黃芪湯調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路改善高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的研究

芮蓉,陳瑛,朱冰冰,曹愛(ài)麗,王浩,王利

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院,上海 200062)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是由糖尿病引起的微血管并發(fā)癥之一,最終可導(dǎo)致終末期腎病。一旦早期DN發(fā)展成終末期腎病,腎功能衰竭就不可避免且不可逆轉(zhuǎn),需要采用腎臟替代療法[1],因此早期診斷、干預(yù)和治療是逆轉(zhuǎn)或阻止DN進(jìn)展的關(guān)鍵。慢性高血糖造成腎小球?yàn)V過(guò)屏障的破壞以及腎臟血流動(dòng)力學(xué)的改變,引起尿蛋白分泌增加,持續(xù)性蛋白尿誘導(dǎo)腎臟炎癥和纖維化,造成腎功能障礙[2]。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的重要組成部分,研究表明,足細(xì)胞長(zhǎng)期處于高血糖環(huán)境,會(huì)引起足細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能異常,進(jìn)而影響腎小球?yàn)V過(guò)功能,持續(xù)、不可逆地產(chǎn)生大量蛋白尿,導(dǎo)致腎功能損害[3]。因此,減輕足細(xì)胞損傷被認(rèn)為是預(yù)防或減緩DN進(jìn)展的有效途徑。

慢性炎癥是DN的主要病理特征,DN早期即可觀察到如白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-6、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)等促炎因子分泌的改變,因此抑制高血糖引起的足細(xì)胞炎癥是預(yù)防足細(xì)胞損傷的有效治療策略之一[4]。研究表明,核因子-κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)調(diào)節(jié)大量參與炎癥反應(yīng)的基因表達(dá),是足細(xì)胞損傷的重要靶點(diǎn)。Toll 樣受體 4(Toll-like receptor 4,TLR4)在DN腎小球炎癥內(nèi)在途徑中也發(fā)揮著重要作用,是公認(rèn)的NF-κB上游轉(zhuǎn)錄因子[5-6]。TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活可導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生,介導(dǎo)DN早期炎癥損傷。

黃芪湯首載于北宋楊士瀛《仁齋直指方論》卷十七[7],原方由黃芪、茯神、瓜蔞根、麥門(mén)冬、北五味子、生地黃、炙甘草7味中藥組成。茯神藥效長(zhǎng)于養(yǎng)心安神，茯苓則功效更長(zhǎng)于健脾，且方中五味子、瓜蔞根斂肺益腎、益氣生津，可濟(jì)身中津液之枯，加之茯苓健脾可制胃腸激烈之燥，除燥熱之標(biāo)，三藥共奏養(yǎng)陰清熱潤(rùn)燥之功，故本團(tuán)隊(duì)所用黃芪湯由原方去茯神加茯苓化裁而來(lái)。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明,黃芪湯及其活性成分具有腎臟保護(hù)作用,可有效保護(hù)足細(xì)胞,延緩DN進(jìn)展[8-10],但黃芪湯在DN進(jìn)程中減輕足細(xì)胞炎癥損傷的作用機(jī)制目前尚未闡明,因此本研究通過(guò)探討黃芪湯對(duì)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞的保護(hù)作用及可能機(jī)制,為黃芪湯的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

永生化人足細(xì)胞株(Human podocyte,HPC),由美國(guó)Mount Sinai醫(yī)院何慈江教授贈(zèng)送。

1.2 藥物

黃芪湯方劑組成為[11]:黃芪2 kg，茯苓2 kg，麥門(mén)冬2 kg，北五味子1 kg，生地黃3 kg，瓜蔞根2 kg和炙甘草1 kg,共計(jì)13 kg。加水熱回流提取2 h后過(guò)濾,擠干濾渣內(nèi)水分,再重復(fù)上述提取、過(guò)濾流程2次。合并3次提取液,減壓濃縮為稠浸膏,以95%乙醇調(diào)節(jié)含醇量為70%,靜置過(guò)夜,吸取上清液,置于減壓干燥箱中,105 ℃下減壓干燥48 h,得干粉提取物,每1 g提取物相當(dāng)于7.5 g處方量。

