養(yǎng)陰清肺口服液對大鼠放射性肺損傷的保護作用

方選，劉鵬，王曉雯

（1.青島市食品藥品檢驗研究院安評中心，山東 青島 266071；2.青島市海慈醫(yī)療集團腫瘤科，山東 青島 266033）

放射性肺損傷是胸部放療最常見的并發(fā)癥[1]，嚴重影響了患者的生存質(zhì)量及放療效果[2]。目前放射性肺損傷的治療主要以糖皮質(zhì)激素為主，但療效不佳，長期使用不良反應(yīng)嚴重。因此尋求一種有效且毒副作用小的理想藥物是當今研究熱點。養(yǎng)陰清肺口服液的主要成分是地黃、川貝母、麥冬、白芍、玄參、薄荷、牡丹皮、甘草，具有清熱潤肺、散結(jié)消癰、消炎抗菌、提高免疫力等功效。本研究通過建立大鼠放射性肺損傷模型，觀察養(yǎng)陰清肺口服液對放射性肺損傷的保護作用及其機理，為臨床治療提供可靠的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

電子直線加速器（美國瓦里安公司，21EX）；酶 標 儀（Bio-Rad 公 司，xMark）；Bio Rad 電 泳儀及電泳槽（北京東方恒偉科技開發(fā)公司，DY-6D）；病理圖文報告系統(tǒng)（江蘇捷達科技發(fā)展有限公司，JD-801）；流式細胞儀（美國BD 公司，BD FACSAria Ⅱ）。

1.2 試藥

養(yǎng)陰清肺口服液（呼倫貝爾松鹿制藥有限公司，批號：20190506）；地塞米松片（廣東華南藥業(yè)集團有限公司，批號：H44024469）；大鼠血清IL-1、TNF-α、TGF-β1酶聯(lián)免疫試劑盒（批號：138429035、138429035、137181017，均購自eBioscience 公司）；蛋白marker（北京索萊寶公司，批號：20200623）；TNF-α 抗體（武漢博士德公司，批號：BST16458763）；TGF-β1（武漢博士德公司，批號：BST17094185）；FITC anti-Rat CD3（批號：553682），APC anti-Rat CD4（批號：564835），RPE anti-Rat CD8（批號：554763）均購自BD 公司。

1.3 動物

SPF 級雄性SD 大鼠60 只，體重160～180 g，購于青島市實驗動物和動物實驗中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2014 0001，實驗動物使用許可證號：SYXK（魯）2014 0002。本研究經(jīng)青島市食品藥品檢驗研究院實驗動物福利倫理委員會批準，編號F2019001。

1.4 分組、造模、給藥

60 只大鼠按體重分為空白組、模型組、地塞米松組和養(yǎng)陰清肺口服液低、中、高劑量組，每組10 只。除空白組外，其余大鼠均用6MV-X 線全胸單次照射，總劑量20 Gy[3]。參考《藥理實驗方法學》第4 版人與大鼠等效劑量折算法[4]，養(yǎng)陰清肺口服液低、中、高劑量組大鼠用藥分別為人每日用量的2.5 倍、5 倍、10 倍，成人（60 kg）每日用量為0.2 g/kg，養(yǎng)陰清肺口服液低、中、高劑量組大鼠每日給藥量分別為0.5、1、2 g/kg。地塞米松組為0.5 mg/kg，按10 ml/kg 體重灌胃。空白組及模型組同時給予等量生理鹽水灌胃。各組均于照射后第1 天開始灌胃，每日1 次，連續(xù)給藥8 周。

1.5 觀察指標

①比較血清IL-1、TNF-α、TGF-β1水平：采血后3 000 r/min 離心15 min，取血清用ELISA 法檢測IL-1、TNF-α、TGF-β1水平。②比較肺組織TNF-α、TGF-β1蛋白表達：采用Western blot 法，取肺組織剪碎加入RIPA 裂解液，冰浴中電動勻漿器勻漿20 s，4 ℃ 12 000×g 離心15 min，收集上清液用BCA 法測定上清液蛋白含量。取等量蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入1 ∶400 稀釋的一抗，4 ℃過夜，再加入用雜交液稀釋的二抗（1 ∶1 000），室溫1 h，ECL 染色，用Quantity One 軟件進行半定量分析。③比較外周血T 淋巴細胞亞群：采血后肝素抗凝，以細胞分離液分離淋巴細胞，用流式細胞儀檢 測CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+各 淋 巴細胞亞群水平。④肺組織病理變化：摘取右肺中葉，以10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片，經(jīng)HE 染色后光鏡下觀察肺組織病理改變。

