套袋對海沃德獼猴桃果實品質(zhì)及葉綠素代謝的影響

陳 成，王 依，宋思言，楊 勇，萬春雁，閻永齊

(1 江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 句容 212400；2 西安市閻良區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，陜西 西安 710089)

獼猴桃為獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(ActinidiaLindl.)植物，是我國重要的本土果樹。獼猴桃于20世紀初開始人工馴化，是20世紀人工馴化最成功的果樹之一。獼猴桃果實酸甜爽口，香氣濃郁，富含維生素C、膳食纖維等多種營養(yǎng)成分，且具有低卡路里特征[1]，深受消費者喜愛。同時，果實色澤是果實品質(zhì)的重要指標之一，且是果實商品價值的重要組成部分，其變化通常因葉綠素、類胡蘿卜素、花青素等色素物質(zhì)成分的組成比例不同而致。獼猴桃屬有54種、21個變種，共計75個分類單元，且果肉顏色不盡相同[2]。就生產(chǎn)而言，栽培品種大致可以分為2類，一類是果肉黃色或果心紅色的中華獼猴桃，另一類是果肉綠色的美味獼猴桃[3]?，F(xiàn)階段，對中華獼猴桃果實品質(zhì)、果肉色澤的生理和分子層面研究較深[4-6]，而對綠肉獼猴桃相關(guān)研究較少。有研究表明，葉綠素存在于眾多植物器官包括未成熟的果實中，當果實成熟時，果肉中的葉綠素通常會被降解[7]。而海沃德獼猴桃為典型的綠肉獼猴桃品種，果實成熟后仍有大量葉綠素存留在果肉中。因此，探明海沃德獼猴桃果實葉綠素代謝機制，既是果實品質(zhì)改良的基礎(chǔ)，也對栽培技術(shù)改良和科學(xué)管理有重要意義。

套袋是世界公認的人工干預(yù)果實接受光照的一種有效技術(shù)措施，可以有效地改善果實色澤，現(xiàn)已在果樹生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。眾多研究表明，套袋可以提高果面光潔度，改善果實的外觀品質(zhì)和內(nèi)在品質(zhì)[8-9]。在獼猴桃果實研究方面，套袋處理對改善果實外觀品質(zhì)、降低農(nóng)藥污染和提高果實商品性等具有明顯作用[10-11]。本研究以海沃德獼猴桃為試材，采用外黃內(nèi)黑單層袋、外黃內(nèi)黑雙層袋、白色單層袋、黃色條紋單層袋4種類型果袋進行果實套袋處理，測定并分析不同處理獼猴桃果實外觀品質(zhì)、內(nèi)在品質(zhì)、糖含量、果皮與果肉色澤變化、果實葉綠素含量與葉綠素代謝相關(guān)基因的表達情況，以期為解析光照對獼猴桃果實品質(zhì)及葉綠素代謝機制的影響奠定基礎(chǔ)，并為江蘇丘陵地區(qū)獼猴桃產(chǎn)業(yè)升級和經(jīng)濟效益提升提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為樹齡4年的海沃德獼猴桃，定植于江蘇省鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院華陽園獼猴桃種植基地內(nèi)，其砧木為美味獼猴桃實生苗。株行距2.8 m×3.0 m，南北行走向，大棚架種植。于盛花期后30 d，用4種類型果袋進行果實套袋處理，具體設(shè)計為：外黃內(nèi)黑單層袋(處理A)、外黃內(nèi)黑雙層袋(處理B)、白色單層袋(處理C)、黃色條紋單層袋(處理D)，每種果袋隨機套300個果實，以不套袋作為對照(CK)。于果實成熟后收獲，立即測定相關(guān)指標并在液氮保護下研磨，-80 ℃儲存。

1.2 試驗方法

1.2.1 獼猴桃果實外觀品質(zhì)測定 于果實采摘后用游標卡尺測量果實縱徑、橫徑及側(cè)徑；用電子天平稱量果實單果質(zhì)量。

1.2.2 獼猴桃果實內(nèi)在品質(zhì)測定 于果實達可食狀態(tài)時，測定果實品質(zhì)。果實可溶性固形物含量、總酸含量及固酸比使用手持式糖酸一體機(ATAGO，PAL-BX/ACID 8，日本)測定，果實干物質(zhì)含量用烘干法測定，結(jié)果均以各指標的質(zhì)量分數(shù)表示；果實硬度使用數(shù)顯式水果硬度計(GY-4，浙江托普)測定。

1.2.3 獼猴桃果實糖含量測定 果實蔗糖、果糖及葡萄糖含量參照Chen等[12]的方法，利用氣質(zhì)聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)技術(shù)測定。

