醒腦靜抑制Notch信號通路減輕七氟烷引起的成年小鼠認(rèn)知功能障礙

梁俊杰,韓姍姍,吳佳駿,柴高尚,趙鵬,張鄧新

(1.江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院,江蘇 無錫 214122;2.江南大學(xué)附屬無錫婦幼保健院,江蘇 無錫 214002)

七氟烷是臨床上最常用的吸入麻醉藥之一,具有刺激小、誘導(dǎo)快、可控性好等優(yōu)點[1]。但大量研究表明,七氟烷可引起術(shù)后認(rèn)知功能障礙(Postoperative cognitive dysfunction, POCD),在老年患者中尤為明顯。POCD是一種常見的術(shù)后并發(fā)癥,定義為麻醉和手術(shù)后產(chǎn)生的一種新的認(rèn)知障礙。POCD不僅增加其他并發(fā)癥的發(fā)生率,延長住院時間,而且嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2-3]。目前,七氟烷引起POCD的機制尚不明確,其通過激活神經(jīng)炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致POCD,是目前認(rèn)為可能的作用機制。

炎癥是許多病理過程的始動階段。海馬作為大腦學(xué)習(xí)和記憶的主要區(qū)域,海馬炎癥反應(yīng)將對認(rèn)知能力產(chǎn)生不利影響。研究表明,七氟烷通過多種機制激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥。如Shao等發(fā)現(xiàn)七氟烷可激活NLRP3/Caspase-1信號通路,導(dǎo)致炎性細胞因子分泌,誘發(fā)“炎性瀑布效應(yīng)”,引起神經(jīng)炎癥,損害認(rèn)知功能[4]。Dong等發(fā)現(xiàn)七氟烷通過下調(diào)海馬中的PPAR-γ活性,增加小膠質(zhì)細胞調(diào)節(jié)的神經(jīng)炎癥反應(yīng),從而導(dǎo)致認(rèn)知能力下降[5]。既往研究表明Notch信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6-9]。但近期研究表明Notch信號通路的異常激活與炎癥相關(guān),如過敏性氣道炎癥[10]、腎臟炎癥[11]。然而Notch信號通路是否參與七氟烷誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)炎癥仍不清楚。

神經(jīng)發(fā)生是指神經(jīng)干細胞通過增殖、遷移、分化、成熟等步驟后,成為成熟神經(jīng)元并與原有神經(jīng)元形成功能性突觸連接的過程[12],其主要發(fā)生在2個腦區(qū):海馬齒狀回(DG)的顆粒下層(SGZ)和側(cè)腦室室管膜下區(qū)(SVZ)[13]。海馬神經(jīng)發(fā)生在記憶形成中起著重要作用,并與突觸可塑性密切相關(guān)[14]。神經(jīng)發(fā)生的程度可以通過海馬DG中神經(jīng)前體細胞(NPCs)的數(shù)量來量化[15-17]。神經(jīng)炎癥與神經(jīng)發(fā)生密切相關(guān)。研究表明,神經(jīng)炎癥釋放過多的促炎細胞因子等炎癥分子,對神經(jīng)發(fā)生產(chǎn)生負(fù)面影響[18]。

醒腦靜注射液(XNJ)是臨床常用的腦保護藥物,研究表明其對腦缺血再灌注損傷和腦梗死有顯著作用[19-21]。然而,它是否對七氟烷誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥有影響尚未清楚。本研究旨在研究醒腦靜注射液減輕七氟烷引起認(rèn)知障礙的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與模型

SPF級雄性C57BL/6J小鼠36只,8～12周齡,購自常州卡文斯實驗動物有限公司,在無病原體環(huán)境中飼養(yǎng)。所有動物實驗均經(jīng)江南大學(xué)實驗動物倫理委員會審核通過(倫理審批號:JN.No20201230c1401231[379])。待動物適應(yīng)1周后,將36只小鼠隨機分為3組:對照組(Con)、七氟烷(Sev)和七氟烷+醒腦靜注射液(Sev+XNJ)組,每組12只。Sev+XNJ組小鼠于七氟烷麻醉前2 h腹腔注射醒腦靜(10 mL·kg-1,給藥劑量參照文獻[22]方法),然后吸入3%七氟烷6 h。Sev組小鼠腹腔注射等量生理鹽水后吸入3%七氟烷6 h。Con組小鼠除腹腔注射等量生理鹽水外,其余均不加處理。七氟烷吸入時間和劑量參照文獻[23]的方法。

