以乳極性脂/蛋白為界面脂滴的體外消化特性研究

馮 坤，孫 聰，梁少華

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

人乳脂肪是新生兒發(fā)育的主要能量來(lái)源，對(duì)嬰幼兒的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用。在母乳中，脂肪以乳脂肪球(MFG)的形式穩(wěn)定存在，其核心為甘油三酯(TAG，約占總脂質(zhì)的98%)[1]，外部由具有三層結(jié)構(gòu)的薄膜包被，是一種主要由極性物質(zhì)(如磷脂和蛋白質(zhì))組成的具有特殊功能的天然膜，被稱為乳脂肪球膜(MFGM)[2]。MFGM作為一種油水界面物質(zhì)，能夠參與脂肪的消化、吸收和代謝過(guò)程[3]，有助于嬰兒認(rèn)知和免疫功能的提高[4]，對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。

嬰兒配方奶粉作為母乳的替代品，其發(fā)展趨勢(shì)是全面模擬人乳脂的組成、結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)特性，與人乳脂相似至關(guān)重要[5]。目前，市售嬰兒配方奶粉多采用植物油復(fù)合調(diào)配，依靠酪蛋白、乳清蛋白或卵磷脂等乳化劑，經(jīng)過(guò)熱處理、均質(zhì)等一系列加工過(guò)程，形成粒徑較小(0.3～0.8 μm)的脂滴，表面主要由酪蛋白和乳清蛋白覆蓋。研究表明，盡管嬰兒配方奶粉中的脂滴具有更小的脂肪顆粒，但母乳中的脂肪更容易被水解[6]。這種與母乳MFGM組成的差異影響了脂肪在嬰兒胃腸道的消化代謝[7]。研究表明，MFGM中的極性脂組分可通過(guò)靜電相互作用促進(jìn)脂肪酶的定向和吸附，從而促進(jìn)嬰兒對(duì)人乳脂的高效消化[8]。

近些年來(lái)，人們致力于研究影響嬰兒消化的因素，大多集中于甘油三酯(TAG)結(jié)構(gòu)及脂肪球粒徑等。Fave等[9]發(fā)現(xiàn)不同TAG結(jié)構(gòu)影響脂質(zhì)消化后產(chǎn)物的釋放和吸收，TAG結(jié)構(gòu)對(duì)脂質(zhì)消化的影響主要取決于其作用機(jī)制；Garcia等[10]發(fā)現(xiàn)小粒徑(1.7 μm)天然脂肪球在消化時(shí)的水解率約為大脂肪球(6.6 μm)的2倍，原因是小脂肪球的表面積更大，增大了酶的接觸面積。現(xiàn)有的研究極少關(guān)注脂滴界面組分在消化過(guò)程中發(fā)揮的積極作用。

為了探究脂滴的界面組成對(duì)嬰兒消化的影響，作者以牛乳來(lái)源的酪乳粉為原料，提取并濃縮得到乳極性脂(MPL)，分別以MPL和酪蛋白酸鈉(CN)為乳化劑構(gòu)建不同界面組成的脂滴，采用嬰兒胃腸道體外消化模型，分析消化過(guò)程中乳脂消化速率和消化產(chǎn)物的變化，為開發(fā)具有極性脂界面的脂滴提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

酪乳粉：新西蘭恒天然有限公司；INFAT?嬰兒專用油脂(OPO：21.21%；C16∶ 0：20.45%；C18∶ 1：36.67%；C18∶ 2：23.28%)：浙江杭州貝因美有限公司。