1.2.4 獼猴桃果皮和果肉色澤指標測定 使用可攜式色差計(柯尼卡美能達，CR-400，日本)D65光源測定果皮及果實橫切面果肉(圖1)的L值(光澤明亮度)、a值(紅綠色差指標)、b值(黃藍色差指標)，以白板校正。每個處理測定5個果實，重復(fù)3次取平均值。根據(jù)a、b值計算綜合色差指標色澤飽和度(C*)、色澤比(h)、色度角(h*)，其中C*=(a2+b2)1/2，h=a/b，h*=arc[tan(b/a)]。

圖1 不同套袋處理海沃德果實果皮(Ⅰ)和果肉橫切面(Ⅱ)

1.2.5 獼猴桃果實葉綠素含量測定 果實葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量使用葉綠素(Chlorophyll)檢測試劑盒法(微板法)(TP1051，北京雷根)測定。

1.2.6 葉綠素代謝相關(guān)基因的實時熒光定量PCR 從TAIR網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org/)下載擬南芥葉綠素合成和降解相關(guān)基因的蛋白序列，與獼猴桃本地蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http://kiwifruitgenome.org/organism/5)進行比對，獲得獼猴桃葉綠素合成和降解同源基因(表1)。

表1 獼猴桃葉綠素合成和降解的相關(guān)基因信息

使用柱式植物總RNA抽提純化試劑盒(Sangon Biotech)提取獼猴桃果實RNA，采用Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)第一鏈合成試劑盒(翌圣生物科技，上海)反轉(zhuǎn)錄RNA獲得cDNA,用于qRT-PCR。根據(jù)熒光定量引物設(shè)計原則，使用PrimerQuest Tool(http://sg.idtdna.com/Primerquest/Home/Index)設(shè)計引物，優(yōu)先選擇靠近基因3′端的引物(表2)，以EF1α為內(nèi)參基因。使用Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox Plus)試劑盒(翌圣生物科技，上海)進行熒光定量檢測，定量儀器為AB-7500 (Applied biosystems 7500)。實時熒光定量條件為：預(yù)變性溫度95 ℃，時間5 min；變性溫度95 ℃，時間10 s，退火/延伸溫度60 ℃，時間30 s，共計40個循環(huán)。熔解曲線條件為儀器默認值，使用2-ΔΔCt法對表達量進行分析[13-14]。

表2 獼猴桃葉綠素代謝相關(guān)基因的實時熒光定量PCR擴增引物及其序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)整理，用SPSS 16.0分析軟件進行統(tǒng)計和相關(guān)性分析，用one-way ANOVA方法對每個變量進行Turkey檢驗(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 套袋對獼猴桃果實品質(zhì)的影響

由表3可知，不同套袋處理對海沃德獼猴桃果實縱徑、橫徑、側(cè)徑及單果質(zhì)量的影響均不顯著。處理A、B果實縱徑及單果質(zhì)量較其他處理小，處理C果實縱徑及單果質(zhì)量最大，處理D果實橫徑最大，CK處理果實側(cè)徑最大。

表3 不同套袋處理對海沃德果實外觀品質(zhì)的影響

由表4可知，不同套袋處理對海沃德獼猴桃果實可溶性固形物含量的影響均不顯著，果實的可溶性固形物含量以CK最高，達16.28%，以處理C最低，僅有15.43%。果實總酸含量以處理D最低，僅有0.28%，顯著低于處理C和CK。果實固酸比以處理D最高，達57.29，顯著高于處理C和CK。果實硬度以處理C最高，達1.68 kg/cm2，顯著高于其他處理，其余各處理果實硬度均在1 kg/cm2以下。不同套袋處理對海沃德獼猴桃果實干物質(zhì)含量的影響均不顯著，以處理D果實的干物質(zhì)含量最低，僅有17.44%。

由圖2可知，套袋處理可以顯著降低果實蔗糖含量，A、B、C、D 4個處理分別較CK降低了63.28%，36.85%，66.50%和51.52%。果實果糖含量以處理A最低，僅有86.42 mg/g，顯著低于處理B和CK；以處理B最高，達105.14 mg/g，顯著高于處理A和D。果實葡萄糖含量以處理A最低，僅有124.37 mg/g，顯著低于處理B、C和CK；以處理B最高，達147.20 mg/g，顯著高于處理A和D。