含黃芪湯培養(yǎng)基的制備:稱(chēng)取適量黃芪湯干粉提取物,經(jīng)渦旋、超聲、水浴等方法使其充分溶解于RPMI-1640培養(yǎng)基后,經(jīng)0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾并配制成所需濃度的溶液,4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑

D-葡萄糖(Biosharp公司,貨號(hào):BS099),RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司,貨號(hào):C11875500BT);TLR4抗體(Abcam公司,貨號(hào):ab13556),NF-κB抗體(Abcam公司,貨號(hào):ab16502),p-NF-κB抗體(CST公司,貨號(hào):3033T),TNF-α抗體(Abcam公司,貨號(hào):ab66579),IL-6抗體(Abcam公司,貨號(hào):ab93356),GAPDH抗體(Abcam公司,貨號(hào):ab22555);qPCR試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司,貨號(hào):FP205-03],CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所,貨號(hào):PG657),IL-6 ELISA試劑盒(北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司,貨號(hào):BDEL-0022),TNF-α ELISA試劑盒(北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司,貨號(hào):BDEL-0049)。

1.4 儀器

超凈工作臺(tái)(ESCO公司,型號(hào):SVE-6A1);二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司,型號(hào):HERAcell240i);電泳儀(BIO-RAD公司,型號(hào):165-8001);酶標(biāo)分析儀(BIO-RAD公司,型號(hào):BioRad-680);化學(xué)發(fā)光成像儀(BIO-RAD公司,型號(hào):CDT94547);熒光顯微鏡(OLMYPUS公司,型號(hào):CKX41/U-RFLT50);qPCR儀(ABI公司,型號(hào):ABI7300)。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人足細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,配制成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后按每孔1×103個(gè)的密度鋪于96孔板中,每孔加入100 μL細(xì)胞懸液,分為空白組(調(diào)零組)、對(duì)照組、黃芪湯(1、3、10、30、100、300、1 000、3 000 μg·mL-1)組,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞放入33 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h后觀察細(xì)胞貼壁情況,根據(jù)上述分組加入相應(yīng)的處理因素,繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h,培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入100 μL CCK-8工作液在33 ℃孵育2 h,使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度(A)。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式:抑制率=(A對(duì)照組-A黃芪湯組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%?？瞻捉M只加CCK-8工作液;對(duì)照組只加細(xì)胞、CCK-8工作液。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

人足細(xì)胞于33 ℃、5% CO2的條件下，在含有10%胎牛血清、1%胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒(Insulin transferrin selenium，ITS)、1%青鏈霉素(Penicillin streptomycin，PS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中增殖,于37 ℃、5% CO2的條件下分化7 d用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(5 mmol·L-1葡萄糖)、模型組(30 mmol·L-1葡萄糖)、黃芪湯低濃度組(30 mmol·L-1葡萄糖+10 μg·mL-1黃芪湯)、黃芪湯中濃度組(30 mmol·L-1葡萄糖+30 μg·mL-1黃芪湯)、黃芪湯高濃度組(30 mmol·L-1葡萄糖+100 μg·mL-1黃芪湯)。黃芪湯在高糖刺激前2 h加入,細(xì)胞培養(yǎng)24 h后用于實(shí)驗(yàn)。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人足細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,配制成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后按每孔1×104密度鋪于6孔板中,放入33 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁,轉(zhuǎn)移至37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7 d,黃芪湯組提前2 h加入含黃芪湯無(wú)血清培養(yǎng)基,使用100 μL無(wú)菌槍頭于板底劃線,PBS洗滌去除懸浮細(xì)胞,加入對(duì)應(yīng)藥物進(jìn)行干預(yù),立即于顯微鏡下拍攝加藥后初始劃痕照片，將細(xì)胞放回33 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),24 h后同一位置拍攝照片,使用Image J分析劃痕照片，計(jì)算各組細(xì)胞遷移率。遷移率=(初始距離面積-24 h距離面積)/(初始距離面積)×100%。

1.8 qPCR法檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)