酪蛋白酸鈉(CN)、氘代氯仿(CDCl3)、磷酸三苯酯(TPP)：上海麥克林生化試劑有限公司；米根酶脂肪酶(500 U/mg)、胃蛋白酶(695 U/mg)、胰液素：上海西格瑪奧德里齊貿(mào)易有限公司；牛膽鹽(膽酸≥70%):北京索萊寶科技有限公司；氯仿、甲醇、丙酮、乙醚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na+)等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890A氣相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；AVANCE Ⅲ HD 500 M 超導(dǎo)核磁共振波譜儀(NMR)：瑞士Bruker公司；Marvern Z90激光粒度電位測(cè)定儀、Mastersizer 3000 激光粒度儀：英國(guó)馬爾文儀器有限公司；ULTRA-TURRAX T10高速剪切乳化機(jī)、恒溫磁力加熱攪拌器：德國(guó)IKA公司；LD5-10臺(tái)式低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 酪乳粉中脂肪的提取

取4.5 g酪乳粉于燒杯中，加入30 mL 45 ℃水(煮沸后冷卻),完全溶解，采用氯仿-甲醇法提取酪乳粉中的脂肪[11]。

1.3.2 乳極性脂的濃縮

采用丙酮萃取法進(jìn)一步濃縮所提取脂肪中的乳極性脂：向脂肪中加入10倍體積的丙酮，充分?jǐn)嚢韬?，放? ℃冰箱中過(guò)夜，靜置分層。取下層固體，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、氮吹后得乳極性脂濃縮物，放入-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存。

1.3.3 乳極性脂中磷脂的組成及含量測(cè)定

參考文獻(xiàn)[12]的方法制備所需溶劑。精確稱取約5 mg的TPP，溶于50 mL CDCl3中作為內(nèi)標(biāo)溶液；制備0.2 mol/L pH 7.0的EDTA-Na+溶液，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0。

樣品處理：稱取濃縮后的乳極性脂樣品200 mg于15 mL離心管中，依次加入0.5 mL 甲醇、0.5 mL 0.2 mol/L EDTA-Na+溶液和0.5 mL 含有TPP的CDCl3溶液，充分混合至所有樣品溶解后離心(4 000 r/min，5 min)，吸取500 μL下層清液至核磁管中進(jìn)行分析。核磁共振的參數(shù)設(shè)置參照文獻(xiàn)[13]的方法。

1.3.4 乳液的制備

乳液由水相和油相(INFAT?嬰兒專用油脂)組成。將乳化劑(CN、MPL)均勻分散在磷酸鹽緩沖液中，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅湃? ℃冰箱中過(guò)夜。將油相以8%(質(zhì)量比)與水相混合后，使用高速剪切乳化機(jī)在9 000 r/min下預(yù)混3 min，然后以26 000 r/min剪切3 min，分別制備以蛋白、MPL包被的脂滴(CN組、MPL組)。

1.3.5 粒徑和電位的測(cè)定

樣品稀釋100倍后采用激光粒度儀在25 ℃測(cè)定粒徑；樣品稀釋10倍后采用激光粒度電位儀進(jìn)行電位的測(cè)定。

1.3.6 體外消化模型的建立

基于文獻(xiàn)[14]的方法，稍做修改，建立嬰兒胃腸道體外消化模型。

模擬胃液的配制：在100 mL去離子水中加入NaCl(2 g/L)和鹽酸(7 g/L)，調(diào)節(jié)pH值為5.5。加入胃蛋白酶和米根酶脂肪酶，使其在體系中的終質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL和0.886 7 mg/mL。

模擬腸液的配制：在100 mL磷酸緩沖液中加入NaCl(26.32 g/L)，調(diào)節(jié)pH值為6.5。加入胰液素和膽鹽，使其在體系中的終質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL和1.25 mg/mL。

1.3.7 模擬體外消化

胃消化階段：取配制的胃液30 mL與60 mL乳液混合，置于250 mL三頸燒瓶中，迅速調(diào)節(jié)體系pH值 為5.5，于37 ℃反應(yīng)1 h。采用 0.1 mol/L NaOH溶液使混合體系的pH值保持恒定，記錄不同時(shí)間消耗NaOH的量，定期取出一部分樣品，并立即加入0.1 mol/L的HCl溶液滅酶，以備后續(xù)分析。

