UHPLC法快速測(cè)定堅(jiān)果炒貨中4種抗氧化劑含量

周迎春，楊盛茹，華向美，李單單，賀金濤

1.河南進(jìn)口肉類指定口岸漯河查驗(yàn)區(qū)服務(wù)中心，河南 漯河 462300 2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450046 3.中華人民共和國(guó)漯河海關(guān)，河南 漯河 462000

為減少食品在生產(chǎn)儲(chǔ)存運(yùn)輸過(guò)程中因氧化而褪色、變色、變質(zhì)、出現(xiàn)哈喇味，降低食品中多環(huán)芳烴和氧化多環(huán)芳烴等有害污染物的產(chǎn)生，抗氧化劑常被直接添加到食品中或涂抹于食品包裝材料內(nèi)壁[1-3]。常用的食品抗氧化劑有叔丁基對(duì)羥基茴香醚(BHA)[4]、二丁基羥基甲苯(BHT)[5]、特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)和沒(méi)食子酸丙酯(PG)[6]等。堅(jiān)果炒貨類食品因富含油脂和脂肪酸易被氧化而變質(zhì)，產(chǎn)生哈喇味等不良口感，造成安全隱患[7-9]，抗氧化劑的添加可以有效預(yù)防氧化反應(yīng)的發(fā)生，但是過(guò)量使用抗氧化劑會(huì)危害機(jī)體健康[10]，具有致癌[11]、抑制人體呼吸酶活性[12]、致突變[13]的危險(xiǎn)。許多國(guó)家對(duì)抗氧化劑的使用限量作了明確規(guī)定[14]，日本及歐盟等國(guó)家禁止TBHQ等抗氧化劑在任何食品中添加使用[15]。GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定，在堅(jiān)果炒貨中BHA、BHT、TBHQ不得超過(guò)200 mg/kg，PG不得超過(guò)100 mg/kg。

目前，抗氧化劑測(cè)定有氣相色譜法[16]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[17]、液相色譜法[18]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[19]及比色法[20]等，以液相色譜法應(yīng)用最廣[21]，而超高效液相色譜法(UHPLC)具有出峰速度快、靈敏度高及分離度好的顯著優(yōu)勢(shì)。作者對(duì)比了兩種前處理方法，建立一種快速測(cè)定堅(jiān)果炒貨中4種抗氧化劑含量的UHPLC方法，該法快速高效、靈敏度高、回收率好。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

開(kāi)心果、油炸花生和蘭花豆等：市售。

甲醇、乙腈：色譜純，美國(guó)fisher試劑公司；BHA、BHT、TBHQ(純度分別為99.1%、99.9%、99.7%)：壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；PG(純度為98.8%)：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；試驗(yàn)用水均由美國(guó)Millipore公司生產(chǎn)的Milli-Q超純水系統(tǒng)制得；PS/DVB SPE柱(500 mg/6 mL)：月旭科技(上海)股份有限公司；ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、HILIC Core-shell(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)和CORTECS C18(50.0 mm×4.6 mm，2.7 μm)：沃特世科技(上海)有限公司。

1 mg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液：取BHA、BHT、TBHQ、PG各100 mg用乙腈溶解并定容至100 mL，搖勻，4 ℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：移取適量體積1 mg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液分別稀釋至20、50、100、200、400 mg/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 儀器與設(shè)備

AcQuity Arc超高效液相色譜儀(配有PDA檢測(cè)器)：美國(guó)Waters公司；5810R離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；KQ 5200DE數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；XPE 205分析天平：瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜柱和流動(dòng)相的選擇

考察了3種色譜柱(ACQUITY UPLC BEH Amide、HILIC Core-shell和CORTECS C18)對(duì)BHA、BHT、TBHQ、PG 4種抗氧化劑的分離效果。選擇效果較好的色譜柱，比較乙腈和甲醇作為有機(jī)相時(shí)對(duì)4種抗氧化劑的峰形及分離度的影響。

1.3.2 樣品前處理

方法一：參照GB 5009.32—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中9種抗氧化劑的測(cè)定》。準(zhǔn)確稱量樣品1.0 g(精確至0.01 g)，置于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩2 min，超聲10 min，3 000 r/min離心5 min，收集上清液于離心管中，再使用10 mL乙腈溶液重復(fù)提取1次，合并2次上清液，待凈化。將上清液全部加載到SPE柱上(使用前須經(jīng)5 mL甲醇活化，5 mL乙腈平衡)，收集流出液，再用10 mL溶液(V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶ 2)洗脫，收集流出液。合并收集液于旋蒸瓶中，40 ℃旋干，并用乙腈復(fù)溶，定容至2 mL，過(guò)0.45 μm濾膜，濾液備用。