1.2 主要試劑與儀器

七氟烷(批號：21050631)購自上海恒瑞醫(yī)藥有限公司。醒腦靜注射液(批號：210311)購自無錫濟民可信集團有限公司,BrdU粉末(貨號：B5002)購自Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司。兔抗Notch1抗體(貨號：Ab52627)、兔抗activated-Notch1 (NICD)抗體(貨號：Ab8925)、兔抗Hes1抗體(貨號：Ab71559)、兔抗BrdU抗體(貨號：Ab152095)、山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor?594)(貨號：Ab150080)和山羊抗鼠IgG H&L (FITC)(貨號：Ab6785)購自英國Abcam抗體公司。兔抗β-actin抗體(貨號：49381)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(貨號：L3012)購自美國Signalway抗體公司, 鼠抗Iba1抗體(貨號：GTX632426)購自美國GeneTex抗體公司。BCA蛋白檢測試劑盒(貨號：P0012S)、RIPA裂解緩沖液(貨號：P0013B)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(貨號：P0015L)購自上海碧云天生物科技有限公司。蛋白標(biāo)記物(貨號：WJ102)來自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司。高靈敏度ECL化學(xué)發(fā)光底物(貨號：AR1172)購自武漢博士德生物科技有限公司。SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒(貨號：BL522A)購自北京蘭杰柯科技有限公司。Hifair?Ⅲ 1stStander cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：11141ES60)和Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix (No Rox)(貨號：11201ES08)購自上海翌圣生物科技有限公司。所用引物由江蘇GENEWIZ生物技術(shù)有限公司合成。

R620-S1型動物全身麻醉機購于深圳市瑞沃德生物科技有限公司。WMT-100 Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)購自成都泰盟軟件有限公司。CM3050S全自動冰凍切片機購自德國徠卡生物有限公司。全自動正置熒光顯微鏡購自德國蔡司集團。LightCycler 480Ⅱ自動熒光定量PCR系統(tǒng)購自羅氏集團。Tanon-2500b化學(xué)發(fā)光成像儀購自上海天能科技有限公司。

1.3 BrdU標(biāo)記

5-溴-2'-脫氧尿苷(BrdU)粉劑溶于37 ℃生理鹽水中,在七氟烷麻醉前2 d進行腹腔注射,注射劑量為100 mg·kg-1,每日2次,連續(xù)3 d。

1.4 Morris水迷宮測試

利用Morris水迷宮檢測小鼠的認(rèn)知行為能力。Morris水迷宮系統(tǒng)由一個圓形水箱組成,水箱被平均分為4個象限,平臺位于其中一個象限并沒入水面以下1 cm。小鼠在接受七氟烷麻醉前5 d進行定向航行訓(xùn)練,每天4個象限依次進行訓(xùn)練,連續(xù)5 d。每次訓(xùn)練的最小時間間隔為15 min。每次訓(xùn)練過程中,小鼠依次被置于水迷宮的4個不同象限,允許其在60 s時間內(nèi)自由尋找水下隱藏平臺,第1次踏上平臺并在平臺超過10 s的時間稱之為逃避潛伏期(Escape latency),如其在60 s時間內(nèi)仍無法尋找到平臺,則人為引導(dǎo)其至平臺處并停留30 s以鞏固記憶。在第6天,小鼠在七氟烷或?qū)φ毡┞逗筮M行空間探索測試,此時撤去水下藏匿平臺,讓小鼠在60 s內(nèi)尋找原平臺位置,使用WMT-100 Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)記錄第1次找到原平臺位置的時間(即逃避潛伏期)以及原平臺穿越次數(shù)。

1.5 免疫熒光分析

將麻醉后的小鼠用生理鹽水及4%多聚甲醛心臟灌流處死后取出其大腦,置于4%多聚甲醛中固定24 h,然后在含20%蔗糖的磷酸鹽緩沖液(PBS)中放置2 d,然后轉(zhuǎn)至含30%蔗糖的PBS中放置3 d進行梯度脫水處理。脫水完畢后腦組織用冰凍切片包埋劑包埋,然后按25 μm厚度進行冰凍切片。將切片用含0.5% Triton X-100的PBS溶液滲透30 min以溶解磷脂膜,并在室溫下與封閉溶液(含5% BSA的PBS)孵育1 h。隨后切片與一抗(稀釋比為1∶200)在4 ℃環(huán)境中孵育過夜后,與熒光二抗(稀釋比為1∶200)在室溫下孵育2 h。然后在蔡司全自動正置熒光顯微鏡下觀察[24]。