圖柱上標不同小寫字母表示經(jīng)Turkey多重比較差異顯著(P<0.05),下同

2.2 套袋對獼猴桃果實色澤的影響

不同套袋處理海沃德果皮及果肉色素指標的變化情況如圖3所示。

圖3 不同套袋處理對海沃德果皮及果肉色素指標的影響

由圖3可知，就果皮而言，L值以處理B最高，顯著高于處理C和CK。a值以處理B最高，顯著高于處理C、D和CK；以處理C最低，僅有8.79，顯著低于處理A和B。b值以處理B最高，達24.69，顯著高于處理C、D和CK；以CK最低，僅有19.81，顯著低于其他處理。套袋處理對C*值的影響與b值較為一致，以處理B最高，顯著高于處理C、D和CK；以CK最低，顯著低于處理A、B和D。h值以處理C最低，僅有0.40，顯著低于處理A、B和CK；以CK最高，達0.49，顯著高于處理B、C和D。h*值以處理C最高，達68.28，顯著高于處理A、B和CK。就果肉而言，套袋處理對L值的影響與果皮較為一致，即處理A、B的L值顯著高于處理C和CK；套袋處理對果肉a和h值的影響較為一致，處理A、B的a和h值為正值，處理C、D、CK的a和h值均為負值；套袋處理對果肉b和C*值的影響較為一致，處理A、B、D的b值和C*值均顯著低于處理C和CK；與C*值類似，處理A、B、D的h*值顯著低于處理C和CK。

2.3 套袋對獼猴桃果實葉綠素含量的影響

由圖4可知，獼猴桃果實葉綠素a含量以CK處理最高，達4.48 mg/g，顯著高于其他處理；以處理B最低，其與處理A差異不顯著，但顯著低于其他處理，較CK降低了93.20%。果實葉綠素b含量以CK處理最高，其與處理C差異不顯著，但顯著高于處理A、B和D；以處理B最低，僅有0.27 mg/g，顯著低于其他處理，較CK降低了88.57%。果實總?cè)~綠素含量以CK處理最高，達6.82 mg/g，顯著高于其他處理；以處理B最低，僅有0.57 mg/g，顯著低于其他處理，較CK降低了91.60%。

圖4 不同套袋處理對海沃德果實葉綠素含量的影響

2.5 套袋對獼猴桃果實葉綠素代謝相關(guān)基因表達的影響

為了進一步研究套袋對果實顏色變化影響的相關(guān)機制，采用實時熒光定量PCR分析海沃德獼猴桃果實葉綠素合成和降解途徑關(guān)鍵基因的表達，結(jié)果見圖5和6。

圖5 不同套袋處理對海沃德果實葉綠素合成基因相對表達量的影響

由圖5可知，果實葉綠素合成基因AdCAO的表達豐度以處理C最低，且顯著低于其他處理。AdRBCS1和AdRBCS2的表達豐度均以處理C最高，且顯著高于其他處理。AdGLUTR1、AdGLU-TR2、AdGLUTR3的表達豐度均以處理D最高，其中處理DAdGLUTR1、AdGLUTR3的表達豐度顯著高于其他處理，AdGLUTR2、AdGLUTR3的表達豐度均以處理C最低，且顯著低于其他處理。

由圖6可知，果實葉綠素降解基因AdCBR1的表達豐度以處理D最高，且顯著高于其他處理，而其他處理之間AdCBR1表達豐度差異不顯著。AdCBR2基因的表達豐度也以處理D最高，雖顯著高于處理C，但與其他處理差異不顯著。AdCBR3的表達豐度以處理C最低，且顯著低于其他處理，而其他處理之間AdCBR3表達豐度差異不顯著。AdPAO的表達豐度以處理D最高，顯著高于處理A、B、C，但與CK差異不顯著。AdSGR1的表達豐度以處理C最高，且顯著高于其他處理。AdSGR2的表達豐度以CK處理最高，顯著高于處理B、C、D，但與處理A差異不顯著。AdPPH1、AdPPH2、AdPPH3的表達豐度均以處理D最高，其中Ad-PPH1、AdPPH3的表達豐度顯著高于除CK外的其他處理，而AdPPH2的表達豐度顯著高于其他所有處理。