方法二：參照NY/T 1602—2008《植物油中叔丁基羥基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)和特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)的測(cè)定 高效液相色譜法》。準(zhǔn)確稱量樣品5.0 g(精確至0.01 g)，置于50 mL具塞離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋振蕩10 min，3 000 r/min離心5 min，取上清液于25 mL容量瓶中，殘余物重復(fù)提取1次，上清液合并于25 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，濾液備用。

1.3.3 檢出限與定量限的測(cè)定

取混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液上機(jī)測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，自動(dòng)生成校準(zhǔn)曲線，4種抗氧化劑線性范圍10～200 mg/L。根據(jù)GB/T 27404—2008要求確定方法檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。

1.3.4 準(zhǔn)確度和精密度的驗(yàn)證

取未加抗氧化劑的開(kāi)心果、油炸花生分別做三水平加標(biāo)，選擇前處理效果好的方法進(jìn)行處理后上機(jī)測(cè)定，重復(fù)測(cè)定7次并計(jì)算回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度和精密度。

1.3.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

用所建立的方法對(duì)開(kāi)心果、油炸花生和蘭花豆等共計(jì)24批次的樣品中BHA、BHT、TBHQ、PG 4種抗氧化劑含量進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品做2個(gè)平行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

圖譜的采集及定量分析采用EmpowerTM3軟件，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016制圖及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

由圖1可知，前兩種色譜柱均無(wú)法有效分離4種抗氧化劑，而CORTECS?C18色譜柱可以使4種抗氧化劑分離，且分離度好、峰形對(duì)稱。ACQUITY UPLC BEH Amide作為正相色譜柱更適合中性化合物的分析，4種抗氧化劑難以得到有效保留；HILIC Core-shell色譜柱適合分析弱極性化合物中極性更強(qiáng)的物質(zhì)，4種抗氧化劑保留效果差，不能有效定性和定量；CORTECS C18作為反相色譜柱適合分析弱極性化合物中極性更弱的物質(zhì)，由于4種抗氧化劑屬于弱極性化合物，因此可在CORTECS C18色譜柱中得到更有效的保留，從而獲得更好的分離度和峰形，可滿足定性和定量分析。

注：a為ACQUITY UPLC BEH Amide；b為HILIC Core-shell；c為CORTECS C18。圖1 3種色譜柱分離效果Fig.1 Separation effect of three kinds of chromatographic columns

2.2 流動(dòng)相的選擇

在CORTECS C18色譜柱中，利用乙腈作為有機(jī)相時(shí)，4種抗氧化劑不易保留，且分離度差，而甲醇作為有機(jī)相時(shí)，4種抗氧化劑保留效果好，信號(hào)響應(yīng)更強(qiáng)，且容易分離，這與反相色譜柱中乙腈的洗脫能力大于甲醇有關(guān)。由圖1c可知，用純水作為水相時(shí)，4種待測(cè)目標(biāo)物均有嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，峰形相對(duì)較差。由圖2可知，0.5%(V/V)甲酸水溶液可以有效改善峰形，4種抗氧化劑在8 min內(nèi)即可有效分離，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于GB 5009.32—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中9種抗氧化劑的測(cè)定》中的30 min。因此，試驗(yàn)流動(dòng)相選擇A為0.5%(V/V)甲酸水溶液、B為甲醇，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量10.0 μL。為了縮短出峰時(shí)間、高效分離目標(biāo)物和除去色譜柱中殘留雜質(zhì)，進(jìn)而降低基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的干擾，參照文獻(xiàn)[22]設(shè)計(jì)流動(dòng)相梯度洗脫程序，見(jiàn)表1。

圖2 水相為0.5%(V/V)甲酸水溶液時(shí)的色譜圖Fig.2 Chromatogram with 0.5% (V/V) formic acid aqueous solution as the aqueous phase

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

2.3 兩種前處理方法效果比對(duì)

