guān)系數(shù)r=0.999 5，表明對照品溶液質(zhì)量濃度在0.004 5～0.031 5 mg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.6 方法學(xué)驗證

2.1.6.1 精確度試驗

精確稱野菊花樣品0.25 g，按“2.1.2”方法制備供試品溶液，并按“2.1.4”方法進(jìn)行顯色，于411 nm處測定吸光度，重復(fù)測定6次，總黃酮吸光度平均值為0.633，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為0.02%，表明儀器的精確度良好。

2.1.6.2 重復(fù)性試驗

精確稱取0.25 g野菊花樣品6份，按“2.1.2”方法制備供試品溶液，并按“2.1.4”方法進(jìn)行顯色，于411 nm處測定吸光度，計算得總黃酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.74%，RSD為0.45%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.1.6.3 穩(wěn)定性試驗

精確稱定野菊花樣品0.25 g，按“2.1.2”方法制備供試品溶液，并于1、2、4、8、12、24 h按“2.1.4”方法進(jìn)行顯色，于411 nm處測定吸光度，平均吸光度為0.602，RSD為1.33%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6.4 加樣回收率試驗

精確稱取6份已知含量的野菊花樣品0.10 g，分別加入0.449 6 mg/mL蘆丁對照品溶液6.62 mL，70.00%乙醇補至30.00 mL，稱重，超聲提取40 min，冷卻至室溫，用70.00%乙醇補足失重，搖勻、過濾，得供試品溶液。按“2.1.4”項下方法進(jìn)行顯色，于411 nm處測定吸光度，計算回收率和RSD，結(jié)果見表1。

表1 總黃酮加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.1.7 野菊藥用及非藥用部位中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

精確稱取野菊根、莖、葉和花樣品0.25 g各3份，按“2.1.2”方法制備供試品溶液，并按“2.1.4”方法進(jìn)行顯色，于411 nm處測定吸光度，按干燥品計算野菊各部位中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2和圖1。

圖1 野菊各部位中總黃酮和總酚酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（與花比較，***p＜0.001）

表2 野菊不同部位中總黃酮和總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（n=3）

2.2 總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法

2.2.1 對照品溶液的制備

精確稱定10.230 mg綠原酸對照品置于25.00 mL容量瓶中，用80.00%乙醇溶解并定容，配制成0.409 1 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

精確稱取野菊根、莖、葉和花樣品0.60 g，置于50.00 mL具塞錐形瓶中，精確加入30.00 mL 80.00%乙醇，稱重，超聲提取30 min，冷卻至室溫，用80.00%乙醇補足失重，搖勻、過濾，得野菊各部位供試品溶液。

2.2.3 顯色劑溶液的配制

精確稱取十二烷基硫酸鈉0.30 g，加入100.00 mL超純水溶解于細(xì)口試劑瓶中，得0.30% SDS溶液；精確稱取鐵氰化鉀0.90 g，加入100.00 mL超純水溶解于棕色細(xì)口試劑瓶中，得0.90%鐵氰化鉀溶液；精確稱取三氯化鐵0.60 g，加入100.00 mL超純水溶解于棕色細(xì)口試劑瓶中，得0.60%三氯化鐵溶液。使用時，0.90%鐵氰化鉀與0.60%三氯化鐵按1∶1混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2.4 顯色方法

參考付煜榮等[8]的研究，精確吸取適量待測液于10.00 mL容量瓶中，加無水乙醇至2.00 mL，精確加0.30%十二烷基硫酸鈉0.80 mL、0.60%FeCl3-0.90%K3[Fe(CN)6]（1.0∶0.9）混合溶液0.40 mL，搖勻，在暗處放置5 min后，用0.1 mol/L HCl定容，搖勻，暗處放置20 min。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精確吸取0.409 1 mg/mL綠原酸對照品溶液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL于10.00 mL容量瓶中，按“2.2.4”方法顯色后，同法制備空白溶液。于724 nm處分別測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程?；貧w方程為：Y=63.36X－0.157 2，相關(guān)系數(shù)r=0.999 2，表明對照品溶液質(zhì)量濃度在0.004 1～0.020 4 mg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 方法學(xué)驗證

2.2.6.1 精確度試驗

精確稱取野菊花樣品0.60 g，按“2.2.2”方法制備供試品溶液，并按“2.2.4”方法進(jìn)行顯色，于724 nm處測定吸光度，重復(fù)測定6次，總酚酸吸光度平均值為0.997，RSD為0.11%，表明儀器精確度良好。

2.2.6.2 重復(fù)性試驗

精確稱取0.60 g野菊花樣品6份，按“2.2.2”方法制備6份供試品溶液，于724 nm處測定吸光度，計算得總酚酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.06%，RSD為1.10%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6.3 穩(wěn)定性試驗

精確稱定野菊花樣品0.60 g，按“2.2.2”方法制備供試品溶液，并于1、2、4、8、12、24 h在724 nm處測定吸光度，平均吸光度為0.989，RSD為0.35%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6.4 加樣回收率試驗

精確稱取6份已知含量的野菊花樣品0.10 g，分別加入0.409 1 mg/mL綠原酸對照品溶液22.00 mL、80.00%乙醇補至30.00 mL，稱重，超聲提取30 min，冷卻至室溫，用80.00%乙醇補足失重，搖勻、過濾，得供試品溶液。按“2.2.4”方法進(jìn)行顯色，于724 nm處測定吸光度，計算回收率和RSD，結(jié)果見表3。

表3 總酚酸加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.2.6.5 野菊藥用及非藥用部位中總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

精確稱取0.60 g野菊根、莖、葉和花樣品各3份，按“2.2.2”方法制備供試品溶液，并按“2.2.4”方法進(jìn)行顯色，于724 nm處測定吸光度，按干燥品計算野菊各部位中總酚酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2和圖1。

3 討論

野菊花清熱解毒、抗菌消炎的功效主要來自黃酮類和酚酸類成分的協(xié)同作用[3]，表明單一黃酮或酚酸類成分的含量不能真正表征野菊花的藥效作用。因此，對野菊中總黃酮和總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定能從整體上評價野菊的藥用價值。對野菊藥用及非藥用部位中總黃酮和總酚酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，野菊葉中總黃酮和總酚酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于花、莖和根，這與前人對野菊不同部位中單一黃酮和酚酸成分含量測定的結(jié)果趨于一致[5-6]，表明野菊葉可能具有比野菊花更好的清熱解毒、抗菌消炎功效，但還需進(jìn)一步的藥效驗證，同時也表明野菊葉具有開發(fā)利用價值。

對野菊中總黃酮的提取條件，即提取方式（回流提取、超聲提?。⑻崛∪軇?0.00%乙醇、50.00%乙醇、70.00%乙醇、90.00%乙醇）、提取時間（10、20、30、40、50、60 min）以及料液比（1∶50、1∶80、1∶100、1∶120）進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在料液比1∶120、70.00%乙醇超聲處理40 min條件下，野菊中的總黃酮可以達(dá)到最佳提取效率。

對野菊中總酚酸的提取條件，即提取方式（回流提取、超聲提?。⑻崛∪軇?0.00%乙醇、60.00%乙醇、70.00%乙醇、80.00%乙醇、90.00%乙醇）、提取時間（10、20、30、40、50、60 min）以及料液比（1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70）進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在料液比1∶50、80.00%乙醇超聲處理30 min條件下，野菊中的總酚酸可以達(dá)到最佳提取效率。