腸消化階段：取經(jīng)胃消化后的樣品40 mL與40 mL腸液混合，置于250 mL三頸燒瓶中，迅速調(diào)節(jié)體系pH值為6.5，于37 ℃反應(yīng)2 h。添加0.1 mol/L NaOH 使混合體系的pH值保持恒定，記錄不同時(shí)間消耗NaOH的量，定期取樣后立即加入0.1 mol/L的HCl溶液滅酶，以備后續(xù)分析。

1.3.8 體外消化過(guò)程的表征

1.3.8.1 游離脂肪酸釋放量的測(cè)定

根據(jù)消化過(guò)程中NaOH的消耗量測(cè)定樣品中脂肪酸的釋放量。

FFA=V×c×1 000，

式中：FFA為消化過(guò)程中游離脂肪酸釋放量，μmol；V為消耗NaOH 的體積，mL；c為NaOH 溶液的濃度，mol/L。

1.3.8.2 粒徑和電位的測(cè)定

消化過(guò)程中粒徑和電位的測(cè)定同1.3.5。

1.3.8.3 脂質(zhì)組成的分析

乳液消化產(chǎn)物中的脂肪采用氯仿-甲醇法進(jìn)行提?。喝∠蟮?0 mL樣品，加入30 mL氯仿/甲醇溶液(1∶ 2，V/V)，超聲提取5 min后，加入10 mL氯仿攪拌約1 min，最后再加入10 mL蒸餾水?dāng)嚢韬箪o置20 min。收集靜置后的有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶劑，旋蒸后的樣品經(jīng)氮吹后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

甘油酯組成分析：正己烷溶解提取出的脂質(zhì)，進(jìn)氣相色譜分析。采用Agilent DB-1HT 色譜柱(30.0 m×250 μm×0.1 μm )，進(jìn)樣口溫度350 ℃，氫火焰離子化檢測(cè)器溫度400 ℃，載氣為氮?dú)猓魉?5.0 mL/min，分流比5.0。初始溫度100 ℃，保留1 min；50 ℃/min 升溫至220 ℃，保留2 min；15 ℃/min升溫至290 ℃，保留2 min；40 ℃/min升溫至320 ℃，保留6 min；20 ℃/min升溫至360 ℃，保留16 min。

脂肪酸組成分析：分離后的游離脂肪酸(FFA)采用三氟化硼-甲醇法進(jìn)行甲酯化處理，分離后的單甘酯(MAG)采用簡(jiǎn)易甲酯化方法進(jìn)行處理。采用氣相色譜儀分析脂肪酸組成：SGC BXP-70毛細(xì)管柱(30.0 m×250 μm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250 ℃，氫火焰離子化檢測(cè)器溫度260 ℃，載氣為氮?dú)猓魉?.0 mL/min，分流比1∶50。初始溫度170 ℃，以2 ℃/min升溫至210 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2018軟件制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳極性脂中磷脂的組成與含量

表1為酪乳粉總脂和濃縮乳極性脂中3種主要磷脂組分的含量，酪乳粉中鞘磷脂(SM)含量較高，與文獻(xiàn)[15]結(jié)果相一致。經(jīng)丙酮濃縮后，磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰膽堿(PC)、SM含量均有增加，總含量達(dá)30.5%，結(jié)合文獻(xiàn)[10,16-17]可知，此樣品可作為具有乳極性脂界面脂滴的原料。

表1 酪乳粉總脂及濃縮乳極性脂中主要 磷脂組分含量Table 1 Main phospholipid components in total fat of buttermilk powder and concentrated milk polar fat %

2.2 乳液的初始粒徑

表2是以CN和MPL為乳化劑制備脂滴的平均粒徑D[4,3]、D[3,2]和比表面積。脂滴的粒徑是影響嬰兒消化的關(guān)鍵因素之一[18]，因此，本研究所制備的脂滴的粒徑較為相近，以CN和MPL為界面的脂滴平均粒徑D[4,3]分別為10.1 μm和10.4 μm，D[3,2]分別為3.72 μm和3.57 μm。