取未加抗氧化劑的開(kāi)心果可食用部分，粉碎均勻后，分別準(zhǔn)確稱取1.0、5.0 g，按照200 mg/kg的加標(biāo)量，加入適量4種抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次依照1.3.2中方法一和方法二分別進(jìn)行前處理后取濾液上機(jī)檢測(cè)，濾液的理論質(zhì)量濃度分別為100、40 mg/L，實(shí)際測(cè)定的液相色譜圖分別見(jiàn)圖3和圖4。由圖3和圖4可知：方法一與方法二中PG和TBHQ都有很好的響應(yīng)，但是方法一中BHA與BHT的響應(yīng)都明顯低于方法二，且BHT的響應(yīng)為0，而在方法二中響應(yīng)良好。這表明方法二更適合用于開(kāi)心果中4種抗氧劑含量的測(cè)定。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 檢出限及定量限

4種抗氧化劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)(R)、檢出限(LOD)及定量限(LOQ)見(jiàn)表2。由表2可知，4種抗氧化劑在10～200 mg/L范圍內(nèi)線性均良好，R均大于0.998，符合GB/T 27404—2008的要求。GB 5009.32—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中9種抗氧化劑的測(cè)定》中PG、TBHQ、BHA、BHT的LOD分別為2、10、10、4 mg/kg，LOQ均為20 mg/kg，該研究中LOD和LOQ均明顯低于GB 5009.32—2016中的方法檢出限和定量限?？梢?jiàn)，該方法靈敏度高，具有明顯優(yōu)勢(shì)。

圖3 方法一中加標(biāo)樣品的液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatogram of the spiked sample with method 1

圖4 方法二中加標(biāo)樣品的液相色譜圖Fig.4 Liquid chromatogram of the spiked sample with method 2

2.4.2 回收率及精密度

由表3和表4可以看出，4種抗氧化劑的平均回收率在95.06%～104.31%之間，RSD為0.1%～2.1%。表明該方法具有很好的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果符合GB/T 27404—2008的要求，可用于堅(jiān)果炒貨中4種抗氧化劑含量的測(cè)定。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用試驗(yàn)所建立的方法對(duì)開(kāi)心果、油炸花生和蘭花豆等共計(jì)24批次的樣品中BHA、BHT、TBHQ、PG 4種抗氧化劑含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表5—表7。結(jié)果表明：實(shí)際樣品中4種抗氧化劑檢測(cè)結(jié)果均小于GB 2760—2014中規(guī)定的最大使用量。

表2 4種抗氧化劑的線性方程、R、LOD和LOQTable 2 Linear equations, value of R, LOD and LOQ of the four antioxidants

表3 開(kāi)心果中4種抗氧化劑的平均回收 率和RSD (n=7)Table 3 Average recoveries and RSD of the four antioxidants in pistachio (n=7)

表4 油炸花生中4種抗氧化劑的平均回收率 和RSD (n=7)Table 4 Average recoveries and RSD of the four antioxidants in fried peanuts (n=7)

表5 開(kāi)心果中抗氧化劑含量Table 5 The antioxidant content in pistachio sample

表6 油炸花生中抗氧化劑含量Table 6 The antioxidant content in fried peanuts sample

表7 油炸蘭花豆中抗氧化劑含量Table 7 The antioxidant content in deep-fried orchid beans sample

3 結(jié)論

利用超高效液相色譜儀確立一種快速測(cè)定堅(jiān)果炒貨中4種抗氧化劑含量的方法，通過(guò)對(duì)比樣品前處理的2種方法表明：GB 5009.32—2016和方法二中PG和TBHQ都有很好的響應(yīng)，但是國(guó)標(biāo)法中BHA和BHT的響應(yīng)都明顯低于方法二，且BHT的響應(yīng)為0，而在方法二中響應(yīng)良好。同時(shí)方法二前處理無(wú)須SPE柱，檢出限、定量限低。與國(guó)標(biāo)法相比，UHPLC法具有快捷高效、低成本、靈敏度高、回收率好等明顯優(yōu)勢(shì)，可用于大批量地檢測(cè)堅(jiān)果炒貨中4種抗氧化劑的含量。實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果表明堅(jiān)果炒貨中4種抗氧化劑超出最大使用量的風(fēng)險(xiǎn)較低。后期研究中可擴(kuò)大實(shí)際樣本范圍及數(shù)量，以建立起有效的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。