1.6 qPCR反應(yīng)

將小鼠斷頸處死后在冰上快速取出海馬組織,用Trizol試劑提取總RNA,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的方法,將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在LightCycler 480上用定量擴增TNF-α、IL-6、IL-12p35和GAPDH的引物。GAPDH基因作為內(nèi)參。目的基因mRNA表達水平呈倍數(shù)變化,并與GAPDH水平進行標(biāo)準(zhǔn)化。引物參照本團隊前期研究[25]所設(shè)計,引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer Sequences

1.7 Western blot實驗

水迷宮空間探索試驗后處死小鼠?？焖偃〕瞿X組織樣本,在4 ℃環(huán)境下分離海馬。用RIPA裂解液勻漿裂解海馬組織,隨后在4 ℃,12 000 r·min-1條件下離心5 min取上清,用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。將樣品蛋白與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液充分混合并95 ℃加熱10 min，待冷卻至室溫后用10%的SDS-PAGE分離,隨后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上,與5% BSA室溫孵育1 h后,與Notch1抗體(稀釋比1∶500)、NICD抗體(稀釋比1∶500)、Hes1 抗體(稀釋比1∶500)和β-actin抗體(稀釋比1∶3 000)在4 ℃下孵育過夜,然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1 h。最后,利用Tanon-2500B化學(xué)發(fā)光成像儀檢測蛋白條帶，然后使用Image J軟件檢測條帶的灰度值并進行統(tǒng)計分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 醒腦靜注射液改善七氟烷誘導(dǎo)的小鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙

在第1～5天的定向航行訓(xùn)練中,各組在任何時間點的逃避潛伏期均無顯著差異(圖1A)。而空間探索試驗的統(tǒng)計分析顯示,3組間的逃逸潛伏期和平臺穿越時間存在顯著差異(P<0.05，P<0.01)。與Con組相比,七氟烷組的逃逸潛伏期顯著增加(P<0.01),但吸入七氟烷前腹腔注射醒腦靜,逃逸潛伏期顯著降低(P<0.05)(圖1B)。與Con組相比,七氟烷組的原平臺穿越次數(shù)也明顯減少(P<0.05，P<0.01);然而,與七氟烷組相比,Sev+XNJ組的平臺穿越次數(shù)顯著增加(P<0.05)(圖1C)。與Con組相比,七氟烷組游泳軌跡極其混亂,但Sev+XNJ組游泳軌跡則相對集中于原平臺位置附近(圖1D)。

注：A.第1～5天定向航行訓(xùn)練各組小鼠逃避潛伏期;B.第6天空間探索實驗各組小鼠逃避潛伏期;C.空間探索實驗各組小鼠平臺穿越次數(shù);與對照組相比;D.空間探索實驗各組小鼠典型游泳軌跡。與對照組相比,*P<0.05，**P<0.01;與Sev+XNJ組相比,

2.2 醒腦靜注射液對七氟烷引起的海馬炎癥反應(yīng)有抑制作用

小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫細胞,其激活狀態(tài)可反映炎癥水平。本研究采用小膠質(zhì)細胞的標(biāo)志物Iba-1來觀察小膠質(zhì)細胞的激活狀態(tài)。結(jié)果表明，與Con組相比,七氟烷組海馬小膠質(zhì)細胞顯著被激活,具體表現(xiàn)為小膠質(zhì)細胞的突起減少,胞體變圓。與Sev組相比,Sev+XNJ組小鼠海馬小膠質(zhì)細胞激活被抑制(圖2A)。隨后,通過qPCR技術(shù)檢測各組海馬的炎性細胞因子,結(jié)果表明，與Con組相比,Sev組的海馬M1型促炎細胞因子如TNF-α、IL-6和IL-12 p35 mRNA水平顯著上調(diào)(P<0.05，P<0.01)。與Sev組相比,Sev+XNJ組上述M1型促炎細胞因子mRNA水平下調(diào)(P<0.05),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2B～2D)。