圖6 不同套袋處理對海沃德果實葉綠素降解基因相對表達量的影響

3 討論與結(jié)論

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展及居民生活水平的提高，消費者更加看重果品優(yōu)質(zhì)、綠色、安全等特征，果實套袋是果樹優(yōu)質(zhì)高效安全生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，并在果樹栽培中大面積推廣應(yīng)用[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同套袋處理對海沃德獼猴桃果實縱徑、橫徑、側(cè)徑及單果質(zhì)量的影響并不顯著，說明套袋處理并未顯著降低果實大小及單果質(zhì)量，在對蘋果[18]、梨[19]、毛花獼猴桃[20]等的相關(guān)研究中也得到了類似的結(jié)論。本研究還表明，不同套袋處理對海沃德獼猴桃果實可溶性固形物含量及干物質(zhì)含量無顯著影響；韓飛等[21]的研究表明，套袋處理可以促進‘金艷’獼猴桃提前成熟，但不同套袋處理對‘金艷’獼猴桃軟熟時的可溶性固形物含量影響不同；而對‘紅陽’獼猴桃而言，有研究表明，套袋處理顯著降低了‘紅陽’獼猴桃果實的可溶性固形物含量[22]；說明套袋處理對不同品種獼猴桃果實品質(zhì)的影響程度不同。果實中糖的種類及其比例直接關(guān)系到果實的甜度和風(fēng)味，本研究測定不同套袋處理海沃德果實的蔗糖、果糖及葡萄糖含量，發(fā)現(xiàn)不同套袋處理對獼猴桃果實蔗糖含量的影響較大，CK處理果實的蔗糖含量顯著高于其他套袋處理，這與常曉曉等[23]報道的有機肥+套袋處理蘋果桃果實蔗糖含量顯著低于有機肥處理的結(jié)果相符。本研究表明，處理B果實的蔗糖含量顯著高于處理A、C和D，果糖和葡萄糖含量顯著高于A和D，由此可知，雙層袋處理較單層袋更有助于果實各類糖分的積累。

套袋處理后，果實表面可以避免陽光直射造成灼傷和果面顏色不均勻，果實外觀色澤鮮艷。在本研究中，套袋處理對獼猴桃果皮及果肉色澤均有很大影響。在色澤參數(shù)測定中，處理A、B、D果實的L值較高，即果面亮度高，而處理D和CK則果面暗淡。處理C、D和CK果肉的a值和h值為負值，果肉顏色表現(xiàn)為綠色，且處理C和CK果實a值和h值的絕對值大，果肉較處理D更綠。處理C和CK果肉的b值和C*值顯著高于其他處理，說明白色單層袋和不套袋處理的果肉顏色更加鮮明。葉綠素和類胡蘿卜素均是果實色澤組成的重要成分，在辣椒[24]、胡蘿卜[25]及甜橙[26]中，果實變黃是由類胡蘿卜素含量增加引起的。但是，在獼猴桃果實中，有研究認為，中華獼猴桃果實成熟后變黃是由于果實葉綠素的消失，而不是果實類胡蘿卜素含量增加所致[27]。因此，本試驗重點研究了套袋對獼猴桃果實葉綠素含量的影響，結(jié)果表明，處理C和CK果實的葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量均顯著高于其他處理，說明與白色單層袋和不套袋處理相比，套深顏色袋和雙層套袋處理均能顯著降低果實的葉綠素含量。

果實葉綠素含量由其生物合成和降解之間的平衡決定，并且受遺傳和環(huán)境的調(diào)控[28]。在本研究中，CK果實中AdCAO的表達豐度顯著高于其他處理，暗示套袋處理使得其生物合成途徑受到抑制[7]。而處理C果實中AdRBCS1的表達豐度顯著高于其他處理，可能暗示白色單層袋處理有利于AdRBCS1表達量的提高。PPH蛋白為葉綠素降解代謝的關(guān)鍵酶[29]。有研究表明，綠肉獼猴桃和黃肉獼猴桃果實中，葉綠素降解基因PPH的表達模式相似，表明美味獼猴桃和中華獼猴桃果肉色澤的差異并不是PPH表達差異導(dǎo)致的[7]。在本研究中，處理D果實中AdPPH1、AdPPH2及AdPPH3的表達豐度均最高，其中，處理D 的AdPPH1表達豐度顯著高于處理A、B及C，AdPPH2的表達豐度顯著高于其他處理，表明黃色條紋單層袋處理有利于AdPPH表達量的提高，尤其是AdPPH2可能參與了葉綠素降解過程。這些葉綠素合成相關(guān)基因表達豐度的降低及降解相關(guān)基因表達豐度的提高，可能是導(dǎo)致套袋果實葉綠素降解的主要原因。

綜上所述，套袋處理對海沃德獼猴桃果實大小、單果質(zhì)量、可溶性固形物含量、干物質(zhì)含量等果實品質(zhì)指標的影響并不顯著；果實蔗糖含量顯著降低，從而改變了果實糖組分所占比例；果皮及果肉顏色明顯變化，葉綠素含量降低；同時套袋處理導(dǎo)致果實葉綠素合成相關(guān)基因AdCAO表達豐度顯著下調(diào)，黃色條紋單層袋處理導(dǎo)致降解相關(guān)基因AdCBR1、AdPPH2表達豐度顯著上調(diào)。