黑木相思的組培快繁試驗(yàn)研究

容世清，羅建華，李天卓，曾少玲，薛晶晶，全吉文

湛江市林業(yè)科學(xué)研究所，廣東湛江 524037

黑木相思（Acacia melanoxylon R.Br）是含羞草科金合歡屬的常綠喬木，原產(chǎn)澳大利亞，中國(guó)閩、粵、桂、瓊四省區(qū)有種植栽培，具有強(qiáng)陽(yáng)性、耐干旱、耐瘠薄等特性，且能耐-6℃的低溫。黑木相思有根瘤固N(yùn) 功能，凋落物豐富，改土性能好，是四旁綠化和荒山造林的良好樹(shù)種[1]。因其木材耐腐、木紋美麗，且聲學(xué)性能優(yōu)異，目前有加大栽培種植的趨勢(shì)。有關(guān)黑木相思的組培試驗(yàn)研究，黃烈健、王鴻等以無(wú)菌苗之葉片、葉柄、莖段為材料，在脫分化產(chǎn)生愈傷組織的基礎(chǔ)上，再分化產(chǎn)生不定芽[2]；裘珍飛、曾炳山等人研究了不同激素組合的黑木相思的增殖效應(yīng)，以不定根發(fā)生效應(yīng)的比較，認(rèn)為6BA 的濃度在0.5mgL-1，增殖效應(yīng)最佳[3]，而孫雪陽(yáng)、呂華麗等的研究認(rèn)為IBA 為理想的生根誘導(dǎo)劑，最佳作用濃度為0.5mgL-1[4]，該文為黑木相思組培工作的總結(jié)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2020 年在湛江市林業(yè)科學(xué)研究所引種栽培的黑木相思群體中選取正常生長(zhǎng)的表形良好的健壯植株，取其半木質(zhì)化萌芽條。

1.2 試驗(yàn)方法

在晴好天氣條件下，選取生長(zhǎng)旺盛的植株，用小剪刀剪取其帶灰白色的小枝條，帶回實(shí)驗(yàn)室，先用經(jīng)消毒后的無(wú)菌清水漂洗其表面附著的灰尖，然后在超凈臺(tái)上用75%的酒精快速處理3s，再用0.1%的升汞處理5min～10min，最后分別用4 瓶無(wú)菌水漂洗，去掉其表面的殘留升汞藥液，接著用23#刀片分段切開(kāi)，每段留2 個(gè)腋芽，每瓶培養(yǎng)基單獨(dú)接種一段，兩周后檢查統(tǒng)計(jì)外植體的污染情況和生理反應(yīng)狀況。把污染帶菌的清理，留下成功脫菌的部分繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，培養(yǎng)繼代次數(shù)增加，潛伏的腋芽逐漸萌發(fā)，初始時(shí)為單個(gè)芽，逐漸形成多個(gè)芽集成的叢生結(jié)構(gòu)，并伴有相思類特有的羽狀復(fù)葉的發(fā)生。待有一定數(shù)量時(shí)，把繼代增殖培養(yǎng)階段的不定芽單個(gè)分切，接入不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基，促進(jìn)其根系的發(fā)生與形成，構(gòu)建一個(gè)根基葉全部齊全的完整小植株，最后煉苗移栽。

1.3 培養(yǎng)基

以MS 為基本培養(yǎng)基，根據(jù)需要適當(dāng)調(diào)整其大量元素的配比，稱為改良MS 培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，蔗糖30gL-1、卡拉膠5.5gL-1固化，pH5.8，經(jīng)蒸汽121℃滅菌20min 后備用。

1.4 培養(yǎng)環(huán)境

所有無(wú)菌材料在培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，以自然陽(yáng)光的光源，可根據(jù)光照強(qiáng)度變化而調(diào)節(jié)其直射光與散射光，光照強(qiáng)度在2000Lux～4000Lux，氣溫26℃。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