2.3 醒腦靜注射液可緩解七氟烷誘導(dǎo)的神經(jīng)干細胞增殖功能障礙

為了檢測神經(jīng)干細胞在海馬中的增殖情況,使用核苷酸類似物BrdU標(biāo)記神經(jīng)干細胞。免疫熒光實驗結(jié)果顯示,七氟烷對海馬DG區(qū)顆粒細胞下層的神經(jīng)干細胞增殖有明顯的抑制作用,BrdU標(biāo)記的陽性細胞數(shù)顯著減少,而醒腦靜注射液能緩解七氟烷對神經(jīng)干細胞增殖的抑制效果,BrdU標(biāo)記的陽性細胞數(shù)增加(圖3A)。采用ImageJ軟件對各組的BrdU陽性細胞進行量化。結(jié)果顯示,七氟烷組DG區(qū)域BrdU陽性細胞數(shù)量明顯低于其他2組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)(圖3B)。

注：與Sev組比較，

注：比例尺=100 μm。與Sev組相比,

2.4 醒腦靜注射液可抑制七氟烷誘導(dǎo)的Notch/Hes1通路過度激活

為探討Notch信號通路在七氟烷誘導(dǎo)的術(shù)后認(rèn)知功能障礙中的作用,我們采用Western blot觀察各組Notch1、NICD和Hes1的表達情況。使用Image J軟件對Notch1、NICD和Hes1的灰度值進行分析來量化蛋白的相對表達量。結(jié)果顯示七氟烷組的Notch1、NICD和Hes1的蛋白相對表達量顯著高于對照組和七氟烷加醒腦靜組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)(圖4)。

注：與Con組相比,*P<0.05,**P<0.01;與Sev+XNJ組相比,

3 討論

本研究探討醒腦靜注射液能否通過調(diào)節(jié)Notch信號通路,減輕七氟烷所致成年小鼠認(rèn)知功能損害。正如預(yù)期的那樣,我們發(fā)現(xiàn)3%七氟烷暴露6 h可導(dǎo)致成年小鼠認(rèn)知功能障礙。免疫熒光結(jié)果顯示海馬小膠質(zhì)細胞被激活,神經(jīng)干細胞增殖受到抑制。qPCR和Western blot分析顯示,七氟烷可上調(diào)海馬組織中炎癥細胞因子mRNA水平及Notch信號通路相關(guān)蛋白Notch1、NICD和Hes1的表達水平。醒腦靜注射液預(yù)處理下調(diào)了海馬Notch1、NICD和Hes1蛋白的表達,炎癥細胞因子mRNA表達降低,抑制了小膠質(zhì)細胞的激活并緩解了七氟烷引起的神經(jīng)干細胞增殖障礙。Morris水迷宮測試是檢測認(rèn)知功能的經(jīng)典行為學(xué)實驗。在5 d的定向航行訓(xùn)練中,各組間逃逸潛伏期無顯著性差異,即空間探索試驗的差異可以認(rèn)為是由七氟烷引起的。我們的研究表明醒腦靜可以改善小鼠認(rèn)知功能。綜上所述,醒腦靜注射液通過調(diào)節(jié)Notch信號通路減輕七氟烷誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙。提示醒腦靜注射液預(yù)處理可能是預(yù)防七氟烷致成年小鼠術(shù)后認(rèn)知障礙的可行措施。

POCD是一種常見的術(shù)后并發(fā)癥,但其確切的發(fā)病機制尚不清楚。人們普遍認(rèn)為POCD可能是多因素的,這可能與年齡、教育水平、先前存在的心理健康狀況和并發(fā)癥[26]有關(guān)。近年來,麻醉與術(shù)后認(rèn)知功能障礙的關(guān)系已成為麻醉學(xué)者研究的重點。越來越多的動物研究表明,手術(shù)中廣泛使用的吸入性麻醉劑七氟烷可誘發(fā)POCD,特別是在老年小鼠中[27-29]。但亦有研究表明,七氟烷也可引起幼齡和成年小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙[23,30-32]。已有多種機制揭示了七氟烷誘導(dǎo)認(rèn)知障礙的機制,如神經(jīng)炎癥[33-35]、氧化應(yīng)激[36]、自噬[37]和鐵-葡萄糖代謝交叉功能障礙[38]。在眾多機制中,七氟烷引起神經(jīng)炎癥導(dǎo)致POCD是研究得最為廣泛的機制之一,但七氟烷是如何引起神經(jīng)炎癥的尚不清楚。