以10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞,黃芪湯組根據(jù)CCK-8檢測(cè)結(jié)果,設(shè)置實(shí)驗(yàn)濃度為100 μg·mL-1,給予對(duì)應(yīng)干預(yù)24 h后,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。用2-ΔΔCt計(jì)算mRNA表達(dá)量。

引物設(shè)計(jì)與合成由上海捷瑞生物工程有限公司提供,序列如表1所示。

表1 細(xì)胞炎癥因子引物序列Table 1 Cellular inflammatory factor primer sequence

1.9 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清炎癥因子水平

收取各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后的上清液,按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作,檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平。

1.10 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)水平

各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后提取蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%BSA封閉1 h,加入對(duì)應(yīng)一抗,4 ℃搖床孵育過(guò)夜。次日用TBST洗膜3次,每次5 min,加入對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1 h,TBST洗膜3次,每次5 min,ECL避光顯影,使用Image J軟件分析條帶,計(jì)算各組目的蛋白與GAPDH比值,得出各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 黃芪湯對(duì)足細(xì)胞增殖活性的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,與黃芪湯1 μg·mL-1組相比,黃芪湯濃度為3、10、30、100 μg·mL-1時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖活性無(wú)明顯影響(P>0.05),結(jié)果見(jiàn)表2。因此,本實(shí)驗(yàn)選取10、30、100 μg·mL-1三個(gè)濃度觀察黃芪湯對(duì)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的影響。

表2 不同濃度黃芪湯對(duì)足細(xì)胞增殖抑制率的影響Table 2 Effect of different concentration of Huangqi Decoction on podocyte proliferation

2.2 黃芪湯對(duì)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞遷移及黏附能力的影響

結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞劃痕愈合率明顯降低(P<0.01),說(shuō)明高糖抑制了足細(xì)胞遷移和黏附作用;與模型組相比,予10、30、100 μg·mL-1黃芪湯干預(yù)后,各組細(xì)胞劃痕愈合率明顯升高(P<0.01),表明黃芪湯改善了高糖對(duì)足細(xì)胞遷移、黏附能力的作用,結(jié)果見(jiàn)圖1。

注:與對(duì)照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖1 黃芪湯對(duì)足細(xì)胞遷移能力的影響Fig.1 Effect of Huangqi Decoction on the migration ability of podocyte

2.3 黃芪湯對(duì)足細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比,模型組中IL-6、TNF-α、CCL24 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05,P<0.01);與模型組相比,高濃度黃芪湯干預(yù)后,足細(xì)胞中IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.01),表明黃芪湯可抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞炎癥反應(yīng),結(jié)果見(jiàn)圖2。

注:與對(duì)照組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,圖2 黃芪湯對(duì)足細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effect of Huangqi Decoction on the mRNA fold change of podocyte inflammatory cytokine

2.4 黃芪湯對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞上清液中IL-6和TNF-α水平的影響

ELISA結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞炎癥因子IL-6和TNF-α水平明顯升高(P<0.01);黃芪湯干預(yù)明顯降低了上清液中IL-6和TNF-α的水平(P<0.01),表明黃芪湯能夠減少高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中炎癥因子IL-6、TNF-α的分泌,抑制足細(xì)胞炎癥反應(yīng),結(jié)果見(jiàn)圖3。

注:與對(duì)照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖3 黃芪湯對(duì)足細(xì)胞上清液中炎癥因子水平的影響Fig.3 Effect of Huangqi Decoction on the levels of inflammatory cytokine in the supernatant of podocyte

2.5 黃芪湯對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)的影響

通過(guò)Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證黃芪湯對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞炎癥的抑制作用。與ELISA結(jié)果基本一致,模型組IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01); 黃芪湯干預(yù)下調(diào)了IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)(P<0.05,P<0.01),表明黃芪湯可阻礙高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞炎癥反應(yīng),結(jié)果見(jiàn)圖4。

注:與對(duì)照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖4 黃芪湯對(duì)足細(xì)胞中炎癥因子蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Huangqi Decoction on the protein expression of podocyte inflammatory cytokine