有效率=正常不帶菌的外植體/接種數(shù)×100%

褐化率=褐化的外植體/接種數(shù)×100%

生根率=生根數(shù)/接種數(shù)×100%

移栽成活率=成活株數(shù)/移栽總數(shù)×100%

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 不同升汞處理時(shí)間對(duì)外植體有效率的影響

外植體的成功植入是培養(yǎng)工作的起點(diǎn)。試驗(yàn)中，使用升汞藥液消毒為主要技術(shù)措施，該實(shí)驗(yàn)設(shè)置了5min、10min、15min 3 個(gè)處理時(shí)間。

從表1 可以看出，升汞處理時(shí)間低于5min，有效率偏低，10min 時(shí)有效率接近一半，但同時(shí)伴帶藥害，而15min 時(shí)莖段受害嚴(yán)重。適宜的處理時(shí)間應(yīng)是5min～10min 范圍內(nèi)。另外，木質(zhì)化程度不同的小枝莖段對(duì)升汞藥液的反應(yīng)差異明顯，幼嫩沒(méi)有充分木質(zhì)化的莖段不耐藥，緩沖耐受能力差，極容易失活，而偏老的小莖段枝，雖然耐受能力強(qiáng)但再生能力差，難以誘發(fā)新的腋芽長(zhǎng)出，半木質(zhì)化的小莖段是理想的外體植材料。

表1 不同升汞（0.1%）處理時(shí)間的有效性比較Tab.1 Compare the Processing Time to the Efficiency of Different Mercury Bichloride

2.2 單芽的萌發(fā)與叢生芽的形成

莖段外植體在初代培養(yǎng)基上經(jīng)20d～30d 的培養(yǎng)，其潛伏腋芽逐漸萌發(fā)形成單芽（見(jiàn)圖1-a），誘導(dǎo)萌芽比例見(jiàn)表2。

表2 莖段初代培養(yǎng)的誘導(dǎo)率Tab.2 The Inductivity of Primary Culture of Stem

從表2 看出，有效的外植體萌發(fā)率相當(dāng)高，平均為94.4%，幾乎全部誘導(dǎo)萌發(fā)。說(shuō)明黑木相思的莖段的初代誘導(dǎo)在培養(yǎng)基適合的條件下，難度已大大下降。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，繼代次數(shù)的增加，其葉狀柄的頂端逐漸有羽狀復(fù)葉的形成，并逐漸增多，原來(lái)明顯的葉狀柄完全消失。為了尋找最適合的6BA 增殖效應(yīng)，設(shè)立了0.2mgL-1、0.4mgL-1、0.6mgL-13 個(gè)濃度范圍的對(duì)比試驗(yàn)，見(jiàn)表3。

表3 不同6BA 濃度對(duì)叢生芽增殖的影響差異Tab.3 The Difference of Effects of Cluster Bud Proliferation with Different 6BA Concentration

從表3 看出，在6BA 在0.2mgL-1～0.6mgL-1的范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，增殖效應(yīng)也逐漸增加，適宜的濃度應(yīng)在0.4mgL-1左右。過(guò)低或過(guò)高的濃度均不利于叢芽的增殖和形態(tài)的恢復(fù)。這一結(jié)果與他人的0.1mgL-1～0.7mgL-1的6BA 濃度，較為相符。

從表4 看出，在6BA 0.3mgL-1的水平時(shí)，隨著NAA 濃度的增加，生長(zhǎng)速度開(kāi)始減緩，說(shuō)明NAA 在增殖階段上有延緩生長(zhǎng)的作用，有利于細(xì)胞液濃度的增加，細(xì)胞壁的增厚，硬度增強(qiáng)，進(jìn)一步木質(zhì)化，從生長(zhǎng)速度看，濃度以不超過(guò)0.1 mgL-1為宜。這與裘珍飛等的研究結(jié)果相似，過(guò)高濃度的生長(zhǎng)素對(duì)增殖效應(yīng)有抑制作用。