表2 脂滴的初始粒徑及比表面積Table 2 Initial particle size and specific surface area of the lipid droplets

2.3 消化過(guò)程表征

2.3.1 消化過(guò)程中粒徑的變化

通過(guò)模擬嬰兒腸胃道消化環(huán)境，對(duì)兩種具有不同界面組成的脂滴進(jìn)行體外消化，消化過(guò)程中D[3,2]的變化如圖1所示。

圖1 消化過(guò)程中脂滴D[3,2]的變化Fig.1 Changes in D[3,2] of lipid droplets during digestion

由圖1可知，在胃消化初期(20 min)，兩種脂滴的平均粒徑均有所增大，這是由于在胃蛋白酶和胃脂酶的共同作用下，脂肪球發(fā)生聚集，粒徑變大，同時(shí)脂解反應(yīng)釋放出的游離脂肪酸附著在脂滴表面使聚集加劇。在模擬胃液消化過(guò)程中，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，兩組脂滴的平均粒徑均呈增大趨勢(shì)，其中MPL組脂滴的平均粒徑均大于CN組脂滴。在模擬腸液消化過(guò)程中，隨著pH值的回升及膽鹽的加入，聚集的脂滴重新分散。脂滴平均粒徑先減小后逐漸趨于平穩(wěn)，表明隨著反應(yīng)的進(jìn)行脂肪酶被消耗，脂滴表面的物質(zhì)不再發(fā)生變化，平均粒徑趨于穩(wěn)定。圖2為兩種脂滴在胃、腸消化過(guò)程中的粒徑分布，與CN組相比，MPL組脂滴在胃消化過(guò)程中出現(xiàn)了較大的粒徑峰，這可能是因?yàn)橛尚》肿恿字纬傻慕缑姹绕渌榛瘎┬纬傻慕缑嫱繉涌咕奂芰Σ頪19]。MPL組中的粒徑峰在腸消化過(guò)程中不斷減小，表明MPL組中的脂滴能夠更加持續(xù)、平穩(wěn)地進(jìn)行消化。

2.3.2 消化過(guò)程中Zeta-電位的變化

圖3為CN組和MPL組脂滴在消化過(guò)程中Zeta-電位的變化，CN組和MPL組脂滴的初始電位(0 min)分別為-35.47、-57.08 mV，這種高強(qiáng)度的負(fù)電荷在液滴之間產(chǎn)生了較強(qiáng)的排斥力，從而阻止它們聚集。在整個(gè)消化過(guò)程中，MPL組脂滴的Zeta-電位絕對(duì)值始終大于CN組，其可能與MPL自身的化學(xué)基團(tuán)有關(guān)，如磷酸基團(tuán)、羧基基團(tuán)和氨基基團(tuán)[20]。胃消化初期，兩組乳液脂滴的Zeta-電位絕對(duì)值顯著降低，其脂滴表面的靜電斥力不足以穩(wěn)定分散，這也部分解釋了在胃消化時(shí)期由于脂滴聚集造成粒徑增大的現(xiàn)象。

在腸消化初期，兩組脂滴的Zeta-電位均呈現(xiàn)顯著增加的現(xiàn)象，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[21-22]。當(dāng)脂滴與模擬腸液混合后，膽鹽會(huì)置換脂滴原有的界面，造成電位的增加。此外，脂肪酶不斷吸附在脂滴表面并水解TAG，形成的水解產(chǎn)物(如FFA和MAG)在界面的積累，也會(huì)造成表面電荷的增加[23]。MPL組脂滴的Zeta-電位絕對(duì)值始終高于CN組，表明以MPL為界面的脂滴在腸消化過(guò)程中脂滴之間的靜電斥力較強(qiáng)，有利于消化反應(yīng)的進(jìn)行。