2.6 黃芪湯對(duì)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響

通過(guò)Western blot進(jìn)一步分析黃芪湯對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響，結(jié)果表明TLR4和p-NF-κB/NF-κB蛋白表達(dá)水平在高糖處理的足細(xì)胞中均顯著升高(P<0.01)，黃芪湯處理后，足細(xì)胞中TLR4和p-NF-κB/NF-κB蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.01),表明黃芪湯可抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活,結(jié)果見(jiàn)圖5。

注:與對(duì)照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖5 黃芪湯對(duì)足細(xì)胞中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Huangqi Decoction on the protein expression of TLR4 and NF-κB in podocyte

3 討論

黃芪湯具有廣泛的藥理活性,已被證明可通過(guò)改善多種病理變化延緩DN進(jìn)展。本團(tuán)隊(duì)之前通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜法(Liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)分析鑒定黃芪湯的主要活性成分[12]包括黃芪甲苷,落新婦苷、毛蕊花糖苷、甘草酸、五味子素、魯斯可皂苷元、梓醇、甘草苷?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,黃芪湯中活性成分可抑制細(xì)胞炎癥通路的激活[13-15],降低炎癥因子TNF-α、IL-6產(chǎn)生[16],增強(qiáng)細(xì)胞抗炎、抗氧化能力,改善細(xì)胞凋亡[16-19],減弱高糖引起的腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷[16,20],有效保護(hù)腎臟功能。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的重要組成部分,受到損傷后會(huì)發(fā)生一系列變化,從肥大、脫離、自噬到細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致蛋白尿形成,是DN發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)重要早期事件,因此足細(xì)胞數(shù)量和功能變化是進(jìn)行性DN的最強(qiáng)預(yù)測(cè)因子[21]。本團(tuán)隊(duì)前期在臨床工作中發(fā)現(xiàn)，黃芪湯明顯降低了DN Ⅲ期患者的蛋白尿水平[22],由此我們推測(cè)黃芪湯可能具有足細(xì)胞保護(hù)作用。細(xì)胞遷移是正常細(xì)胞的基本功能之一,是機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育的生理過(guò)程。足細(xì)胞遷移緩慢說(shuō)明足細(xì)胞黏附作用受損,足細(xì)胞黏附性下降導(dǎo)致足細(xì)胞大量丟失,足細(xì)胞數(shù)量減少。足細(xì)胞數(shù)量下降是腎小球?yàn)V過(guò)屏障結(jié)構(gòu)異常乃至產(chǎn)生蛋白尿的重要原因[23]。我們?cè)谧慵?xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),高糖刺激24 h后模型組的細(xì)胞劃痕愈合率明顯低于對(duì)照組,黃芪湯干預(yù)后各組劃痕愈合率較模型組明顯改善,證明黃芪湯能夠抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞遷移、黏附能力的改變,維持足細(xì)胞數(shù)量和功能的穩(wěn)定,改善高糖環(huán)境下足細(xì)胞損傷,保護(hù)腎小球?yàn)V過(guò)屏障,從而減少DN蛋白尿。