表4 6BA 與NAA 組合配比對(duì)叢生芽增殖的影響差異Tab.4 The Difference of Effects of Cluster Bud Proliferation with the Combination Ratio of 6BA and NAA

2.3 繼代培養(yǎng)過(guò)程中形態(tài)特征的變化

黑木相思在不斷地繼代培養(yǎng)過(guò)程中，在自然環(huán)境下極少見(jiàn)的羽狀復(fù)葉逐漸恢復(fù)并且數(shù)量增加，到葉狀柄完全消失，代之而起的是羽狀復(fù)葉完全恢復(fù)，這一特征，可作為組織恢復(fù)幼態(tài)化的典型形態(tài)特征(見(jiàn)圖1-b)。

圖1 (1-a：外植體誘導(dǎo)萌發(fā)；1-b：叢生芽繼代培養(yǎng)；1-c：不定根誘導(dǎo)植株；1-d：移栽后植株)Fig.1 (1-a：Explants Induced Germination；1-b：Subculture of Clustered Buds；1-c：Plant Induction by Adventitious Roots；1-d：Plant after Transplanting)

2.4 不同IBA 濃度對(duì)生根率的影響

將在繼代增殖培養(yǎng)過(guò)程中的粗壯有效的單芽切下，轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基，促使不定根的發(fā)生，從而形成完整的小植株。該研究試驗(yàn)了不同濃度范圍的IBA 對(duì)不定根發(fā)生的影響（見(jiàn)圖1-c）。

從表5 看出，在試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，IBA 能有效地誘導(dǎo)不定根的發(fā)生，濃度范圍應(yīng)在0.6mgL-1～1.2 mgL-1之間，根系發(fā)達(dá)，每株有2 條～5 條根，色白，活力足。

表5 不同IBA 濃度對(duì)生根率的影響Tab.5 The Impact of Rooting Percentage of Different IBA Concentration

2.5 煉苗與移栽

將剛出根的瓶苗從培養(yǎng)室移出煉苗棚里，曬煉15d～20d，瓶苗植株逐漸老熟，充分木質(zhì)化后再用清水小心洗出直接移栽入純黃心土或谷殼+泥炭的輕基質(zhì)段中，成活率90%以上，而且穩(wěn)定（見(jiàn)圖1-d）。

3 結(jié)論與討論

（1）該試驗(yàn)結(jié)果表明黑木相思的繼代增殖培養(yǎng)，其適宜培養(yǎng)基為MS+6BA0.3+NAA0.05 ～0.1+ 糖30gL-1+卡拉膠5.5gL-1；適宜的生根培養(yǎng)基為0.5MS+IBA0.6～1.2mgL-1+糖15gL-1+卡拉膠7gL-1。經(jīng)多批次實(shí)踐，穩(wěn)定性良好。這個(gè)結(jié)果與裘珍飛、曾炳山等人的研究結(jié)論基本相符。小幅度偏差可能是與試驗(yàn)材料（品種、無(wú)性系）不同有關(guān)。

（2）黑木相思在不斷重復(fù)的繼代培養(yǎng)過(guò)程中，羽狀復(fù)葉的完全恢復(fù)，可視為材料已得到充分的幻態(tài)化的標(biāo)志。這一特征與其種子萌發(fā)初期的形態(tài)特征完全一致，區(qū)別只在于種子萌發(fā)的是胚根，而組培誘導(dǎo)產(chǎn)生的是不定根，莖、葉完全一致。

（3）該試驗(yàn)由腋芽起源到叢生芽的分化，避免經(jīng)過(guò)脫分化產(chǎn)生中間環(huán)節(jié)的愈傷組織，其再生植株的遺傳穩(wěn)定性是可靠的、安全的。

（4）黑木相思在冬季月平均最低溫的1～2 月份的極端天氣條件下，往往不定根發(fā)生效果比較差，煉苗效果差，植株弱。在具體生產(chǎn)中注意避開(kāi)這個(gè)時(shí)段，靈活安排調(diào)整計(jì)劃。