圖2 脂滴在消化過(guò)程中的粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of lipid droplets during gastric and intestinal digestion

圖3 脂滴在消化過(guò)程中的Zeta-電位Fig.3 Zeta-potential of lipid droplets during digestion

2.3.3 游離脂肪酸的釋放動(dòng)力學(xué)

圖4為兩種脂滴嬰兒體外胃腸道消化過(guò)程中的脂肪酸釋放量。在胃消化過(guò)程中，相較于CN組，MPL組脂滴釋放更多的脂肪酸。在消化初期(0～10 min)，脂肪酸釋放速率較快，因?yàn)橄跗诘牡孜餄舛容^大，與脂肪酶充分接觸。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，脂肪酸釋放率降低，表明隨著反應(yīng)的進(jìn)行，脂肪酶逐漸被消耗，降低了脂解速率[11]。消化30 min后，MPL組脂滴表現(xiàn)出較高的脂肪酸釋放速率及釋放量，表明以MPL為界面組分的脂滴具有更好的消化特性。

圖4 脂滴在消化過(guò)程中的脂肪酸釋放量Fig.4 Fatty acid release amount of lipid droplets during digestion

由圖4可知，在腸消化初期，CN組與MPL組脂滴均表現(xiàn)出較高的脂肪酸釋放速率，這是由于反應(yīng)初期底物濃度較高，并且膽鹽具有較高的表面活性，脂肪酶被迅速吸附到界面進(jìn)行水解。此外，膽鹽的存在可以有效清除胃消化結(jié)束時(shí)附著在脂滴表面的脂解產(chǎn)物，從而增加脂肪酶與脂滴接觸的表面積。當(dāng)進(jìn)入腸消化初期(60～70 min)時(shí)，CN組脂滴的消化速率高于MPL組。在消化80 min后，MPL組具有較高的脂肪酸釋放率，這可能是由于胰液素是一種混合消化酶，其含有的磷脂酶和膽鹽對(duì)磷脂的水解具有協(xié)同作用[24]，從而使TAG核心更快地暴露在界面，增加酶與底物的接觸面積。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，兩種脂滴的釋放趨勢(shì)逐漸平緩，這是由于反應(yīng)不斷消耗脂肪酶和不斷釋放FFA、MAG和甘油二酯(DAG)等活性物質(zhì)，其吸附在脂滴表面會(huì)抑制反應(yīng)的進(jìn)行。MPL組脂滴的脂肪酸釋放量高于CN組，這一結(jié)果與Zeta-電位結(jié)果相一致。

2.3.4 消化過(guò)程中脂解產(chǎn)物的變化

圖5為消化過(guò)程中兩種脂滴的甘油酯組成。CN組和MPL組脂滴在胃消化過(guò)程中，TAG含量明顯降低，主要轉(zhuǎn)化為DAG和FFA，生成MAG的量較少，這可能是由于胃脂酶結(jié)合在脂滴表面時(shí)，更傾向于脂解TAG分子中sn-3位的脂肪酸[25]。在胃消化20 min時(shí)，F(xiàn)FA含量顯著增加，隨著反應(yīng)的進(jìn)行呈現(xiàn)緩步上升的趨勢(shì)。胃消化終點(diǎn)時(shí)，CN組和MPL組脂滴中TAG含量分別為22.58%和26.52%，表明胃蛋白酶在CN組脂滴消化過(guò)程中發(fā)揮了較大的作用。在腸消化初期(90 min)，TAG和DAG含量明顯下降，F(xiàn)FA含量急劇增加，表明在這個(gè)階段TAG和DAG的脂解反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，生成較多的FFA，這是因?yàn)橐戎笇?duì)TAG和DAG的sn-1,3位均具有活性。在腸消化終點(diǎn)，CN組和MPL組脂滴的TAG含量分別為11.22%和8.15%，與之前FFA釋放量結(jié)果一致。