炎癥是DN發(fā)展重要的病理基礎(chǔ),炎性細(xì)胞浸潤(rùn)可促進(jìn)腎臟纖維化,加重腎組織病理?yè)p傷。DN腎組織炎癥狀態(tài)下,炎癥因子的分泌增多,免疫細(xì)胞被募集到腎組織中積累和浸潤(rùn),進(jìn)一步釋放促炎因子,從而加重炎癥并損害腎臟組織[24]。既往研究發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠腎臟中炎癥細(xì)胞因子mRNA表達(dá)顯著上調(diào),包括CCL2、CCL3、CCL8、CCL20、CCL24、CXCR1、CXCR5、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-11、TNF-α以及Spp1[25]。本研究通過(guò)qPCR檢測(cè)高糖環(huán)境下人足細(xì)胞中上述炎癥因子的表達(dá),與對(duì)照組相比,模型組中TNF-α、IL-6、CCL24的mRNA表達(dá)明顯增加,其他炎癥因子的表達(dá)無(wú)顯著差異,黃芪湯的干預(yù)明顯降低了高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)。趨化因子大致分為4個(gè)亞家族——CC、C、CXC和CX3C，CC趨化因子家族可反映DN中腎小管炎癥損傷的水平[26]。最近研究也表明，CCL24可以通過(guò)減輕足細(xì)胞炎癥來(lái)保護(hù)腎臟功能[27],CXCR家族CXCR1和CXCR5則參與誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷[26,28]。此外炎癥細(xì)胞因子不會(huì)單獨(dú)作用,而是相互調(diào)節(jié),因此本研究模型組其他炎癥因子表達(dá)無(wú)顯著差異,可能是由于細(xì)胞因子之間的相互作用沒(méi)有達(dá)到顯著的閾值。另一方面,DN病程相對(duì)較長(zhǎng),炎癥因子的表達(dá)或許與足細(xì)胞DN模型的高糖刺激時(shí)間相關(guān),此處尚不能排除刺激時(shí)間對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響。有研究顯示,蛋白尿水平的升高伴隨著炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)的增加[29],本團(tuán)隊(duì)前期臨床研究發(fā)現(xiàn),黃芪湯能減少DN患者尿微量白蛋白、24 h尿蛋白定量,降低尿白蛋白排泄率,有效降低DN患者血清中炎癥因子IL-6、TNF-α水平,改善腎單位內(nèi)環(huán)境,減輕高糖造成的腎功能損傷,延緩DN進(jìn)展[22]。本研究中,我們通過(guò)ELISA和Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證黃芪湯對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞炎癥反應(yīng)有抑制作用,證實(shí)黃芪湯具有足細(xì)胞保護(hù)作用。

眾所周知,TLR4/NF-κB信號(hào)通路是啟動(dòng)內(nèi)源性炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的經(jīng)典途徑,TNF-α和IL-6是TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活的產(chǎn)物[30]。TLR4是炎癥通路的上游因子,轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與炎癥反應(yīng)密切相關(guān),高糖刺激會(huì)顯著促進(jìn)TLR4的表達(dá)和激活,激活的TLR4在腎臟中誘導(dǎo)足細(xì)胞中NF-κB的活化,而促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-6的釋放,加重足細(xì)胞的炎癥損傷[31]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明,黃芪湯中多種成分具有調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的作用，如：黃芪有效成分黃芪多糖可通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路,抑制IL-6、TNF-α的表達(dá),改善CVB3誘導(dǎo)的心肌損傷和炎癥反應(yīng)[32];茯苓多糖可調(diào)節(jié)TLR4/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路,發(fā)揮抗氧化和抗凋亡的作用[33];地黃提取物梓醇可抑制TLR4/NF-κB通路，減弱脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[34];麥冬的多糖提取物具有抑制IκB激酶(IκB kinase,IKK)-NF-κB通路、改善胰腺β細(xì)胞炎癥、增加胰島素分泌的作用[35];五味子乙素能改善血管緊張素Ⅱ引起的慢性炎癥和氧化應(yīng)激,保護(hù)血管功能,也與抑制NF-κB的活化有關(guān)[36]。因此,我們猜測(cè)黃芪湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)經(jīng)典的TLR4/NF-κB信號(hào)通路的活性，抑制炎癥反應(yīng),發(fā)揮保護(hù)足細(xì)胞的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)黃芪湯抑制高糖誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活,從而改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞炎癥損傷。

綜上所述,本研究證明黃芪湯可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路活性改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞炎癥,減少足細(xì)胞損傷,延緩DN的進(jìn)展,為黃芪湯的臨床實(shí)踐提供了更多的參考數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)尚未涉及黃芪湯調(diào)節(jié)NF-κB表達(dá)的具體靶點(diǎn),后續(xù)研究將進(jìn)一步驗(yàn)證黃芪湯是否通過(guò)抑制IKK表達(dá)和NF-κB抑制劑(Inhibitor of NF-κB, IκB)磷酸化,從而抑制NF-κB的易位進(jìn)入細(xì)胞核和激活DN炎癥反應(yīng),改善足細(xì)胞損傷。