1.6 統(tǒng)計方法

用SPSS 22.0 軟件進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料用（±s）表示，組間比較均采用單因素方差分析。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清中IL-1、TNF-α、TGF-β1 水平比較

與空白組比較，模型組血清IL-1、TNF-α、TGF-β1水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松組、養(yǎng)陰清肺口服液中、高劑量組血清IL-1、TNF-α、TGF-β1水平均顯著降低（P＜0.01）；與地塞米松組比較，養(yǎng)陰清肺口服液高劑量組血清TNF-α、TGF-β1降低（P＜0.05），見表1。

表1 大鼠血清IL-1、TNF-α、TGF-β1 的含量[（±s），pg/ml]

表1 大鼠血清IL-1、TNF-α、TGF-β1 的含量[（±s），pg/ml]

注：與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與地塞米松組比較，cP＜0.05

組別 例數(shù) IL-1 TNF-α TGF-β1空白組 10 65.34±5.45 381.51±59.23 401.32±29.33模型組 10 150.92±8.24a 863.43±66.01a 915.21±56.74a地塞米松組 10 85.84±6.68b 570.72±54.75b 674.38±55.72b養(yǎng)陰清肺口服液高劑量組 10 96.57±7.24b 396.37±59.22bc 558.43±51.31bc養(yǎng)陰清肺口服液中劑量組 10 106.68±7.51b 558.41±63.14b 687.32±45.63b養(yǎng)陰清肺口服液低劑量組 10 151.57±6.35 803.57±55.36 902.28±39.57

2.2 各組肺組織TNF-α、TGF-β1 蛋白表達比較

Western blot 檢測結(jié)果顯示，模型組肺組織TNF-α、TGF-β1蛋白表達水平均高于空白組（P＜0.05）。與模型組、地塞米松比較，養(yǎng)陰清肺口服液中高劑量組TNF-α、TGF-β1蛋白表達水平降低（P＜0.05），見表2。

表2 大鼠肺組織TNF-α、TGF-β1 的蛋白表達水平（±s，n=10）

表2 大鼠肺組織TNF-α、TGF-β1 的蛋白表達水平（±s，n=10）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與地塞米松組比較，cP＜0.05

組別 例數(shù) TNF-α TGF-β1空白組 10 0.16±0.07 0.12±0.03模型組 10 0.59±0.31a 0.51±0.04a地塞米松組 10 0.49±0.04 0.46±0.05養(yǎng)陰清肺口服液高劑量組 10 0.26±0.03bc 0.24±0.02bc養(yǎng)陰清肺口服液中劑量組 10 0.33±0.05bc 0.30±0.05bc養(yǎng)陰清肺口服液低劑量組 10 0.54±0.03 0.48±0.03

2.3 各組外周血中不同T 淋巴細胞亞群百分率比較

與空白組比較，模型組大鼠外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均顯著降低，CD8+水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，養(yǎng)陰清肺口服液中高劑量組外周血CD3+水平顯著升高（P＜0.01），高劑量組CD4+、CD4+/CD8+水平均顯著升高，CD8+水平顯著降低（P＜0.01）；地塞米松組較模型組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均降低，CD8+水平升高（P＜0.01），見表3。

表3 大鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+ 的水平（±s）

表3 大鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+ 的水平（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.01

組別 例數(shù) CD3+（%） CD4+（%） CD8+（%） CD4+/CD8+空白組 10 45.86±2.45 30.85±2.32 18.89±2.26 1.63±0.22模型組 10 33.19±3.21a 24.54±3.25a 24.31±1.95a 1.01±2.32a地塞米松組 10 30.48±1.13 22.27±1.33 25.26±3.12 0.88±2.32養(yǎng)陰清肺口服液高劑量組 10 48.02±3.34b 29.32±3.24b 20.76±0.18b 1.42±2.32b養(yǎng)陰清肺口服液中劑量組 10 45.15±2.26b 25.81±1.33 21.42±0.27 1.20±2.32養(yǎng)陰清肺口服液低劑量組 10 40.92±0.34 24.74±1.23 21.66±0.14 1.14±2.32