圖5 兩種脂滴在消化過(guò)程中的甘油酯組成Fig.5 Glyceride composition of two lipid droplets during digestion

2.3.5 消化過(guò)程中脂肪酸組成的變化

圖6為兩種脂滴在胃、腸消化終點(diǎn)時(shí)所釋放的游離脂肪酸組成。在胃消化終點(diǎn)，CN組和MPL組脂滴釋放的主要脂肪酸為油酸、亞油酸和棕櫚酸，占總脂肪酸的70%以上。其中，油酸含量在CN組和MPL組分別達(dá)到40.19%和39.67%，這與所選油相為OPO型專用油脂有關(guān)。此外，還有一定的辛酸、癸酸、月桂酸、豆蔻酸以及亞麻酸釋放。在脂肪酸釋放種類上，CN組與MPL組在胃消化過(guò)程中并無(wú)顯著差異。在腸消化終點(diǎn)，釋放的主要脂肪酸仍為油酸、亞油酸和棕櫚酸，但MPL組較CN組脂滴釋放較多的游離棕櫚酸。

圖6 胃、腸消化終點(diǎn)的游離脂肪酸組成Fig.6 Free fatty acid composition at the end of gastric and intestinal digestion

圖7為兩種脂滴在胃、腸消化終點(diǎn)時(shí)MAG的脂肪酸組成。CN組和MPL組在各階段消化終點(diǎn)釋放的MAG均為月桂酸、棕櫚酸、油酸和亞油酸MAG，其中飽和脂肪酸MAG的含量均低于不飽和脂肪酸MAG。在胃消化終點(diǎn)，CN組與MPL組脂滴釋放的MAG組成并無(wú)顯著性差異。在腸消化終點(diǎn)，兩組脂滴釋放的油酸MAG和亞油酸MAG含量降低，棕櫚酸MAG含量增加。CN組釋放了較多的棕櫚酸MAG，而MPL組釋放了較多的月桂酸MAG、油酸MAG和亞油酸MAG。從胃階段到腸階段，兩組脂滴均釋放了較多的飽和脂肪酸MAG，其中CN組脂滴的釋放量更多。

圖7 胃、腸消化終點(diǎn)的單甘酯脂肪酸組成Fig.7 Fatty acid composition of monoglycerides at the end of gastric and intestinal digestion

3 結(jié)論

本研究從酪乳粉中提取并濃縮制得MPL，以MPL和CN為乳化劑制備了具有不同界面組成的脂滴，研究了兩者的消化特性。結(jié)果表明，在粒徑相近的基礎(chǔ)上，界面組分對(duì)脂滴的消化具有一定影響。在整個(gè)消化過(guò)程中，MPL組脂滴的FFA釋放量高于CN組，脂解程度較高，且MPL組在腸消化過(guò)程中的粒徑峰顯著下降，脂滴的脂解程度更高；MPL組脂滴的Zeta-電位處于較高水平，表明其消化過(guò)程中的穩(wěn)定程度較高。CN組在消化終點(diǎn)釋放了較多的棕櫚酸單甘酯，而MPL組則釋放了較多的游離棕櫚酸、油酸單甘酯和亞油酸單甘酯?？偟膩?lái)說(shuō)，以MPL為界面的脂滴具有更好的消化特性，更適合嬰兒的消化。因此，在嬰兒配方奶粉的實(shí)際生產(chǎn)中，適當(dāng)?shù)靥砑覯PL對(duì)嬰兒的消化是有益的。值得注意的是，由于體內(nèi)消化的復(fù)雜性，體外消化很難完全模擬嬰兒體內(nèi)真實(shí)的消化情況，因此，需要開發(fā)與體內(nèi)消化更加相似的消化模型，進(jìn)一步探究界面組分對(duì)嬰兒消化的影響。