海馬DG中的神經(jīng)發(fā)生在海馬功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,神經(jīng)干細胞增殖分化為成熟神經(jīng)元,與現(xiàn)有的海馬回路形成突觸連接,并促進海馬依賴的學(xué)習(xí)和記憶過程[39]。成人神經(jīng)發(fā)生過程對病理條件高度敏感,越來越多的證據(jù)表明神經(jīng)發(fā)生功能障礙可能在阿爾茨海默病[40]和抑郁癥中發(fā)揮重要作用[41-42]。炎癥作為病理過程的初始階段,可引起一系列的級聯(lián)反應(yīng),進而損害包括神經(jīng)發(fā)生在內(nèi)的其他功能。Tang等發(fā)現(xiàn)海馬成纖維細胞生長因子2(調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞增殖和存活的關(guān)鍵分子)的蛋白表達受到神經(jīng)炎癥的抑制[43]。Osman等發(fā)現(xiàn)促炎小膠質(zhì)細胞負(fù)向調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞存活[44]。然而,七氟烷誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥如何影響神經(jīng)增殖功能仍需進一步研究。

Notch信號是通過細胞-細胞間的交流來實現(xiàn)的,其中一個細胞上的跨膜配體激活相鄰細胞上的跨膜受體。在ADAM金屬蛋白酶和γ-分泌酶復(fù)合物的幫助下,Notch受體被切割并釋放出Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD,Notch的活化片段)。然后,NICD易位到細胞核,與CSL(也稱為RBP-J)相互作用,調(diào)節(jié)下游基因如Hes家族成員的轉(zhuǎn)錄[45-46]。在生理條件下,Notch信號通路通過促進NSC增殖和抑制神經(jīng)分化來維持神經(jīng)系統(tǒng)自我更新。Notch信號通路由于具有促進細胞增殖的作用,在腫瘤發(fā)生發(fā)展領(lǐng)域得到了廣泛的研究。然而,最近的研究逐漸表明Notch信號通路也與炎癥密切相關(guān)。Qian等發(fā)現(xiàn)Notch信號通路的激活在脊髓損傷(SCI)后A1星形膠質(zhì)細胞分化中起重要作用[47]。同樣,Wu等發(fā)現(xiàn)Notch信號調(diào)節(jié)顳葉癲癇大鼠模型[48]中的小膠質(zhì)細胞激活和炎癥反應(yīng)。然而Notch信號通路是否調(diào)控七氟烷誘導(dǎo)的海馬炎癥尚不清楚。因此,我們的研究旨在確定Notch信號通路在七氟烷誘導(dǎo)的炎癥中的作用。研究結(jié)果表明七氟烷暴露后Notch信號通路過度激活,海馬小膠質(zhì)細胞激活增加,炎癥細胞因子mRNA表達上調(diào)。這些結(jié)果提示Notch信號通路可能是使小膠質(zhì)細胞極化至M1狀態(tài)的促炎信號分子。

醒腦靜是從傳統(tǒng)中藥安宮牛黃丸中提取的水溶性注射液,主要用于神經(jīng)外科患者的腦保護。部分動物研究發(fā)現(xiàn)醒腦靜注射液通過抗炎途徑對腦缺血/再灌注損傷具有保護作用[19,49]。然而,它是否在七氟烷引起的POCD中發(fā)揮作用仍不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)醒腦靜注射液可以通過減輕海馬神經(jīng)炎癥和神經(jīng)干細胞增殖功能障礙來改善七氟烷所致的認(rèn)知功能障礙，其機制可能與抑制七氟烷誘導(dǎo)的Notch信號通路過度激活有關(guān)。但醒腦靜作為一種中成藥,成分復(fù)雜,本研究未對其具體成分展開分析,后續(xù)研究應(yīng)探討何種單體成分在其中發(fā)揮具體作用。

綜上所述,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)醒腦靜注射液通過抑制Notch1/Hes1通路,減輕了七氟烷誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)炎癥和神經(jīng)干細胞增殖功能障礙,改善成年小鼠認(rèn)知功能障礙。因此,該注射液有望成為臨床預(yù)防七氟烷致POCD的一種新的治療方法。