2.4 各組肺組織病理變化

空白組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，無充血、纖維化。模型組肺泡塌陷，炎細胞大量浸潤，肺間質(zhì)纖維化嚴重；地塞米松組肺泡結(jié)構(gòu)疏松紊亂，密集的炎細胞浸潤區(qū)減少，散在的浸潤區(qū)增多，出現(xiàn)局灶纖維化；養(yǎng)陰清肺口服液高劑量組肺泡結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)見少量炎細胞浸潤，間質(zhì)纖維化較少，纖維化程度明顯輕于模型組；養(yǎng)陰清肺口服液中、低劑量組肺間質(zhì)纖維化有所改善，見圖1。

圖1 大鼠肺組織病理學改變（HE，×200）

3 討論

3.1 放射性肺損傷的病理機制

放射性肺損傷是肺組織受電離輻射引起間質(zhì)及肺泡水腫，釋放多種致炎、致纖維化細胞因子，引起肺炎性反應(yīng)及纖維化[5]。其中，IL-1 介導(dǎo)炎性反應(yīng)及纖維化，調(diào)節(jié)T 淋巴細胞活性及機體的炎癥及免疫反應(yīng)[6]。TNF-α 是細胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的啟動因子，在組織炎癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[7]。TGF-β1不僅參與早期炎性細胞啟動放射性肺損傷發(fā)生，還進一步刺激成纖維細胞增生，是誘發(fā)放射性肺損傷關(guān)鍵因素[8]。放療后血清TGF-β1可作為放射性肺炎的預(yù)測因子[9]，抑制其表達可推遲器官纖維化進程[10]。

3.2 放射性肺損傷的治療原則

中醫(yī)認為放射線為火熱邪毒，灼傷肺陰，且癌癥患者本身存在外周血淋巴細胞亞群表達異常[11]，放療后免疫功能進一步降低。不同T 細胞亞群是細胞免疫功能的主要承擔者，其中CD3+，CD4+，CD8+T 細胞亞群數(shù)量和比例的穩(wěn)定和平衡是維持機體正常免疫功能的基礎(chǔ)[12]。因此放射性肺損傷治療應(yīng)以養(yǎng)陰清肺、清熱解毒、活血化瘀、調(diào)節(jié)機體免疫功能為主。養(yǎng)陰清肺口服液中地黃、川貝母、麥冬、玄參、薄荷、甘草具有清熱解毒、消腫散結(jié)、祛痰平喘、消炎抗菌的功效，地黃、麥冬、白芍、薄荷、牡丹皮可調(diào)節(jié)T 淋巴細胞亞群平衡，提高機體免疫力[13]。

3.3 養(yǎng)陰清肺口服液的保護作用

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清IL-1、TNF-α、TGF-β1水平均顯著升高，肺組織TNF-α、TGF-β1蛋白表達升高；組織病理學見肺泡壁斷裂，肺間質(zhì)充血、水腫，肺泡腔粒細胞浸潤等炎癥反應(yīng)及纖維化反應(yīng)，同時外周血CD3+，CD4+，CD4+/CD8+比值明顯降低，CD8+顯著升高，表明放射線照射可影響大鼠外周血T 淋巴細胞亞群，導(dǎo)致免疫功能異常，促進細胞炎性因子大量釋放，說明放射性肺損傷大鼠模型建立成功。養(yǎng)陰清肺口服液高劑量組大鼠CD3+，CD4+，CD4+/CD8+T 淋巴細胞水平較模型組明顯升高，CD8+水平顯著降低，地塞米松組較模型組CD3+，CD4+，CD4+/CD8+水平均降低，CD8+水平升高，說明養(yǎng)陰清肺口服液能有效調(diào)節(jié)T 淋巴細胞亞群，提高機體細胞免疫功能，抑制細胞炎性因子分泌。地塞米松長期使用對免疫指標有抑制作用。與模型組比較，養(yǎng)陰清肺口服液中高劑量組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)僅少量纖維增生，且纖維化程度低于地塞米松組；能顯著降低血清IL-1、TNF-α、TGF-β1水平及肺組織TNF-α、TGF-β1蛋白表達。與地塞米松組比較，養(yǎng)陰清肺口服液高劑量組TNF-α、TGF-β1水平更低，提示放療早期應(yīng)用養(yǎng)陰清肺口服液能抑制急性炎癥所致毛細血管通透性亢進，改善微循環(huán)，促進炎癥吸收，抑制肺組織纖維化，阻止放射性肺損傷發(fā)展。

綜上所述，養(yǎng)陰清肺口服液可調(diào)節(jié)T 淋巴細胞亞群平衡，改善免疫功能，抑制放射性肺泡炎性反應(yīng)及肺纖維化進程，療效優(yōu)于地塞米松，對大鼠放射性肺損傷具有良好的保護作用。